石河子墾區(qū)集約化奶牛場子宮炎主要病原菌的分離鑒定

劉長彬,盧春霞,羅小玲，侯扶琴,姜志濤,陳紅莉

(1. 新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，新疆 石河子 832000； 2. 新疆西部牧業(yè)股份有限公司，新疆 石河子 832002；3.新疆農(nóng)墾科學(xué)院分析測試中心，新疆 石河子 832000)

【研究意義】奶牛子宮炎(Endometritis)是一種奶牛常見、多發(fā)性疾病，給奶牛生產(chǎn)上帶來很大的經(jīng)濟(jì)損失，常發(fā)生于產(chǎn)犢后和配種期。由于產(chǎn)犢后和配種期子宮頸口開張，容易受到致病菌的侵襲，而引起子宮內(nèi)膜炎癥。另外，該病的發(fā)病率隨著飼養(yǎng)管理變化而變化，一般情況下，飼養(yǎng)管理?xiàng)l件差的牛場子宮炎發(fā)病率高于飼養(yǎng)管理規(guī)范的牛場?！厩叭搜芯炕A(chǔ)】集約化奶牛場子宮炎的發(fā)病率一般是10 %～30 %，個(gè)別牛場可以達(dá)到40 %，甚至60 %～70 %[1-4]。研究表明，引起奶牛子宮炎的因素很多，歸納起來主要是由細(xì)菌、真菌和病毒等致病菌引起的感染。其中，奶牛子宮炎大多是由細(xì)菌感染而引起的。奶牛子宮炎是奶牛常見多發(fā)性疾病，長期的濫用抗生素導(dǎo)致大量的耐藥菌株的出現(xiàn)，給治愈奶牛子宮炎的工作帶了巨大障礙，為奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。由于奶牛子宮炎病原菌分布具有一定區(qū)域特征[5]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】為深入了解石河子墾區(qū)集約化牛場奶牛子宮炎主要致病菌分布和感染情況，制定相應(yīng)的應(yīng)對(duì)治療措施，能夠起到奶牛養(yǎng)殖過程中節(jié)約成本，提高效益的目的。2014年12月至2016年3月，對(duì)石河子墾區(qū)4個(gè)集約化奶牛場的103頭患有子宮炎的奶牛進(jìn)行取樣研究，子宮內(nèi)取樣206份，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定。以便能為石河子墾區(qū)防控奶牛子宮炎提供數(shù)據(jù)支持和參考價(jià)值[6]。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過對(duì)石河子墾區(qū)規(guī)?；B(yǎng)殖的奶牛采集的樣本進(jìn)行分離、鑒定，研究石河子墾區(qū)集約化奶牛場子宮炎的發(fā)病情況，根據(jù)病原菌的鑒定了解子宮炎的感染情況和類別，為石河子墾區(qū)奶牛子宮炎的治療提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

奶牛由石河子墾區(qū)規(guī)?；鯝場、B場、C場和D場提供，4個(gè)牛場根據(jù)子宮炎發(fā)病情況，共計(jì)采集樣本數(shù)103頭，采集樣本數(shù)206份。

1.2 采樣器具及儀器設(shè)備

子宮內(nèi)取樣器(專利號(hào)：ZL201420335941.6)，該取樣器包括滅菌硬塑料外套和滅菌軟塑料外套；VITEK-2全自動(dòng)生化檢定儀；精控恒溫培養(yǎng)箱；經(jīng)滅菌的EP管；滅菌生理鹽水。

1.3 細(xì)菌培養(yǎng)基

按配制說明配制普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基，購自杭州微生物試劑有限公司。

制法：將準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基，加蒸餾水1000 mL，經(jīng)120 ℃，滅菌15 min。待冷卻至45～50 ℃，加入綿羊鮮血5～10 mL，搖勻倒平板，放入無菌培養(yǎng)箱，備用。

