Th17/Treg、IL-17在慢性阻塞性肺疾病患者中的表達及與肺功能的相關性

張占強，吳春艷，方 彬，王美玲，?；燮G

(1. 河北省涿州市醫(yī)院，河北 涿州 072750；2. 河北省保定市第一中心醫(yī)院，河北 保定 071000)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是臨床上常見的呼吸系統(tǒng)疾病，近年來其發(fā)病率呈持續(xù)增長的趨勢[1]。COPD的病理基礎是氣道壁和肺實質的慢性炎癥及結構破壞，可表現(xiàn)為肺實質改變及外周血T淋巴細胞數(shù)量異常[2]。研究表明，輔助性T細胞17(Th17)及調節(jié)性T細胞(Treg)參與各種自身免疫性疾病和慢性感染性疾病中的免疫調節(jié)，在COPD發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用[3-4]。而白細胞介素-17(IL-17)是Th17細胞特異性分泌的細胞因子，可誘導機體組織損傷，并參與炎癥反應的發(fā)生發(fā)展[5]。本研究通過觀察慢性阻塞性肺疾病患者外周血淋巴細胞中Th17和Treg細胞含量及IL-17水平變化，并分析Th17、Treg及IL-17與肺功能指標的相關性，探討Th17、Treg及IL-17在COPD患者預后評估中的價值，以期為臨床防治提供依據。

1 臨床資料

1.1一般資料 選取2014年1月—2016年10月河北省涿州市醫(yī)院呼吸內科收治的COPD患者共184例作為COPD組，其中男118例，女66例，年齡36～81(63.28±10.16)歲。COPD穩(wěn)定期患者92例，COPD急性加重期(AECOPD)患者92例。COPD的診斷均符合中華醫(yī)學會呼吸病學分會慢性阻塞性肺疾病學組修訂的《慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013年修訂版)》[6]。排除合并有其他肺部疾病或感染者，合并有其他系統(tǒng)疾病如心、肝、腦、腎等嚴重功能障礙者，長期應用激素者，惡性腫瘤或預計生存期不到3個月者，近期手術、妊娠及哺乳期者。另選取同期我院健康體檢者95例作為對照組，男60例，女35例，年齡38～79(62.54±9.83)歲。各組性別、年齡及病史等基本資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，均具有可比性。

1.2主要儀器及試劑 美國Becton Dickinson公司的FACS Calibur流式細胞儀，流式抗體均購自美國Becton Dickinson公司。細胞刺激培養(yǎng)所需離子霉素、豆蔻酰佛波醇乙酯、莫能菌素購自美國ENZO Alexis-Biomol公司，胞內檢測所需固定破膜試劑盒及熒光定量PCR所需試劑購自美國Invitrogen公司，所需引物、探針由上海博亞生物技術公司合成。熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司(ABI 7500 Sequence Detection System)，酶標儀購自美國Bio-Rad公司(型號550)，低溫高速離心機(Beckman)。ELISA試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.3研究方法 比較各組外周血Th17、Treg、Th17/Treg、IL-17水平及肺功能指標情況，分析Th17、Treg、Th17/Treg、IL-17與肺功能指標的相關性，并應用ROC曲線評價Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17對AECOPD患者的診斷效能。

1.3.1外周血Th17及Treg細胞檢測 所有研究對象均于清晨空腹采集靜脈血3 mL，經肝素抗凝及加入等體積淋巴細胞分離液后1 500 r/min離心15 min，得到外周血單個核細胞(PBMC)懸液，鋪至24孔細胞培養(yǎng)板，并在RPMI-1640培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清。每孔加入豆蔻酰佛波醇乙酯2.5 μL(終濃度50 ng/mL)、離子霉素2 μL(終濃度1 μg/mL)及莫能菌素2 μL(終濃度10 μg/mL)吹打混勻，孵育4 h。加入抗人CD4單抗20 μL，室溫避光孵育20 min。再通過加入染色緩沖液2 mL及抗IL-17單抗20 μL，室溫孵育15 min，此后1 500 r/min離心10 min，棄上清，加入染色固定液1 mL，等待上流式細胞儀檢測。

