天山雪蓮sikP基因提高番茄類黃酮含量的研究

張 堯，李忠晴，張 麗，王愛英，祝建波

(石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832003)

【研究意義】對(duì)植物類黃酮分子調(diào)控深入研究發(fā)現(xiàn)，類黃酮可增強(qiáng)植物的抗逆性、改變花卉的顏色等多方面的作用[1]。通過將單個(gè)限制酶基因轉(zhuǎn)入薄荷、大豆和油菜中，對(duì)其次生代謝進(jìn)行調(diào)控，可提高他們的目標(biāo)產(chǎn)物的含量[2-3]。然而，復(fù)雜的植物次生代謝途徑需要大量酶的參與，而不是單個(gè)基因所能決定的?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來人們對(duì)轉(zhuǎn)錄因子深入研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)錄水平上，轉(zhuǎn)錄因子能夠協(xié)同調(diào)控特定代謝途徑的一系列相關(guān)酶的活性，從而提高途徑中相關(guān)基因的表達(dá)量，因此轉(zhuǎn)錄因子在多數(shù)性狀調(diào)控途徑中具備很大優(yōu)勢(shì)[4]。相關(guān)研究表明，MYB家族基因是高等植物中廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子，具備許多轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特征，根據(jù)含MYB-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(R1、R2、R3)數(shù)量的不同，分為R1、R2R3、R1R2R3 3種類型，其中R2R3類型在調(diào)控植物次生代謝過程中起到十分重要的作用。其中玉米P基因是在植物中最早被發(fā)現(xiàn)且功能被驗(yàn)證的R2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子，它通過調(diào)控CHS和DFR基因的表達(dá)來促進(jìn)玉米3-脫氧類黃酮的合成[5]。金治平等人從水母雪蓮愈傷組織中克隆了水母雪蓮MYB轉(zhuǎn)錄因子SmP,對(duì)氨基酸進(jìn)行同源分析發(fā)現(xiàn)SmP基因具有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域典型的特征，存在2個(gè)R2R3型MYB結(jié)構(gòu)域[6]。但該基因是否能夠調(diào)控類黃酮合成，并沒有進(jìn)行進(jìn)一步深入的研究。新疆地域遼闊，物種資源豐富，其中不乏特色的中藥材，天山雪蓮就是其中一種[7]。天山雪蓮中存在多種藥用成分，比如類黃酮、多糖類物質(zhì)和生物堿等[8-9]，其中類黃酮是新疆天山雪蓮最主要的藥用成分[10]。據(jù)研究表明天山雪蓮總黃酮的抗氧化活性高于水母雪蓮和雪兔子[11]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本文將天山雪蓮R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子sikP基因的表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化番茄，并通過分子手段進(jìn)行鑒定獲得轉(zhuǎn)基因番茄。【擬解決的關(guān)鍵問題】對(duì)其類黃酮含量進(jìn)行初步檢測(cè)，已達(dá)到對(duì)其功能進(jìn)行驗(yàn)證的目的。

