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    基于線粒體12S rDNA序列分析巖扇貝與國(guó)內(nèi)主要經(jīng)濟(jì)扇貝的親緣關(guān)系

    2018-08-02 01:43:46
    河北漁業(yè) 2018年2期
    關(guān)鍵詞:親緣扇貝海灣

    摘要:應(yīng)用PCR擴(kuò)增和測(cè)序技術(shù)獲得了引進(jìn)種巖扇貝(Crassadoma gigantea)及我國(guó)主要經(jīng)濟(jì)扇貝:蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensz‘s)、櫛孔扇貝(Chlamys farreri)和海灣扇貝(Argopecten irradians)的12S rDNA全序列,并進(jìn)行了相關(guān)分析。結(jié)果表明,四種扇貝12S rDNA的序列長(zhǎng)度在906~964bp之間,其A+T含量在50.57%~56.77%之間;單倍型數(shù)、多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)、單倍型多樣性指數(shù)、核苷酸多樣性指數(shù)和平均核苷酸差異數(shù)分別在2~3、2~3、0.264~0.623、0.00075~0.00207和0.427~1.882之間,均表現(xiàn)出較低的遺傳多樣性水平;種間遺傳距離在0.079~0.306之間,其中蝦夷扇貝與櫛孔扇貝的遺傳距離最近,其次是巖扇貝與蝦夷扇貝,而巖扇貝與海灣扇貝的遺傳距離最遠(yuǎn),并且系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示蝦夷扇貝先與櫛孔扇貝聚為一支,再與巖扇貝進(jìn)行聚類,而海灣扇貝則與其它扇貝聚為另一個(gè)單系群,進(jìn)一步闡明了四種扇貝間的親緣關(guān)系。

    關(guān)鍵詞:12S rDNA;巖扇貝(Crassadoma gigantea);遺傳變異;親緣關(guān)系 中圖分類號(hào):Q959 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

    巖扇貝(Crassadoma gigantea)隸屬于軟體動(dòng)物門(mén)(Mollusca)、瓣鰓綱(Lamellibranchia)、珍珠貝目(Pterioida)、扇貝科(Pectinidae),原產(chǎn)于北美洲太平洋沿岸海域。因其具有生長(zhǎng)速度快、肉質(zhì)鮮美以及抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn),在國(guó)外市場(chǎng)備受歡迎。目前國(guó)內(nèi)主要養(yǎng)殖的扇貝種類有櫛孔扇貝(Chlamys.farreri)、華貴櫛孔扇貝(Mimachlamys nobilis)、海灣扇貝(Argopectenirradians)和蝦夷扇貝(Patinopecten yessoen-sis)。然而,隨著扇貝養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展,縱觀整個(gè)產(chǎn)業(yè)鏈存在諸多問(wèn)題,如種質(zhì)衰退嚴(yán)重、疾病災(zāi)害頻發(fā)、品質(zhì)下降等,而新物種的引進(jìn)將成為解決問(wèn)題的有效途徑之一。因此,大連海洋大學(xué)曹善茂教授于2012年從加拿大引進(jìn)巖扇貝種貝并繁育成功。目前,有關(guān)巖扇貝的研究主要集中在生理生態(tài)等方面,其遺傳學(xué)研究在國(guó)內(nèi)外卻鮮見(jiàn)報(bào)道。作為外來(lái)引進(jìn)新物種,對(duì)其遺傳學(xué)及種質(zhì)資源的評(píng)估資料仍處短缺狀態(tài),這將給生產(chǎn)應(yīng)用帶來(lái)很大困擾。

    線粒體DNA具有母性遺傳、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、大小適中、缺乏重組、進(jìn)化速率相對(duì)較快等特點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于種群遺傳學(xué)、系統(tǒng)發(fā)生學(xué)和分子進(jìn)化等相關(guān)研究,其中rRNA基因同時(shí)具有易變區(qū)和保守區(qū),目前已作為可靠的分子標(biāo)記廣泛應(yīng)用于動(dòng)物的分子進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)生等相關(guān)研究。因此,擬通過(guò)測(cè)定巖扇貝、櫛孔扇貝、海灣扇貝、蝦夷扇貝的mtDNA 12S rDNA序列,分析其遺傳變異趨勢(shì),并結(jié)合GenBank其他扇貝的相應(yīng)的基因序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,從分子水平上了解巖扇貝的遺傳背景及其系統(tǒng)進(jìn)化地位,以期為巖扇貝今后的遺傳育種研究工作提供部分基礎(chǔ)信息。