1.3.2肺功能檢查 采用肺功能儀(Sensormedics)對所有研究對象行肺功能檢查，包括測定第1秒用力呼氣量(FEV1)、FEV1占預計值百分比(FEV1%)、用力肺活量(FVC)、FVC占預計值百分比(FVC%)及第1秒用力呼氣量占用力肺活量的百分比(FEV1/FVC)。目前臨床上以FEV1作為COPD診斷、分級和衡量預后的標準。

2 結 果

2.1COPD組與對照組外周血Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17水平比較 COPD組外周血Th17、Th17/Treg及IL-17水平均明顯高于對照組(P均<0.05),外周血Treg細胞含量明顯低于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 2組外周血Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17水平比較

2.2各組外周血Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17水平比較 AECOPD組和COPD穩(wěn)定期組外周血Th17、Th17/Treg及IL-17水平明顯高于對照組(P均<0.05)，且AECOPD組外周血Th17、Th17/Treg及IL-17水平明顯高于COPD穩(wěn)定期組(P均<0.05)。AECOPD組和COPD穩(wěn)定期組外周血Treg細胞含量均明顯低于對照組(P均<0.05)，且AECOPD組外周血Treg細胞含量明顯低于COPD穩(wěn)定期組(P<0.05)。見表2。

2.3各組肺功能指標比較 AECOPD組和COPD穩(wěn)定期組FEV1、FEV1%、FVC、FVC%、FEV1/FVC均明顯低于對照組(P均<0.05)；且AECOPD組FEV1、FEV1%、FVC%、FEV1/FVC均明顯低于COPD穩(wěn)定期組(P均<0.05)。見表3。

表2 各組外周血Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17水平比較

表3 各組肺功能指標比較

2.4外周血Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17與肺功能指標的相關性分析 Spearman相關性分析顯示，COPD患者外周血Th17、Th17/Treg及IL-17與FEV1、FEV1%、FVC、FVC%、FEV1/FVC均呈負相關(P均<0.05)；而COPD患者外周血Treg細胞與FEV1、FEV1%、FVC、FVC%、FEV1/FVC均呈正相關(P均<0.05)。其中外周血Th17、IL-17與FEV1%的相關性較好(r=-0.747，-0.753，P<0.05)。見表4和圖1。

2.5外周血Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17對AECOPD的診斷價值 外周血Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17診斷AECOPD的AUC及95%CI分別為0.862[0.764，0.963]，0.783[0.705，0.848]，0.814[0.726，0.875]，0.851[0.758，0.946]與對照組(AUC=0.5)比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。取外周血Th17最佳臨界值為7.28%時，其診斷AECOPD的靈敏度和特異度最好，分別為80.4%和87.3%。見圖2和表5。

表4 外周血Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17與肺功能指標的相關性分析

表5 外周血Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17對AECOPD的診斷價值

圖1 外周血Th17、IL-17與FEV1%的相關性

圖2 外周血Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17診斷AECOPD的ROC曲線

3 討 論

COPD是各種炎癥細胞參與的全身異常炎癥反應性疾病，以不完全可逆的氣流受限為主要特征。目前，COPD的發(fā)病率較高，預后較差，嚴重危害人類健康，同時給患者及社會帶來沉重的經濟負擔。因此，如何早期診斷及預測其病情嚴重程度對降低COPD的病死率具有重要意義。