1.4 采樣

經(jīng)過育種員確診或配種超過3次以上沒有妊娠的奶牛視為患有子宮炎的奶牛，將奶牛引入保定架，站立保定，先用0.3 %的K2MnO4消毒后驅(qū)及陰部，然后將無菌的子宮內(nèi)取樣器，伸入陰道內(nèi)，通過直腸把握法將取樣器送入子宮內(nèi)，盡量使取樣器的取樣球貼合子宮內(nèi)膜，輕輕刮下內(nèi)膜后，將取樣器輕輕取出至陰門處，助手將準(zhǔn)備好的無菌EP管打開，將取樣頭迅速放入EP管，劇烈搖晃數(shù)次后，將EP管蓋好蓋子放置于泡沫盒內(nèi)(放冰袋)，準(zhǔn)備采集下一份樣本。先采集一側(cè)子宮角內(nèi)的樣本，再采集另一側(cè)子宮角內(nèi)的樣本。待樣本采集完后，送入實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。在采樣過程中盡量避免交叉污染，保證樣本的準(zhǔn)確性。

1.5 細(xì)菌的分離培養(yǎng)及染色鏡檢

當(dāng)天采樣結(jié)束，立即將樣本帶回實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。將所有樣本外部消毒后放入無菌操作臺(tái)，用滅菌環(huán)或滅菌棉簽，粘取樣本分別均勻涂布于事先準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基平板。按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)。

將分離出的細(xì)菌先進(jìn)行染色進(jìn)行革蘭氏染色，并在油鏡下檢查，鑒定細(xì)菌屬于哪一類菌屬。

生化鑒定：VITEK-2全自動(dòng)生化檢定儀的使用程序進(jìn)行。其儀器設(shè)備工作原理是根據(jù)微生物學(xué)不同生化表型特性，運(yùn)用數(shù)值分類原理對(duì)細(xì)菌的生化反應(yīng)的表型特征，進(jìn)行系統(tǒng)綜合分析得到細(xì)菌的種、型及亞種、亞型等[5,7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 采集樣本的細(xì)菌分離鑒定

對(duì)103頭牛206份樣本子宮內(nèi)分泌物進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定，從206份樣本中檢出8種408個(gè)菌株。葡萄球菌占48.53 %(198/408)；鏈球菌占25.49 %(104/408)；大腸桿菌占20.83 %(85/408)。導(dǎo)致奶牛子宮炎病菌的分布以葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌為主，所占比例高達(dá)94.85 %(表1)。

2.2 致病菌感染情況

從表2可以看出，單一致病菌引起的子宮炎較少，大多數(shù)的奶牛子宮炎都是有2種以上致病菌引起，有的甚至3種以上。從分離結(jié)果可以看出奶牛子宮炎混合感染的情況較為嚴(yán)重。

表1 奶牛子宮炎主要致病菌分離鑒定結(jié)果

Table 1 Isolation and identification of the main uterine pathogenic bacteria of cow

致病菌名稱 The pathogenic bacteria菌株數(shù)Number of strains所占百分比(%)Percent合計(jì)(%)Total金黃色葡萄球菌11227.4548.53表皮葡萄球菌8621.08無乳鏈球菌338.0925.49化膿鏈球菌5012.25乳房鏈球菌215.15大腸桿菌8520.8320.83變形桿菌133.193.19沙門桿菌81.961.96總計(jì)408100100

表2 奶牛子宮炎致病菌感染情況

2.3 微生物生化鑒定

根據(jù)病原菌染色、鏡檢形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，將其分為3類：革蘭氏陽性菌G+、革蘭氏陰性菌G- 和鏈球菌。依據(jù)參閱文獻(xiàn)[8-11]綜合判斷各類致病菌所需要做的生化鑒定指標(biāo)(表3)。病原菌的最終結(jié)果，依據(jù)菌落特征、染色鏡檢、形態(tài)特征和生化鑒定結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)定[12]。