1 材料與方法

1.1 供試材料

番茄(亞心87-5)保存于新疆石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。農(nóng)桿菌(GV3101)、植物過表達(dá)載體pBI121-sikP來自于新疆石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室Taq酶、RNA反轉(zhuǎn)錄酶、Trizol提取液、植物激素和抗生素等均來自大連寶生物生物工程有限公司；配制MS培養(yǎng)基的各種試劑盒其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化番茄 首先在無菌超凈工作臺(tái)中將番茄種子放入10 %次氯酸鈉中浸泡10 min，期間不間斷的搖晃，再用無菌水進(jìn)行5次沖洗，再將番茄種子傾倒無菌濾紙上進(jìn)行水分吸干，均勻接種到1/2MS培養(yǎng)基上，用封口膜密封后進(jìn)行3 d黑暗條件培養(yǎng)，待番茄種子露白后進(jìn)行正常的光照培養(yǎng)，1周后，切取番茄下胚軸作為外植體放置在培養(yǎng)基(MS+1.5 mg/L 6-BA+0.15 mg/L IAA)上暗培養(yǎng)2 d后，將攜帶有PBI121-sikP載體的農(nóng)桿菌侵染預(yù)培養(yǎng)2 d的番茄下胚軸[10-11]，侵染時(shí)間為10～15 min。將侵染過的下胚軸轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基( MS+1.5 mg/L 6-BA+0.15 mg/L IAA+100 mg/L Kan+400 mg/L Cef)上培養(yǎng)，每14 d換1次培養(yǎng)基。定期進(jìn)行觀察待分化出的小芽長(zhǎng)至2～3 cm后，將其切下并轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(1/2 MS+0.5 mg/L IAA+100 mg/L Kan+400 mg/L Cef)中繼續(xù)進(jìn)行抗性篩選，最終獲得抗性苗。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因番茄的PCR和RT-PCR鑒定 首先提取抗性番茄苗DNA，并以未轉(zhuǎn)化的番茄作為對(duì)照進(jìn)行PCR擴(kuò)增[12]。然后提取PCR陽(yáng)性的番茄植株的RNA[13]，同樣以未轉(zhuǎn)化的番茄作為對(duì)照在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下進(jìn)行cDNA 的合成，再進(jìn)行PCR的擴(kuò)增。將通過篩選和鑒定的陽(yáng)性番茄植株移栽至深18 cm、直徑20 cm的花盆中，在培養(yǎng)室正常條件下生長(zhǎng)。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因番茄總黃酮含量的測(cè)定[14]①樣品溶液的制備。待測(cè)樣品采用超聲波法進(jìn)行樣品溶液的制備，精確稱取3 g番茄葉片，將其放入錐形瓶中，加入55 mL 95 %的乙醇，將其放入水溫為50 ℃的超聲波清洗器進(jìn)行20 min處理后，將其轉(zhuǎn)移到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器內(nèi)進(jìn)行濃縮處理至5 mL即為番茄樣品溶液。②對(duì)照品溶液的制備。精確稱取20 mg對(duì)照品蘆丁放入100 mL的容量瓶?jī)?nèi)，加入70 %的乙醇進(jìn)行溶解后定容至0.2 g/L，作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液。③最大吸收波長(zhǎng)的確定。取適量的樣品溶液，加入5 %亞硝酸鈉溶液，通過硝酸鋁進(jìn)行顯色，再進(jìn)行420～700 nm波長(zhǎng)掃描，最終進(jìn)行最大吸收波長(zhǎng)的確定。④標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。取對(duì)照品蘆丁儲(chǔ)備溶液通過70 %的乙醇稀釋成0、0.020、0.040、0.060、0.080、0.100、0.120、0.140 g/L的溶液后，在每個(gè)稀釋液中分別取1 mL注入試管內(nèi)，在每個(gè)試管中加入1 mL的70 %的乙醇，再向每個(gè)試管中加入5 %的NaNO2溶液0.5 mL后進(jìn)行混勻并靜置6 min，再向各試管中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10 %的Al(NO3)3溶液0.5 mL，混勻后在靜置6 min，再次向各試管中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4 %的NaOH溶液2 mL，混用后靜置15 min。最后通過紫外分光光度器進(jìn)行510 nm波長(zhǎng)吸光值的測(cè)定，每個(gè)樣品3次重復(fù)。⑤番茄樣品溶液總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定。將1 mL樣品溶液放入試管內(nèi)，加入φ=70 %的乙醇1 mL及0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5﹪的 NaNO2溶液，混勻，6 min后加入0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 %的 Al(NO3)3溶液，混勻后在靜置6 min，再次向各試管中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4 %的NaOH溶液2 mL，混用后靜置15 min。最后通過紫外分光光度器進(jìn)行510 nm波長(zhǎng)吸光值的測(cè)定，每個(gè)樣品3次重復(fù)。計(jì)算番茄葉片類黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

