褐藻多糖體外免疫調(diào)節(jié)活性研究

李俊燕　孫可澄　辛泉伯　羅薇　宋悅凡

摘要：以甘露糖醛酸多糖和巖藻聚糖硫酸酯為實(shí)驗(yàn)材料，通過酸水解法得到不同的聚甘露糖醛酸組分；采用超聲法對(duì)巖藻聚糖硫酸酯進(jìn)行降解，收集不同分子量范圍區(qū)間的組分，對(duì)各樣品進(jìn)行紅外光譜分析，并考察了體外對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響，以探索各組分的體外免疫調(diào)節(jié)活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用三氟乙酸對(duì)甘露糖醛酸多糖進(jìn)行水解，其紅外譜圖與水解前有明顯變化，出現(xiàn)酯基吸收峰，表明水解程度較高；而醋酸水解后紅外吸收譜圖峰型無顯著變化；采用凝膠排阻層析進(jìn)行分子量檢測(cè)，各組水解后的聚甘露糖醛酸分子量有不同程度降低。巖藻聚糖硫酸酯經(jīng)超聲處理后，分子量>100kD的組分在2μg/mL濃度下具有提高RAW264.7活性的作用，而濃度上升至54、162μg/mL時(shí)對(duì)細(xì)胞活性有抑制作用；而水解后所得的聚甘露糖醛酸各樣品對(duì)RAW264.7活性無顯著影響。

關(guān)鍵詞：聚甘露糖醛酸；巖藻聚糖硫酸酯；免疫調(diào)節(jié)；生物活性

全世界海洋中生長有15000余種海藻，海洋藻類植物十分豐富。多糖是海藻最重要的產(chǎn)物，約占其干重的50%以上。海藻多糖是一種高分子碳水化合物，由多個(gè)不同或相同的單糖基通過糖苷鍵相連而成，并且它也是一種具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能作用的天然的活性物質(zhì)，它通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)功能可以增強(qiáng)機(jī)體免疫活性，另外還具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抗輻射和抗凝血等作用。

免疫系統(tǒng)是一套復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在控制感染、預(yù)防慢性疾病和腫瘤的形成中發(fā)揮核心作用，具有免疫調(diào)節(jié)活性的天然產(chǎn)物的開發(fā)日益受到重視。廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中的多糖是具有免疫調(diào)節(jié)活性的天然產(chǎn)物的重要來源，能夠參與機(jī)體多種生理過程的調(diào)節(jié)，具有安全、毒副作用小等特點(diǎn)。本次實(shí)驗(yàn)旨在探索褐藻多糖的免疫調(diào)節(jié)活性，為未來的褐藻多糖功能產(chǎn)品的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1生物材料 甘露糖醛酸多糖及巖藻聚糖硫酸酯由大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，國家海藻加工技術(shù)研發(fā)分中心提供；RAW 264.7細(xì)胞由中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所提供。

1.1.2試劑 R/MINI 1640培養(yǎng)基，胎牛血清，青霉素，鏈霉素，二甲基亞砜（DMSO），胰酶購自上海生工。冰醋酸，三氟乙酸（TFA），四甲基偶氮唑鹽（MTT），溴化鉀，無水乙醇，三羥甲基氨基甲烷（Tris）等試劑均為市售分析純。

1.2方法

1.2.1酸解法制備褐藻膠聚甘露糖醛酸 分別稱取50mg甘露糖醛酸多糖6份，配制8.5mol/L醋酸溶液，4m01/L三氟乙酸溶液，加樣如表1所示。搖勻，放人70℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱水解4h后，取出，冷卻至室溫，4℃過夜后，將樣品放人70℃電熱真空干燥箱中，使溶劑揮發(fā)，加入去離子水，搖勻，再次放人70℃電熱真空干燥箱中揮發(fā)，重復(fù)2～3次，pH試紙檢測(cè)約為6.0，取出備用。

1.2.2超聲法制備不同分子量區(qū)間的巖藻聚糖硫酸酯 稱取80mg日本厚葉海帶巖藻聚糖硫酸酯于50mL離心管中，加入去離子水20mL，搖勻，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行超聲，超聲波粉碎機(jī)設(shè)定強(qiáng)度為99%，溫度為50℃，超聲波工作時(shí)間4s，間隔9s，總時(shí)長60min。將超聲后的樣品依次轉(zhuǎn)入100kD、50kD超濾管中，9000r/min，離心20min，收集分子量>100kD和100～50kD多糖組分，冷凍干燥，備用。