Th17與Treg是一類近年來發(fā)現(xiàn)的淋巴細胞亞群，兩者分化上相互關聯(lián)，功能上相互拮抗，Th17/Treg細胞的平衡關系對于維持機體免疫穩(wěn)定和預防炎癥性疾病的發(fā)生具有重要作用[7-8]。Th17細胞分泌的IL-17可促使體內炎癥細胞釋放大量的致炎因子和趨化因子，誘導和活化中性粒細胞，進而引起中性粒細胞向炎癥組織聚集[9]。多項研究表明，Th17/Treg可能在慢性炎癥性肺部疾病發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的調節(jié)作用[10-11]。本研究結果顯示，COPD組外周血Th17、Th17/Treg及IL-17水平明顯高于對照組，而COPD組外周血Treg細胞含量明顯低于對照組，與Li等[12]研究結果基本一致。這提示Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17可能參與COPD的發(fā)生發(fā)展。Chang等[13]研究表明，在COPD患者中CD8+和CD4+細胞所產生的細胞因子IL-17A和IL-17F相對于對照組是明顯增加的。COPD是慢性炎癥反應，且炎癥主要從肺部產出，引起全身炎癥反應，進而引起組織破壞的病理性免疫應答發(fā)生，使Treg細胞含量減少。與對照組比較，COPD穩(wěn)定期組外周血Th17、Th17/Treg及IL-17水平明顯升高，且AECOPD組升高更明顯；與對照組比較，COPD穩(wěn)定期組外周血Treg細胞含量明顯下降，且AECOPD組下降更明顯?？梢奣h17、Treg、Th17/Treg及IL-17在COPD的發(fā)病過程中起著重要的作用，與COPD癥狀嚴重程度密切相關。Domagaa-Kulawik等[14]研究認為，Th17/Treg平衡參與了COPD的免疫調節(jié)過程，使得Th17及Treg細胞含量在COPD患者不同時期中存在差異。另有研究也表明，IL-17作為致炎因子，全程參與了COPD患者炎癥的發(fā)生、發(fā)展，隨著COPD病變程度的加重，IL-17水平隨之升高，Th17細胞及其特異性分泌因子IL-17可能介導了COPD的炎癥過程[15-16]。與對照組比較，COPD穩(wěn)定期組FEV1、FEV1%、FVC%、FEV1/FVC明顯下降，且AECOPD組下降更明顯。相關性分析顯示，COPD患者外周血Th17、Th17/Treg及IL-17水平隨FEV1、FEV1%、FVC、FVC%、FEV1/FVC的下降而明顯升高；COPD患者外周血Treg細胞含量隨FEV1、FEV1%、FVC、FVC%、FEV1/FVC的下降而明顯下降。這說明自身免疫功能失調對COPD患者肺功能的下降產生重要的影響，Th17型免疫應答介導了COPD發(fā)病過程中的自身免疫應答，同時由于COPD患者體內具有免疫抑制作用的Treg細胞數(shù)下降或功能異?？梢鸹颊叻喂δ苤笜讼陆?。既往研究發(fā)現(xiàn)，自身免疫反應是導致COPD患者持續(xù)存在氣道慢性炎癥的主要原因，而持續(xù)存在氣道慢性炎癥可導致上皮細胞損傷甚至氣道重塑，最終導致肺功能損傷[17-18]。此外，IL-17參與了COPD患者肺部慢性炎癥進展的病理損傷，IL-17水平與COPD氣道受限加重程度呈正相關[19]。應用ROC曲線分析顯示，外周血Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17對AECOPD的診斷具有重要的參考價值，而且外周血Th17最佳臨界值為7.28%時，其診斷AECOPD的靈敏度和特異度最好，分別為80.4%和87.3%。說明外周血Th17細胞水平可有效地反映COPD患者病情嚴重程度，是預測COPD急性加重的可靠指標。Podolin等[20]研究也表明，外周血Th17細胞水平較傳統(tǒng)感染標志物(CRP、WBC)更能準確地預測感染和炎癥水平，是早期預測AECOPD的有效指標。因此，通過抑制COPD患者外周血Th17細胞水平，可顯著降低患者機體炎癥反應，從而改善患者預后。

綜上所述，外周血Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17參與了COPD患者呼吸道慢性炎癥的發(fā)生發(fā)展過程，并可能導致炎癥的持續(xù)存在及肺功能的逐步損害，同時與COPD病情嚴重程度密切相關。但本研究為小樣本單中心研究，可能存在一定的偏倚，尚需多中心、大規(guī)模的前瞻性研究來進一步證實。