恒溫擴增芯片法在兒童下呼吸道感染性疾病中的應用價值評估

王詠紅 郭雅潔 陳玉瑩 馬 琦 李潔瓊

兒童下呼吸道感染病原構(gòu)成復雜，患兒臨床癥狀缺乏特異性，難以通過臨床特征進行診斷[1，2]。臨床目前用于下呼吸道感染的實驗室診斷方法主要是細菌培養(yǎng)和血清學檢測，而現(xiàn)有的診斷方法僅能檢測出30%～40%的病原[3-5]，亟需研發(fā)新的診斷方法以提高診斷敏感度。

PCR是現(xiàn)階段臨床使用的病原快速篩選方法[6-8]，其中，恒溫擴增芯片法(芯片法)通過環(huán)介導恒溫擴增，利用具有鏈置換功能的聚合酶在恒溫(65℃)條件下進行反應，簡單易行。呼吸道病原菌核酸檢測試劑盒采用了恒溫擴增芯片技術(shù)，可定性檢測臨床13種常見下呼吸道病原菌[9]。本研究利用恒溫擴增芯片技術(shù)，分析首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院(我院)住院患兒下呼吸道病原菌分布情況，并比較該方法與培養(yǎng)法和抗體法的一致性，旨在為臨床提供更為快速可靠的實驗室診斷依據(jù)。

1 方法

1.1 研究設計 采集下呼吸道感染住院患兒的痰液等分泌物標本，采用芯片法快速檢測13種病原，并與培養(yǎng)法和血清學檢測的檢出率進行比較。本研究經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會批準，涉及的檢查均取得了患兒監(jiān)護人的知情同意。

1.2 納入標準 ①2017年1～7月于我院住院的患兒；②符合下呼吸道感染的診斷標準[10]。

1.3 芯片法病原檢測 采用呼吸道病原菌核酸檢測試劑盒(北京博奧生物集團有限公司，批號：360090)?；純河谌朐寒斕觳杉置谖飿吮?痰液、胃液、支氣管肺泡灌洗液、鼻咽分泌物、咽拭子或腦脊液)，置于一次性無菌痰杯中，不少于0.6 mL。提取核酸，配置恒溫擴增試劑，將恒溫擴增試劑盒核酸充分混勻進行恒溫擴增，隨后加入到芯片主通道中，將加樣后的芯片固定在低速離心機上，以6 000 r·min-1離心30 s后取下進行核酸擴增及檢測。試劑盒采用ROC法計算得到13種待檢病原(流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、耐甲氧西林葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希氏菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、結(jié)核分枝桿菌復合群、肺炎支原體、嗜肺軍團菌和肺炎衣原體)的參考值，將各病原指標的參考值整合至試劑盒判斷軟件中，由軟件對樣品檢測結(jié)果進行自動判讀。當檢測指標的擴增時間值≤該病原指標的參考值時判讀為陽性，余判讀為陰性。

1.4 痰培養(yǎng) 收集合格痰標本(即所有標本進行鏡檢，要求白細胞數(shù)>25/低倍視野且上皮細胞<10/低倍視野)。將痰標本分別接種于血平板、加萬古霉素巧克力平板、麥康凱平板和羅氏培養(yǎng)基，于35℃、5% CO2條件培養(yǎng)，一般細菌培養(yǎng)24 h或48 h，結(jié)核分枝桿菌需培養(yǎng)3～4周，觀察培養(yǎng)基并篩選可能的致病菌進行鑒定。

1.5 血清學檢測 采用日本富士瑞必歐株式會賽樂迪亞-麥可Ⅱ試劑盒(SERODIA-MycoⅡ；珠海麗珠試劑股份有限公司；批號S20040076)，以顆粒凝集法檢測肺炎支原體(MP)IgM和IgG的混合體。按試劑盒說明加入血清稀釋液。MP-Ab滴度≥1∶160為陽性結(jié)果。

采用德國歐蒙公司生產(chǎn)的呼吸道病原體譜診斷試劑盒，以間接免疫熒光法檢測衣原體和軍團菌IgM抗體水平。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料采用例數(shù)和百分比表示，檢出率比較采用相關(guān)樣本的配對χ2檢驗；計量資料采用均數(shù)±標準差表示。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 研究期間應用芯片法共檢測了230例下呼吸道感染住院患兒，男134例(58.3%)，女96例(41.7%)，平均年齡(8.1±3.8)歲；肺炎90例，支氣管肺炎68例，支氣管炎48例，毛細支氣管炎23例，肺結(jié)核1例。

2.2 芯片法檢測結(jié)果 表1顯示，230例患兒中共檢出病原陽性的患兒182例(79.1%)，其中，單一病原感染33.5%(77/230)，以流感嗜血桿菌單一感染最常見(28.6%)；混合感染45.6%(105/230)，以耐甲氧西林葡萄球菌、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌和金黃色葡萄球菌混合感染為主，且以2種病原混合感染最多見(64/230，27.8%)。