1.2.3各組分紅外光譜檢測(cè) 稱取經(jīng)干燥后的褐藻多糖樣品1.8～2.8mg，分別加入溴化鉀，烘干至恒重后，研磨均勻，壓片后經(jīng)傅立葉變換紅外光譜儀（PerkinElmer股份有限公司）掃描4000～450cm^-1波數(shù)范圍。

1.2.4凝膠排阻層析法測(cè)定褐藻多糖的分子量 使用AKTA（UPC10）系統(tǒng)，采用Sephacryl S-100填料，色譜柱直徑1cm，高度36cm，流動(dòng)相為8mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH=8.0），分別稱取褐藻多糖樣品2～3mg，溶于Tris-HCl緩沖液，得濃度為2mg/mL的褐藻多糖溶液，上樣，檢測(cè)各樣品的出峰位置。測(cè)定分子量所用的標(biāo)準(zhǔn)品分別為藍(lán)色葡聚糖（分子量>2000kD）和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（分子量分別為5、40、70kD）。流動(dòng)相流速為0.3mL/min，記錄外水體積V。和洗脫體積V_e2，以Kav為橫坐標(biāo)（K_av=（V_e-V_o）/（V-V_o）），葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算褐藻多糖的分子量。

1.2.5MTT測(cè)定褐藻多糖對(duì)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW 264.7活性的影響 選取RAW264.7細(xì)胞使用R/MINI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，各培養(yǎng)基均加入10%小牛血清。取細(xì)胞株對(duì)數(shù)期生長細(xì)胞，使用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至2×10₅個(gè)/mL，96孔板每孔接種100μL，待96孔板中細(xì)胞接種約4h貼壁后，加入含多糖樣品的培養(yǎng)基100μL，使得各多糖組分的終濃度分別為2、6、18、54、162μg/mL，同時(shí)設(shè)置只加入培養(yǎng)液的空白對(duì)照組，置于含5%CO₂的培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)18h后，各孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL，孵育4h后棄上清，加入150μLDMSO裂解，使用酶標(biāo)儀雙波長測(cè)定各孔吸光值，檢測(cè)波長570nm、參比波長630nm。以對(duì)照組OD值為100%細(xì)胞活力，計(jì)算多糖樣品各濃度下的細(xì)胞活力，采用t一檢驗(yàn)法，P值取0.05時(shí)，與對(duì)照組比較不同多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響是否顯著。

2結(jié)果與分析

2.1聚甘露糖醛酸和巖藻聚糖硫酸酯組分的制備

酸解制備的聚甘露糖醛酸樣品，經(jīng)過多次加入去離子水，真空干燥，最終樣品均為黑褐色固體，pH值約為6。超聲粉碎凍干后的巖藻聚糖硫酸酯，分子量區(qū)間>100kD的樣品重量為5.2mg，分子量區(qū)間在100～50kD的樣品重量為2.3mg。兩種組分總回收率為9.4%。

2.2聚甘露糖醛酸組分的紅外光譜分析

初始的甘露糖醛酸多糖樣品紅外光譜圖如圖1所示，6種經(jīng)降解后的聚甘露糖醛酸樣品的紅外光譜圖，如圖2-圖3所示。

未經(jīng)酸解的甘露糖醛酸多糖在3310cm^-1處出現(xiàn)O-H伸縮振動(dòng)的吸收峰，為多糖的一OH特征吸收峰，在1616cm^-1處出現(xiàn)酰胺基C=O伸縮振動(dòng)吸收峰，在1414cm^-1處出現(xiàn)C-H變角振動(dòng)吸收峰，在1030cm^-1處出現(xiàn)C-O-C、C-O-H伸縮振動(dòng)吸收峰。

經(jīng)1、2、4mol三氟乙酸降解后所得的聚甘露糖醛酸均表現(xiàn)為相似的出峰位置，其中包括在3369～3402cm^-1處出現(xiàn)O-H伸縮振動(dòng)的吸收峰，為多糖的-OH特征吸收峰，在1685cm^-1處出現(xiàn)C=O伸縮振動(dòng)的吸收峰，存在部分內(nèi)酯，在1416cm^-1處出現(xiàn)C-H變角振動(dòng)，在1040～1085cm^-1處出現(xiàn)C-O-C、C-O-H伸縮振動(dòng)吸收峰。

