17種植物提取物對(duì)大豆疫霉的抑制作用

◎ 許 敏，馬林昊，劉凡巧，高 劍，馬冠華

（西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，重慶 400715）

大豆疫霉根腐病于1989年首次在中國(guó)東北地區(qū)發(fā)現(xiàn)并于1991年被公開(kāi)報(bào)道[1]，該病害對(duì)大豆生產(chǎn)具有毀滅性損害[2]。目前，該病已經(jīng)上升為大豆主產(chǎn)區(qū)黑龍江省大豆生產(chǎn)中對(duì)產(chǎn)量為害最大的病害。大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）可侵染大豆生長(zhǎng)發(fā)育的各階段，尤其是種子和幼苗階段，會(huì)導(dǎo)致種子腐爛，幼苗根、莖基部腐爛或出現(xiàn)水浸狀或立枯并變紅褐色，最終引起植株萎蔫、死亡[3-4]。

植物源農(nóng)藥是來(lái)源于植物體的農(nóng)藥，其有效成分通常不是單一化合物，而是植物有機(jī)體中的多種甚至大部分有機(jī)物質(zhì)[5]，具有低毒、低殘留、環(huán)保友好、不破壞生態(tài)環(huán)境、靶標(biāo)有害生物對(duì)其不易產(chǎn)生抗藥性、對(duì)非靶標(biāo)生物安全、活性成分的作用方式特異等特點(diǎn)，在有機(jī)農(nóng)業(yè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[6-7]，目前，已經(jīng)有多種植物源活性成分的農(nóng)藥取得登記并成功應(yīng)用，如2.5%魚(yú)藤酮乳油、0.5%楝素乳油等[6]。

甲霜靈是有效防治大豆疫霉根腐病的殺菌劑之一，但由于甲霜靈作用位點(diǎn)單一，大豆疫霉菌易對(duì)其產(chǎn)生抗藥性[8]。筆者利用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了包括青蒿琥酯、百里酚、肉桂醛、8-甲氧基補(bǔ)骨酯素在內(nèi)的17種植物提取物對(duì)大豆疫霉的作用效果，來(lái)尋找可代替甲霜靈等化學(xué)藥劑的植物提取物。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

大豆疫霉野生型菌株P(guān)7076，抗甲霜靈突變體Me3-7-3（2 739.81倍 ）、Me9-7-2（4 527.93倍 ）、Me7-3（9 764.4倍），抗丁吡嗎啉突變體Py4-7-2（115.77倍）、Py4-7-3（500.24倍），由西南大學(xué)植物生態(tài)病理研究所提供。

1.2 供試植物提取物、試劑及材料

青蒿琥酯（99%）、百里酚（≥99%）、肉桂醛（99%）、8-甲氧基補(bǔ)骨酯素（99%），購(gòu)自上海泰坦科技股份有限公司。5,5-二烯丙基-2,2’二苯基二醇（97%）、β-細(xì)辛醚（≥95%）、乙酸丁香酚酯（≥98%）、黃獨(dú)素B（≥95%）、蛇床子素（≥98%）、香芹酚（99%）、異丁香酚（97%）、4-異丙基苯甲醛（98%）、1,2,3-三苯酚（99%）、楊梅素（97%），購(gòu)自北京伊諾凱科技有限公司。黃藤素（97%）、α-細(xì)辛醚（99%），購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。黃酮（99%），購(gòu)自百靈威科技有限公司。V8蔬菜汁，市售，由美國(guó)Campbell公司生產(chǎn)。

1.3 母液的制備

取0.1 g或100 μL植物提取物溶于適量的二甲基亞砜中，配制成104μg/mL母液，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 培養(yǎng)基的制備

10%V8培養(yǎng)基：100 mL V8蔬菜汁、900 mL ddH2O、10 g CaCO3、20 g瓊脂。115 ℃高壓滅菌21 min。

1.5 植物提取物對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)抑制活性的測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法[9]。用無(wú)菌水將104μg/mL母液稀釋成適宜的濃度，在培養(yǎng)基中加入一定量的藥劑，配成相應(yīng)濃度的含藥培養(yǎng)基，充分搖勻，倒入直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中，每皿10 mL，以等量無(wú)菌水配成無(wú)藥培養(yǎng)基平板作為空白對(duì)照，每個(gè)濃度3次重復(fù)。將供試菌株于25 ℃下黑暗培養(yǎng)4 d，用直徑為5 mm的打孔器在靠近菌落邊緣的同一圓周上打取菌餅，然后將菌餅菌絲面朝下接種到各平板中央，并在25 ℃下黑暗培養(yǎng)4 d后，用十字交叉法測(cè)定各個(gè)處理的菌落生長(zhǎng)直徑。按照下面公式求出各個(gè)藥劑濃度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率。