3 討 論

感染奶牛子宮炎的病原菌較為復(fù)雜，不同地域、不同季節(jié)以及不同感染階段所分離到的病原微生物的種類和比例同樣存在差異。在黑龍江地區(qū)分離到的致病菌主要有葡萄球菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、鏈球菌、棒狀化膿桿菌、沙門氏菌等；吉林地區(qū)分離到金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、化膿鏈球菌、獸疫鏈球菌、變形桿菌、肺炎球菌、類產(chǎn)堿桿菌、表皮及腐生葡萄球菌、腎棒狀桿菌、蠟樣芽孢桿菌、枯草桿菌等；蘭州地域分離到化膿鏈球菌、大腸桿菌、乳鏈球菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌等。也有報(bào)道認(rèn)為奶牛子宮炎由非感染性因素引起[13]。國外研究者報(bào)道認(rèn)為奶牛子宮炎與隱秘桿菌屬細(xì)菌感染有關(guān)[14]。Donofrio and Fábián認(rèn)為牛皰疹病毒亦可引起牛的子宮炎[15-16]。筆者分離到石河子墾區(qū)奶牛子宮炎主要致病有葡萄球菌、大腸桿菌、鏈球菌和蠟樣芽胞桿菌。在本批次病原菌的分離中，以葡萄球菌和大腸桿菌檢出率較高。這與一些省份的研究報(bào)道不盡一致，主要與地域、環(huán)境、用藥以及其他因素造成。

表3 各類菌種所需做的生化鑒定試驗(yàn)[12]

因此，做好本地域內(nèi)的病原菌的分離鑒定對(duì)生產(chǎn)意義重大。

從奶牛子宮炎患牛子宮采集的樣本，進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定來看，石河子墾區(qū)奶牛子宮炎以混合感染為主。這與趙紅瓊等[17]、黃璐等[18]、張義冉等[19]、陳星等[20]、郭素風(fēng)等[21]所報(bào)道的奶牛子宮炎以單一菌種感染為主的結(jié)果相反。但與歐肇林等[22]對(duì)百色市30頭患有子宮炎的奶牛進(jìn)行了細(xì)菌的分離鑒定，發(fā)現(xiàn)百色市奶牛子宮炎以葡萄球菌和鏈球菌混合感染病例較多占總感染率的63.2 %的結(jié)果一致。與王國卿[23]對(duì)哈爾濱市養(yǎng)殖小區(qū)采集子宮內(nèi)樣本，進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定，得出結(jié)論為本地奶牛子宮炎混合感染占90 %，單一感染占10 %的結(jié)果一致。出現(xiàn)這樣的結(jié)果可能與不同地域微生物的區(qū)域分布、季節(jié)環(huán)境和抗生素使用習(xí)慣等因素有關(guān)。另一方面可能與采集樣本的這4個(gè)牛場建場早，奶牛的飼養(yǎng)周期長有關(guān)。

表4 菌株的生化試驗(yàn)

注：㈩：產(chǎn)酸產(chǎn)氣；+：產(chǎn)酸；㈩/-：不確定；-：不產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。

奶牛子宮炎致病菌在地域分布上有所不同，選擇適宜的藥物進(jìn)行治療可以起到事半功倍的療效。除此之外，奶牛產(chǎn)后一段時(shí)間體況處于負(fù)營養(yǎng)階段，機(jī)體抵抗力差、免疫力低下，環(huán)境中的病原微生物就會(huì)“趁虛而入”侵入動(dòng)物機(jī)體而引發(fā)相應(yīng)的疾病。因此，除了采取必要的措施進(jìn)行積極治療和預(yù)防之外，還應(yīng)加強(qiáng)奶牛產(chǎn)后保健及飼養(yǎng)管理工作。同時(shí)，扎實(shí)做好本地區(qū)奶牛子宮炎主要致病菌的分離鑒定工作，對(duì)預(yù)防和治療奶牛子宮炎具有重要意義。

4 結(jié) 論

通過對(duì)石河子墾區(qū)規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場奶牛子宮內(nèi)取樣，分離、鑒定引起奶牛主要致病菌的情況分析。在實(shí)驗(yàn)室共分離出8種病原菌408株，其中葡萄球菌198株(占48.53 %)、鏈球菌109株(占25.49 %)、大腸桿菌85株(占20.83 %)。從感染數(shù)據(jù)看，石河子墾區(qū)奶牛子宮炎以混合感染為主。