計(jì)算公式：x=[C×V1×V2/V3]×100 %/m，式中，x為樣品中類黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)；C為通過回歸方程計(jì)算的樣品溶液質(zhì)量濃度，(g/L)；V1為樣液體積，mL；V2為樣品定容體積，mL；V3為通過顯色反應(yīng)測(cè)定的樣品溶液的體積，mL；m為樣品量，mg[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因番茄植株的獲得及分子鑒定

利用含有pBI121-sikP的農(nóng)桿菌GV3101浸染番茄下胚軸15～20 d后，下胚軸兩端傷口處能分化出淡黃色愈傷(圖1A、B)，繼續(xù)培養(yǎng)能長(zhǎng)出綠色芽點(diǎn)，并再生出小芽( 圖1C)。將小芽切下轉(zhuǎn)到1/2MS生根培養(yǎng)基上，20～30 d 后長(zhǎng)出較發(fā)達(dá)的根系( 圖1D)，對(duì)無菌苗進(jìn)行PCR(圖2)和RT-PCR( 圖3)檢測(cè)，說明sikP基因已整合到番茄體內(nèi)并能夠轉(zhuǎn)錄。將鑒定為陽(yáng)性的無菌苗移栽至深18 cm、直徑20 cm的花盆中，在培養(yǎng)室中生長(zhǎng)(圖4)作為實(shí)驗(yàn)材料。

A：番茄下胚軸；B：抗性芽的再生；C：再生芽生根；D：再生植株的移栽圖1 轉(zhuǎn)基因番茄再生及抗性植株篩選Fig.1 Regeneration of transgenic tomato and selection of resistant plantlet

2.2 轉(zhuǎn)基因番茄和總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 將稀釋不同濃度的蘆丁溶液通過紫外分光光度器進(jìn)行510 nm波長(zhǎng)吸光值的測(cè)定，以蘆丁的不同濃度作為橫坐標(biāo)，以檢測(cè)的不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值A(chǔ)作為縱坐標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。求得回歸方程為：C=115.72OD510+ 0.0938，相關(guān)系數(shù)R2= 0.9959，其中，C為黃酮的濃度，單位為g/L(圖5)。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性關(guān)系。

M: DNA marker Ⅲ；1：陽(yáng)性對(duì)照；2：陰性對(duì)照；3～7：轉(zhuǎn)基因番茄圖2 轉(zhuǎn)基因番茄sikP基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR results of sikP in transgenic tomato

M: DNA marker Ⅲ；1～5：轉(zhuǎn)基因番茄；6：陰性對(duì)照；7：陽(yáng)性對(duì)照?qǐng)D3 轉(zhuǎn)基因番茄sikP基因RT-PCR擴(kuò)增Fig.3 RT-PCR results of sikP in transgenic tomato

圖4 轉(zhuǎn)sikP基因番茄Fig.4 Transgenic tomato of sikP gene

2.2.2 最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定 取適量的樣品溶液，加入5 %亞硝酸鈉溶液，通過硝酸鋁進(jìn)行顯色，再進(jìn)行420～700 nm波長(zhǎng)掃描，最終進(jìn)行最大吸收波長(zhǎng)的確定。番茄樣品溶液通過通過硝酸鋁進(jìn)行顯色后再進(jìn)行420～700 nm波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示在510 nm波長(zhǎng)時(shí)吸光值最大，為此選擇510 nm波長(zhǎng)進(jìn)行后續(xù)吸光度值的測(cè)定。

2.2.3 番茄總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定 對(duì)轉(zhuǎn)基因番茄和對(duì)照組番茄的樣品提取液經(jīng)過顯色反應(yīng)后，通過紫外分光光度器進(jìn)行510 nm波長(zhǎng)吸光值的測(cè)定，結(jié)果表明：和對(duì)照組相比轉(zhuǎn)基因番茄總黃酮質(zhì)量分析明顯提高，轉(zhuǎn)基因組是對(duì)照組的5.4倍(表1)。