    1材料與方法

    1.1實(shí)驗(yàn)材料

    本研究所使用的巖扇貝為由加拿大溫哥華引進(jìn)的種貝的F1代個(gè)體,為1齡貝養(yǎng)殖于大連龍王塘海域(代表符號(hào):Y);蝦夷扇貝(代表符號(hào):X)、櫛孔扇貝(代表符號(hào):Z)均購(gòu)自于大連新長(zhǎng)興海產(chǎn)品市場(chǎng),為2~3齡貝;海灣扇貝(代表符號(hào):H)取自于山東萊州某養(yǎng)殖場(chǎng),為1~2齡貝。采樣時(shí)間均為2017年5月,每個(gè)種隨機(jī)取10個(gè)樣本,經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定后取閉殼肌保存于無(wú)水乙醇中備用。

    1.2實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1基因組DNA提取 參考Sambrook等的酚/氯仿抽提法并略做修改。取2μL基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,檢測(cè)基因組DNA的完整性,并取1μL在NanoDrop 2000微量分光光度計(jì)上測(cè)定濃度,最后稀釋成約50ng/μL的工作液保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2引物 引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。櫛孔扇貝、蝦夷扇貝及海灣扇貝的12S rDNA序列擴(kuò)增根據(jù)GenBank中該物種線粒體基因組全序列設(shè)計(jì)特異性引物,使用Primer5軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì),引物序列具體為:櫛孔扇貝F:5-TTTCTGCTCCGTGGTGTA-3,R:5-ATAGCCCTGCCCATAAGTT-3;蝦夷扇貝F:5-:GTCGGACTTGGTC GTA-CAT-3R:5-ATAGCCCTGCCCA TAAGTT-3;海灣扇貝F:5-AGCCTTCAGCCTA-AATGT-3R:5-TCACCAC CAACCGAAT-AG-3;而巖扇貝的12S rDNA序列則通過(guò)其它三種扇貝跨種擴(kuò)增獲得。

    1.2.3測(cè)序 PCR反應(yīng)總體系為25μL,包括1μL模板DNA(50ng/μL),2.5μL 10×reactionbuffer,1.0μL dNTP MIX(2.5 mM),1.0μL上下游混合引物(各10μM),0.2μL 1 U Taq DNA聚合酶,18.8μL超純水;PCR反應(yīng)條件是:94℃預(yù)變性5min;94℃變性35s,50℃退火40s,72℃延伸40s,進(jìn)行38個(gè)循環(huán);最后72℃充分延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)BioSpin GelExtraction Kit純化回收后,連接到pMDl8-T載體上,再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α,挑選陽(yáng)性克隆送天一輝遠(yuǎn)(武漢)生物科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

    1.2.4數(shù)據(jù)分析 測(cè)序結(jié)果使用BioEdit7.0進(jìn)行序列拼接;使用NCBI的BLAST工具搜索其它貝類的同源序列,下載扇貝科7種扇貝以及外源群兩種貽貝的Cytb基因的同源序列(信息見(jiàn)表1);ClustalX1.83對(duì)不同物種的DNA序列進(jìn)行多重比對(duì),使用GeneMarkS4.6b軟件對(duì)巖扇貝的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行12S rRNA基因的預(yù)測(cè);使用DNAsp5分析核酸基本參數(shù),MEGA5.1計(jì)算堿基組成和遺傳距離,并基于Neighbor-joining(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

    2結(jié)果

    2.112S r DNA序列得堿基組成

    利用PCR測(cè)序技術(shù)獲得了四種扇貝的12SrDNA全序列,堿基組成結(jié)果如表2所示。首先,四種扇貝12S rDNA序列長(zhǎng)度在909~964pb之間,最長(zhǎng)的為蝦夷扇貝,其次是櫛孔扇貝,最短的為巖扇貝。四種扇貝的A、T、G、C含量分別在27.709/6~29.59%、23.55%~27.17%、26.40%~28.61%和16.83%~20.81%之間,其A+T含量在50.57%~56.77%之間,最高為巖扇貝,最低為櫛孔扇貝,但均大于G+C含量。