13種常見呼吸道病原菌中，檢出陽性率最高的病原依次為耐甲氧西林葡萄球菌、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎支原體和肺炎克雷伯菌，大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和嗜麥芽窄食單胞菌的感染率均<10%。未檢測到結(jié)核分枝桿菌復合群、嗜肺軍團菌和肺炎衣原體。

10種病原以混合感染為主，其中銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌未見單一感染，均與其他呼吸道病原菌混合感染存在。肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、嗜麥芽窄單胞菌與其他病原共感染的概率均>80%(表1)。

表1 芯片法檢測13種常見病原情況[n(%)]

2.3 芯片法與培養(yǎng)法病原檢出率比較 行芯片法檢測的230例患兒中，212例同時進行了常規(guī)病原體分離培養(yǎng)。其中，芯片法檢測到9種常見病原(肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌和流感嗜血桿菌)，培養(yǎng)法陽性檢出率為34.0%(72/212)，芯片法為77.8% (165/212)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。表2顯示，對于流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，芯片法較培養(yǎng)法可分別多檢出40、37、22和12例標本，兩種方法的檢出率差異有統(tǒng)計學意義。對于銅綠假單胞菌和大腸埃希菌，兩種方法的檢出率差異無統(tǒng)計學意義。對于下呼吸道感染中感染率相對較低的鮑曼不動桿菌和嗜麥芽窄食單胞菌，兩種方法的陽性檢出率均較低，差異無統(tǒng)計學意義。芯片法可檢測到的耐甲氧西林葡萄球菌包括耐甲氧西林表皮葡萄球菌、耐甲氧西林溶血葡萄球菌等多種類型，培養(yǎng)法只能培養(yǎng)鑒定獲得耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的結(jié)果，因此未進行統(tǒng)計學比較。

恒溫擴增芯片檢測的患兒中，有68例進行了結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，其中1例培養(yǎng)陽性，而芯片法未檢出結(jié)核分枝桿菌，差異無統(tǒng)計學意義。

表2 芯片法與培養(yǎng)法對兒童下呼吸道病原檢出情況比較

注 1)：培養(yǎng)法只能檢測出耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的感染

2.4 芯片法與血清學檢測對兒童肺炎支原體、嗜肺軍團菌和肺炎衣原體的檢出情況 行芯片法檢測的230例患兒中，202例樣本同時進行了肺炎支原體、嗜肺軍團菌和肺炎衣原體血清學檢測。芯片法檢出肺炎支原體25例(12.4%)，其中4例為血清學檢測陰性；血清學肺炎支原體檢出24例(11.8%)，其中3例為芯片法檢測陰性，兩種方法的檢出率差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0,P=0.705)。兩種方法均未檢出嗜肺軍團菌和肺炎衣原體。

3 討論

恒溫擴增芯片技術(shù)是Notomi等在2000年開發(fā)的一種新型恒溫核酸擴增方法，主要針對靶基因的6個區(qū)域設計4種特異引物，通過鏈置換DNA聚合酶在約65℃恒溫條件下可完成核酸擴增反應[11]。該方法無需經(jīng)過模板的熱變性、長時間溫度循環(huán)、電泳、紫外觀察等過程，僅需1 h即可完成實驗，與傳統(tǒng)痰培養(yǎng)法比較，大幅縮短了檢驗周期。本研究采用的呼吸道病原菌核酸檢測試劑盒利用恒溫擴增芯片技術(shù)，為中國自主研發(fā)的試劑盒，在感染性疾病中具有較大的診斷價值[11,12]，已在國內(nèi)許多醫(yī)院使用，但未見非中文相關(guān)研究報道。

本研究對230例下呼吸道感染患兒分泌物樣本的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，芯片法檢測13種常見呼吸道病原菌，其中耐甲氧西林葡萄球菌(33.8%)、流感嗜血桿菌(27.8%)、肺炎鏈球菌(22.6%)，金黃色葡萄球菌(19.5%)，肺炎支原體(11.7%)和肺炎克雷伯菌(11.3%)的檢出率較高，而大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和嗜麥芽窄食單胞菌的檢出率不到10%。與本研究結(jié)果不同，劉志遠等[13]對94例痰標本進行了芯片法檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)流感嗜血桿菌(13株)是下呼吸道感染的主要致病菌，其次為肺炎鏈球菌(10株)和銅綠假單胞菌(9株)。陳愉生等[14]利用芯片法檢測成人下呼吸道病原，結(jié)果顯示，銅綠假單胞菌(21株)、流感嗜血桿菌(20株)、肺炎克雷伯菌(20株)和肺炎鏈球菌(12株)是下呼吸道感染的主要致病菌，提示成人的下呼吸道常見病原與兒童存在差別。另外，本研究中耐甲氧西林葡萄球菌的檢出率較高，耐甲氧西林葡萄球菌包含的種類較多，如耐甲氧西林金黃色色葡萄球菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌、耐甲氧西林溶血葡萄球菌和耐甲氧西林人葡萄球菌等，因此，結(jié)果部分未與培養(yǎng)法進行比較。