3 討 論

一般來說轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子通過調(diào)控次生代謝來調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，通過在類黃酮代謝途徑的研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥、矮牽牛、玉米和水稻等植物中具有多個(gè)調(diào)控活性的轉(zhuǎn)錄因子[15]。目前根據(jù)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的特點(diǎn)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子的分類，分為7大家族：b-HLH( Basic-helix-loop-helix)家族、WRKY家族、MYB家族、WD40家族、homeodomain家族、WIP家族和 bMADS家族[16-18]，與類黃酮代謝相關(guān)的主要是MYB家族、bHLH家族和WD40家族的轉(zhuǎn)錄因子。這3種轉(zhuǎn)錄因子一般是相互作用的，它們通過形成MYB-bHLH-WD40復(fù)合體的形式來調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)來調(diào)控類黃酮代謝通路。比如MYB家族轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)節(jié) WD40和 bHLH的表達(dá)來調(diào)控調(diào)控類黃酮代謝通路。但是某些MYB轉(zhuǎn)錄因子通過單獨(dú)調(diào)節(jié)類黃酮代謝通路上的節(jié)點(diǎn)基因的表達(dá)來促進(jìn)類黃酮的合成[19-24]。與類黃酮合成相關(guān)的MYB家族轉(zhuǎn)錄因子最早被發(fā)現(xiàn)的植物是玉米，玉米P基因是MYB家族轉(zhuǎn)錄因子，該基因通過在墨西哥甜玉米中的過表達(dá)試驗(yàn)，表明P基因通過調(diào)節(jié)CHS和DFR基因的表達(dá)來調(diào)控類黃酮的合成[25-27]。截止到目前，人們從植物中已經(jīng)克隆了100多個(gè)MYB家族轉(zhuǎn)錄因子，并進(jìn)行了功能的分析。結(jié)果顯示，與類黃酮合成相關(guān)的MYB家族轉(zhuǎn)錄因子蛋白并不都是轉(zhuǎn)錄激活因子，也存在負(fù)調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子從而抑制相關(guān)基因的表達(dá)。例如，人們?cè)跀M南芥中克隆的R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白AtMYBL2和R2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子AtMYB60，可有效的促進(jìn)花青素的合成[28-30]。而在銀杏中克隆的MYB轉(zhuǎn)錄因子GbMYBF2，對(duì)其進(jìn)行擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化和功能分析發(fā)現(xiàn)該類是負(fù)調(diào)控類黃酮的合成[31]。

圖5 類黃酮測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of flavonoids determination

圖6 天山雪蓮類黃酮提取液紫外掃描圖Fig.6 Scanning curve of extractive from Sasussured involucrata by U.V

樣品Samples吸光度OD510質(zhì)量濃度(g/L)Conter.of flaonoids質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)Contentof flaonoids質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均值(%)MeanCK(對(duì)照)0.0170.0390.0282.06104.60673.33400.00340.00770.00560.0056sikP(轉(zhuǎn)基因)0.1310.1950.14415.253122.659216.75750.02540.03780.02790.0304

本文所研究的sikP基因?qū)儆赗2R3亞家族的MYB轉(zhuǎn)錄因子，和水母雪蓮SmP基因結(jié)構(gòu)類似，那么sikP基因是否具有調(diào)控類黃酮次生代謝途徑的作用呢。是轉(zhuǎn)錄激活因子還是負(fù)調(diào)控類黃酮的合成呢。因此，通過對(duì)天山雪蓮sikP基因的植物過表達(dá)載體pBI121-sikP，經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)，遺傳轉(zhuǎn)化番茄，再采用分子手段進(jìn)行鑒定，獲得轉(zhuǎn)基因番茄，最后對(duì)其類黃酮含量進(jìn)行初步檢測(cè)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組番茄相比轉(zhuǎn)基因番茄類黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著提高，轉(zhuǎn)基因番茄類黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)是對(duì)照組番茄的5.4倍，這將為以后對(duì)實(shí)現(xiàn)天山雪蓮類黃酮物質(zhì)人工合成研究奠定基礎(chǔ)，是解決天山雪蓮資源匱乏的有效方法之一。