    2.212S r DNA序列的遺傳多樣性

    基于12S r DNA序列獲得的四種扇貝的遺傳變異參數(shù)如表3。首先,巖扇貝、櫛孔扇貝、蝦夷扇貝和海灣扇貝分別獲得3、2、3、2個(gè)單倍型,無(wú)共有單倍型,多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)依次為2、2、2、3,所有核苷酸變異位點(diǎn)均為轉(zhuǎn)換和顛換變異(多態(tài)性核苷酸位點(diǎn)及各單倍型分情況詳見(jiàn)表4)。四種扇貝的單倍型多樣性指數(shù)(Hd)在0.264~0.623之間,其中巖夷扇貝最高,其次是蝦夷扇貝,而櫛孔扇貝最低;核苷酸多樣性指數(shù)(7c)在O.00075~0.00207之間,其中海灣扇貝的值最高,其次是巖扇貝,而櫛孔扇貝最低;平均核苷酸差異(k)在0.427~1.882之間,其中最高值為海灣扇貝,其次是巖扇貝,而櫛孔扇貝。所有遺傳變異參數(shù)中,π值和k值之間呈正相關(guān)關(guān)系。

    2.3種間遺傳距離及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

    利用獲得的所有12S r DNA序列計(jì)算了四種扇貝種間遺傳距離,結(jié)果如表5。四種扇貝的遺傳距離在0.079~0.306之間,其中櫛孔扇貝與蝦夷扇貝之間的遺傳距離最近,之后依次為巖扇貝與蝦夷扇貝(0.094)、巖扇貝與櫛孔扇貝(0.105)、櫛孔扇貝與海灣扇貝(0.280)、蝦夷扇貝與海灣扇貝(0.289),而巖扇貝與海灣扇貝之間的遺傳距離最遠(yuǎn)。

    2.4系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

    利用獲得的四種扇貝的所有12S r DNA單倍型序列,并結(jié)合GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中其他扇貝的相應(yīng)序列,基于鄰接法Neighbor-Joining(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),選取蚶科的兩個(gè)種作為外源群,結(jié)果如圖1。除外源群物種獨(dú)自聚為一個(gè)分支以外,扇貝科的所有物種分為兩個(gè)單系群,其中一個(gè)單系群包括蝦夷扇貝的3個(gè)單倍型、櫛孔扇貝的2個(gè)單倍型、巖扇貝的3個(gè)單倍型以及Mimachlamys、Pecten兩個(gè)屬的物種,每個(gè)屬的物種又獨(dú)自聚為一個(gè)小分支,具體為蝦夷扇貝先與櫛孔扇貝聚為一支,再與巖扇貝聚類,之后與Mimachlamys聚類,最后與Pecten聚為一個(gè)單系群;而Argopecten的四個(gè)種則獨(dú)自聚為另一個(gè)單系群,其中海灣扇貝與其亞種墨西哥海灣扇貝聚為一個(gè)小分支,而另兩個(gè)種聚為一個(gè)小分支。

    3討論

    3.112S r DNA的序列特征及遺傳多樣性

    DNA序列分析是鑒定生物親緣種,研究系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系的方法之一。12S rRNA屬線粒體基因,在動(dòng)物進(jìn)化機(jī)制和系統(tǒng)發(fā)育研究上是一種有效的分子標(biāo)記。本研究獲得的四種扇貝的12Sr DNA全序列經(jīng)Clustal比對(duì)發(fā)現(xiàn),四種扇貝的12S r DNA序列同源性較低,種間變異較大。但四種扇貝的序列長(zhǎng)度并無(wú)明顯的種間長(zhǎng)度多態(tài),這在其它動(dòng)物的研究中也存在類似的現(xiàn)象。另外,四種扇貝的12S r DNA序列的A+T含量均大于G+C含量,符合動(dòng)物線粒體基因的堿基組成特征,并與其它貝類的研究結(jié)果相一致。