最后將藥劑的濃度轉(zhuǎn)化為對(duì)數(shù)（x），抑制率轉(zhuǎn)化為機(jī)率值（y），根據(jù)x與y的線性關(guān)系求出毒力回歸曲線方程y=a+bx、相關(guān)系數(shù)R、有效抑制中濃度EC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 17種植物提取物對(duì)大豆疫霉野生型菌株的抑制作用

17種植物提取物對(duì)大豆疫霉野生型菌株P(guān)7076的菌絲生長(zhǎng)均有一定的抑制作用，厚樸酚的抑制作用最佳，其EC50值為17.032 5 μg/mL。其中，EC50值在50 μg/mL以下的有厚樸酚、香芹酚、黃藤素、百里酚和1,2,3-三苯酚5種；EC50值在50～100 μg/mL的有異丁香酚、肉桂醛、黃酮、青蒿琥酯、黃獨(dú)素B和乙酸丁香酚酯6種，EC50值在100～200 μg/mL的有楊梅素、α-細(xì)辛醚、蛇床子素、8-甲氧基補(bǔ)骨酯素和β-細(xì)辛醚5種；17種植物提取物中，效果最差的是枯茗醛，其EC50值為201.803 0 μg/mL，見(jiàn)表1。

表1 17種植物提取物對(duì)大豆疫霉野生型菌株P(guān)7076菌絲生長(zhǎng)的抑制作用表

2.2 17種植物提取物對(duì)大豆疫霉抗甲霜靈突變體的抑制作用

厚樸酚對(duì)抗甲霜靈突變體菌絲生長(zhǎng)的抑制作用最佳，3株抗性菌株的EC50值分別為14.879 2、17.294 0和14.427 7 μg/mL，其中厚樸酚、香芹酚、青蒿琥酯、黃酮、黃藤素、百里酚、1,2,3-三苯酚、異丁香酚、8-甲氧基補(bǔ)骨酯素、肉桂醛的EC50值在10～65 μg/mL，乙酸丁香酚酯、楊梅素、黃獨(dú)素B、α-細(xì)辛醚、蛇床子素、β-細(xì)辛醚的EC50值在95～160 μg/mL，抑制效果較好；效果最差的是枯茗醛，3株抗性菌株的EC50值分別為505.779 7、402.447 6、326.589 9 μg/mL。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析表明，17種植物提取物對(duì)3株抗甲霜靈突變體的抑制作用無(wú)顯著性差異，即抑制作用與抗性倍數(shù)無(wú)相關(guān)性，見(jiàn)表2。

表2 17種植物提取物對(duì)大豆疫霉抗甲霜靈突變體的抑制作用表

2.3 17種植物提取物對(duì)大豆疫霉抗丁吡嗎啉突變體的抑制作用

厚樸酚對(duì)抗丁吡嗎啉突變體菌絲生長(zhǎng)的抑制作用最佳，2株抗性菌株的EC50值分別為13.941 9、14.785 4 μg/mL，其中厚樸酚、香芹酚、青蒿琥酯、黃酮、黃藤素、百里酚、1,2,3-三苯酚、異丁香酚、8-甲氧基補(bǔ)骨酯素、肉桂醛的EC50值在10～50 μg/mL，乙酸丁香酚酯、楊梅素、黃獨(dú)素B、α-細(xì)辛醚、蛇床子素、β-細(xì)辛醚、枯茗醛的EC50值在90～190 μg/mL，抑制效果都較好。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析表明，17種植物提取物對(duì)2株抗丁吡嗎啉突變體的抑制作用無(wú)顯著性差異，即抑制作用與抗性倍數(shù)無(wú)相關(guān)性，見(jiàn)表3。