本研究中，芯片法檢測了9種可用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法培養(yǎng)的細菌(肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、流感嗜血桿菌)和1種需特殊培養(yǎng)基培養(yǎng)的細菌(結(jié)核分枝桿菌)。目前的培養(yǎng)方法，操作過程復雜且時間較長，很難達到早期快速診斷的目的。雖然采用培養(yǎng)法進行病原學診斷是診斷下呼吸道感染的金標準，但是目前培養(yǎng)法在兒童下呼吸道感染診斷中的陽性率很低，而芯片法能從微量拷貝中獲得目的基因，敏感度較高。以流感嗜血桿菌為例，本研究培養(yǎng)法的陽性率僅為7.5%，很多臨床確診為流感嗜血桿菌的患兒難以通過培養(yǎng)法獲取病原學證據(jù)。如果以培養(yǎng)法為金標準，芯片法測出為陽性的很多患兒，會被判定為假陽性，導致芯片法的特異性低，因此用培養(yǎng)法作為金標準評判芯片法的敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值會存在誤差。為了更直觀地比較，本研究評價了兩種方法對于各種病原菌的檢出率，而非采用敏感度和特異度表示。結(jié)果顯示，芯片法對病原體的檢出率明顯高于培養(yǎng)法，特別是對于流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌。與本研究結(jié)果類似，劉志遠等[13]采用芯片法檢出63株病原體，培養(yǎng)法檢出10株病原體，培養(yǎng)陽性率明顯低于芯片法。芯片法能從微量拷貝中獲得目的基因，故檢出率高于培養(yǎng)法。然而，并不是所有能檢測到病原體DNA的標本，都判斷為陽性，芯片法設定有一個TP(time of positive)值，即在一定時間內(nèi)擴增拷貝數(shù)達到一定的數(shù)量，才可判讀為陽性，可以更好地與定植菌區(qū)分。目前病原檢出率低是困擾兒童下呼吸道感染性疾病診斷的主要問題之一，芯片法有較高的陽性檢出率，在兒童下呼吸道病原檢出方面具有一定的優(yōu)勢，從而更好地指導臨床醫(yī)生合理用藥。唐睿珠等[15]發(fā)現(xiàn)，芯片法的陽性率高于培養(yǎng)法。李松等的研究中，機械通氣新生兒下呼吸道病原檢出率，芯片法的陽性率高于培養(yǎng)法[16]。芯片法較培養(yǎng)法對兒童下呼吸道感染病原體檢出率高的可能原因：①芯片法能從微量拷貝中獲得目的基因，敏感性高；②培養(yǎng)條件要求較高，特別是兒童，傳統(tǒng)痰培養(yǎng)難以獲取病原體；③部分病原體如流感嗜血桿菌，由于易受用藥的影響，因此培養(yǎng)陽性率低；④培養(yǎng)技術(shù)要求專業(yè)的培養(yǎng)基以及技術(shù)人員[15]。

本研究中，對于銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、鮑曼不動桿菌和嗜麥芽窄食單胞菌，芯片法和培養(yǎng)法的檢出率差異無統(tǒng)計學意。與本研究不同，李松等發(fā)現(xiàn)，兩種方法對嗜麥芽窄食單胞菌和銅綠假單胞菌的檢出率不一致[16]。這可能是由于研究對象不同導致的，新生兒感染中醫(yī)源性感染比例較高，感染類型與本研究不同，另外由于樣本量較小，需要擴大樣本量進一步驗證。此外，在68例進行了結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的患兒中，有1例培養(yǎng)陽性，而芯片法為陰性，可能是芯片法檢測假陰性。結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)條件苛刻，特別對于兒童來說，結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性率較低，而理論上芯片法檢測的是病原體DNA，能從微量拷貝中獲得目的基因，敏感性要高于培養(yǎng)，為何出現(xiàn)培養(yǎng)法陽性而芯片法陰性的情況，有待進一步思考和研究。

芯片法還可檢測3種非常規(guī)培養(yǎng)的病原體：肺炎支原體、嗜肺軍團菌和肺炎衣原體。這3種病原體主要依靠血清學方法進行檢測，但通常在病程1～2周后，血清中才會出現(xiàn)相應抗體，對臨床的實際診治價值有限。將這3種病原體整合到芯片中，可達到快速診斷的目的。本研究同時進行恒溫擴增芯片和血清學檢測的202例患兒中，芯片法未檢出軍團菌和衣原體，檢出25例肺炎支原體，其中21例血清學方法亦為陽性，支原體檢出的符合率較高。

綜上所述，與培養(yǎng)法相比，芯片法可快速診斷感染病原菌，陽性檢出率高，并可檢測肺炎支原體、軍團菌和衣原體等病原體。芯片法為兒童下呼吸道感染的診斷以及鑒別診斷提供了更為敏感、有效和簡便的方法。