經(jīng)2.125、4.25、8.5tool醋酸水解后所得的聚甘露糖醛酸均表現(xiàn)為相似的出峰位置，其中包括在3341～3350cm^-1處出現(xiàn)O-H伸縮振動(dòng)吸收峰，為多糖的-OH特征吸收峰，在1615cm^-1處出現(xiàn)酰胺基C=O伸縮振動(dòng)吸收峰，在1414cm^-1處出現(xiàn)C-H變角振動(dòng)吸收峰，在1035cm^-1處出現(xiàn)C-O-C、C-O-H伸縮振動(dòng)吸收峰。

對(duì)比原樣品與降解后的樣品發(fā)現(xiàn)：三氟乙酸水解后的聚甘露糖醛酸樣品都在1685cm^-1處出現(xiàn)羧基的吸收峰，峰值偏1700cm^-1，有部分酯基，存在部分內(nèi)酯，說明樣品水解程度高。醋酸水解的聚甘露糖醛酸樣品與水解前樣品相似，說明醋酸的水解作用弱。同種酸不同濃度水解的樣品紅外譜圖相似，說明在該水解溫度和作用時(shí)長條件下，酸濃度對(duì)水解程度的影響較為有限。

2.3不同聚甘露糖醛酸降解組分的分子量檢測(cè)

將不同的聚甘露糖醛酸進(jìn)行凝膠排阻層析，依據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定其各自的分子量，所得結(jié)果如下：初始甘露糖醛酸多糖樣品分子量為22.72kD；以1、2、4mol三氟乙酸水解的聚甘露糖醛酸分子量分別為6.91kD、8.58kD、7.17kD；以2.125、4.25、8.5mol醋酸水解的聚甘露糖醛酸分子量分別為14.83kD、11.51kD、11.87kD?？芍航?jīng)三氟乙酸水解后的聚甘露糖醛酸分子量較小，水解的較為徹底；而經(jīng)醋酸水解后的聚甘露糖醛酸分子量較大。

2.4各多糖組分體外對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響

6種經(jīng)降解后的聚甘露糖醛酸樣品對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響結(jié)果，如圖4-圖5所示。6種聚甘露uW264.7細(xì)胞活力無明顯影響，并無體外免疫細(xì)胞活性調(diào)節(jié)作用。

分子量>100kD的巖藻聚糖硫酸酯對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響結(jié)果，如圖6所示。分子量>100kD的巖藻聚糖硫酸酯樣品的濃度在2、54、162g/mL時(shí)，與對(duì)照組相比有顯著性差異，2μg/mL濃度時(shí)顯著刺激細(xì)胞活力上升，54、162μg/mL顯著抑制細(xì)胞活性，說明分子量>100kD的巖藻聚糖硫酸酯體外具有免疫調(diào)節(jié)作用，在低濃度下對(duì)RAW264。7細(xì)胞活力有促進(jìn)作用，而在高濃度下對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力有抑制作用。50～100kD的巖藻聚糖硫酸酯樣品與對(duì)照組相比無顯著性差異。

3討論

褐藻多糖雖然在組成和化學(xué)結(jié)構(gòu)上存在差異，但在生物活性方面有很多的相似性，2013年，李海花等觀察研究了重均分子量為5.5kD的低聚甘露糖醛酸對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)的作用，結(jié)果表明，低聚甘露糖醛酸能提高機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫水平，具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用。而本實(shí)驗(yàn)采用體外RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)，結(jié)果表明，聚甘露糖醛酸在體外條件下對(duì)免疫細(xì)胞并沒有刺激或抑制作用，表明多糖在體內(nèi)和體外免疫調(diào)節(jié)活性考察時(shí)，可能出現(xiàn)不同結(jié)果。

2016年，劉曉東等研究了巖藻聚糖硫酸酯對(duì)小鼠免疫的影響，結(jié)果表明，褐藻多糖硫酸脂在小鼠體內(nèi)能不同程度地誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，促進(jìn)細(xì)胞免疫反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)分子量>100kD的巖藻聚糖硫酸酯對(duì)細(xì)胞活力有顯著性影響，低濃度下有提高細(xì)胞活性的作用，高濃度則起到抑制作用，故巖藻聚糖硫酸酯具有免疫調(diào)節(jié)活性，結(jié)果與劉曉東等研究結(jié)果相似。聚甘露糖醛酸的體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)活性和巖藻聚糖硫酸酯免疫調(diào)節(jié)活性的機(jī)理值得進(jìn)行深入研究和探索。

（收稿日期：2017-12-05）