表3 17種植物提取物對(duì)大豆疫霉抗丁吡嗎啉突變體的抑制作用表

2.4 野生型菌株與抗性菌株之間抑制作用的比較

通過(guò)比較17種植物提取物對(duì)3種類(lèi)型的大豆疫霉菌株之間的抑制作用發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯、黃酮和8-甲氧基補(bǔ)骨酯素3種提取物對(duì)野生型菌株P(guān)7076的EC50值顯著高于抗性菌株的EC50值，即這3種提取物對(duì)抗性菌株的抑制作用更好（表4），其余14種植物提取物對(duì)野生型菌株和兩種藥劑的抗性菌株抑制作用無(wú)明顯差異。

表4 野生型菌株與抗性菌株之間抑制作用的比較表

3 討論

植物是生物活性化合物的巨大天然寶庫(kù)，植物中產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物超過(guò)40萬(wàn)種，其中許多次生化學(xué)物質(zhì)具有殺蟲(chóng)或抑菌的生物活性，在農(nóng)業(yè)上有著重要的研究?jī)r(jià)值[10]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)植物提取物對(duì)病原菌抑制作用的研究非?；钴S[11-12]。有的植物提取物甚至可以直接用于一些農(nóng)作物病害的防治[13]。研究發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯、蛇床子素和厚樸酚對(duì)荔枝霜疫霉菌均有用于開(kāi)發(fā)防治荔枝霜疫霉的植物源農(nóng)藥的潛力，對(duì)荔枝霜疫霉菌菌絲生長(zhǎng)抑制作用中，厚補(bǔ)酚的EC50值約為31 μg/mL，青蒿琥酯的EC50值約為133 μg/mL，蛇床子素的EC50值約為138 μg/mL[14]；本試驗(yàn)對(duì)大豆疫菌絲生長(zhǎng)的抑制測(cè)定發(fā)現(xiàn)，厚補(bǔ)酚的EC50值約為15 μg/mL，青蒿琥酯的EC50值約為41 μg/mL，蛇床子素的EC50值約為120 μg/mL，說(shuō)明厚樸酚、青蒿琥酯和蛇床子素相較于荔枝霜疫霉對(duì)大豆疫霉的抑制效果更好。百里酚與香芹酚是同分異構(gòu)體，研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)褐腐菌的菌絲擴(kuò)展和孢子萌發(fā)均具有較好的抑制能力[15]，本試驗(yàn)中百里酚對(duì)大豆疫菌絲生長(zhǎng)的抑制作用的EC50值約為40 μg/mL，說(shuō)明百里酚對(duì)大豆疫霉也有較好的防治效果。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，除枯茗醛外的16種植物提取物對(duì)大豆疫霉野生型菌株和兩種藥劑的抗性菌株均有較好的抑制作用，其EC50值均低于200 μg/mL，對(duì)于3種類(lèi)型的菌株，抑制效果最好的是厚樸酚，EC50值約為15 μg/mL，其次是香芹酚，EC50值約為23 μg/mL，均低于常用藥劑霜霉威對(duì)大豆疫霉的菌絲生長(zhǎng)抑制作用的EC50值[16]，表明厚樸酚和香芹酚具有開(kāi)發(fā)為植物源農(nóng)藥的潛力。另外，青蒿琥酯、黃酮和8-甲氧基補(bǔ)骨酯素3種植物提取物對(duì)野生型菌株的EC50值顯著高于抗性菌株的EC50值，即這3種提取物對(duì)抗性菌株的抑制作用更好，是否由于抗藥突變體的突變位點(diǎn)與該植物提取物的作用位點(diǎn)一致還需要進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)測(cè)定了17種植物提取物對(duì)大豆疫霉的菌絲生長(zhǎng)的抑制效果，要全面評(píng)估這些植物提取物的開(kāi)發(fā)價(jià)值，還需要測(cè)定其對(duì)游動(dòng)孢子囊產(chǎn)量、卵孢子產(chǎn)量等方面的影響，更全面地說(shuō)明這些植物提取物的抑制作用。同時(shí)，目前雖然不少關(guān)于植物提取物的抑制作用研究報(bào)道，但大多數(shù)仍然停留在實(shí)驗(yàn)室水平，真正應(yīng)用于農(nóng)作物病害防治的比較少[17-20]。因此，還需要對(duì)這些植物提取物進(jìn)行田間應(yīng)用效果測(cè)試，以為植物源農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。