    遺傳多樣性是物種延續(xù)和發(fā)展的基礎(chǔ),其豐富的種群在復(fù)雜多變的自然環(huán)境中表現(xiàn)出更強(qiáng)的適應(yīng)性。而通常來(lái)說(shuō),核苷酸多樣性指數(shù)(π)和單倍型多樣性指數(shù)(Hd)是評(píng)估種群遺傳多樣性的兩個(gè)重要指標(biāo),但由于單個(gè)堿基的變異就能生成一種新的單倍型,Hd值可在短時(shí)間內(nèi)積累變異而快速提高,而丌值的提高需要長(zhǎng)時(shí)間的積累,因此兀值在衡量種群遺傳多樣性時(shí)比Hd值更具代表性。本研究中,四種扇貝的π值在0.00045~0.00207之間。但Lan等認(rèn)為,當(dāng)π值低于0.0047時(shí),則表明遺傳多樣性處于較低水平,說(shuō)明本研究中采樣區(qū)的四種扇貝均表現(xiàn)出較低的遺傳多樣性水平。其原因可能與實(shí)驗(yàn)樣本均為養(yǎng)殖群體有關(guān)。

    3.2遺傳距離及系統(tǒng)發(fā)育分析

    物種間的遺傳距離是衡量其親緣關(guān)系的重要指標(biāo)。本研究中櫛孔扇貝與蝦夷扇貝之間的遺傳距離最近,表明其親緣關(guān)系最近,此部分結(jié)果與秦艷杰等應(yīng)用AFLP技術(shù)的研究結(jié)果一致,而巖扇貝與海灣扇貝之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。其次,巖扇貝與其它三種扇貝之間則表現(xiàn)為巖扇貝與蝦夷扇貝的親緣關(guān)系最近,而與海灣扇貝之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

    目前,在扇貝系統(tǒng)進(jìn)化方面已有大量的研究報(bào)道,如Insua等和Jose Lopez-Pinon等分別利用ITSI和5S rDNA序列對(duì)歐洲的四種扇貝進(jìn)行了親緣關(guān)系探討;胡麗萍等和Canapa等利用16S rDNA部分序列進(jìn)行了相關(guān)研究;而B(niǎo)arucca等和Puslednik等則同時(shí)利用16S rDNA和12S rDNA序列構(gòu)建了扇貝的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。其中,Puslednik等的研究對(duì)象較為豐富,包括本研究中的蝦夷扇貝、海灣扇貝以及引進(jìn)種巖扇貝在內(nèi),但該研究獲得的僅為相應(yīng)基因的部分序列,而非基因全序列。盡管缺失了櫛孔扇貝,但其結(jié)果顯示蝦夷扇貝與Chlamys的冰島扇貝獨(dú)自聚為一個(gè)分支,再與巖扇貝進(jìn)行聚類,而海灣扇貝則與其它扇貝聚在另外一個(gè)大分支。本研究中蝦夷扇貝與櫛孔扇貝聚為一個(gè)分支,再與巖扇貝進(jìn)行聚類,而海灣扇貝聚為另一個(gè)單系群。兩者的研究表現(xiàn)出極大的相似性。

    4結(jié)論

    綜上所述,本研究利用PCR擴(kuò)增及測(cè)序技術(shù),獲得了巖扇貝、海灣扇貝、蝦夷扇貝和櫛孔扇貝的mtDNA 12S r DNA全序列,并進(jìn)行了遺傳變異水平及系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果表明:采樣區(qū)四種扇貝均表現(xiàn)出較低的遺傳多樣性水平,并且四種扇貝之間,蝦夷扇貝與櫛孔扇貝的遺傳距離最近,其次是巖扇貝與蝦夷扇貝,而巖扇貝與海灣扇貝的遺傳距離最遠(yuǎn),闡明了四種扇貝之間的親緣關(guān)系。該研究結(jié)果將為巖扇貝的引種與推廣養(yǎng)殖以及今后的遺傳育種研究工作提供參考信息。

    (收稿日期:2017-12-27)

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