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    2016~2017年四川地區(qū)PRRS病毒ORF5基因的遺傳變異分析

    2018-08-02 11:37:28丁夢蝶朱佳文梁璐琪張毅陳斌邵靚
    四川畜牧獸醫(yī) 2018年7期
    關(guān)鍵詞:表位美洲核苷酸

    丁夢蝶 ,朱佳文 ,梁璐琪 ,張毅 ,陳斌 ,邵靚

    (1.四川省動物疫病預(yù)防控制中心,四川 成都 610041;2.成都市農(nóng)林科學(xué)院畜牧研究所,四川 溫江 611130)

    豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS,俗稱豬藍耳?。┯?987年首次在美國發(fā)現(xiàn),我國于1996年首次分離到PRRSV美洲型經(jīng)典毒株(CH-1a),2006年我國大面積暴發(fā)高致病性PRRS,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[1]。2013年以來,我國部分地區(qū)又出現(xiàn)了歐洲型PRRSV毒株[2]以及美洲型NADC30類病毒(NADC30-like)[3-4]。PRRSV 是單股正鏈 RNA 病毒,基因組的變異使得新毒株不斷出現(xiàn)。ORF5編碼主要囊膜蛋白GP5,該蛋白是病毒與細胞受體結(jié)合區(qū),包含病毒中和位點,在結(jié)構(gòu)蛋白中變異率最高,因此ORF5基因是研究PRRSV遺傳進化及分子流行病學(xué)的重要靶基因。本研究應(yīng)用RT-PCR法從2016~2017年采集自四川地區(qū)的疑似PRRSV感染病料中擴增ORF5基因,并進行序列分析,以了解近兩年來PRRSV在四川地區(qū)的流行特點,為有效防控該病提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 病料 疑似PRRSV感染豬病料來自于2016年和2017年四川地區(qū)的流行病學(xué)調(diào)查采樣,保存于-80℃。

    1.2 主要試劑 柱式RNA提取試劑盒,購自北京世紀元亨動物防疫技術(shù)有限公司;RT-PCR一步法試劑盒,購自寶生物(大連)工程有限公司。

    1.3 樣品處理 取病死豬的組織樣品,用無菌鑷子剪碎,加入滅菌PBS(pH 7.2),然后在樣品制備系統(tǒng)中破碎,離心后取上清用于RNA提取,提取步驟按照試劑盒說明書進行。

    1.4 ORF5基因的擴增和序列測定 使用Zhou L等[5]設(shè)計的引物ORF5-F、ORF5-R擴增ORF5基因,預(yù)期擴增片段長度為682bp。RT-PCR擴增反應(yīng)體系:25μL 2×1step buffer、2μL Enzyme mix、上下游引物各 1μL(20μmoL)、4μL RNA、17μL RNase Free H2O,反應(yīng)總體積為50μL。RT-PCR反應(yīng)條件:50℃ 30 min,94℃ 2min;94℃ 30s,56℃ 30s,72℃ 50s,共 32 個循環(huán);72℃ 8min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,確認有目的條帶后送上海生工進行T載體克隆和測序。

    1.5 ORF5基因的序列分析 應(yīng)用DNAStar軟件對所測得的ORF5基因序列,以及CH-1a(AY032626)、JXA1 (EF112445)、VR-2332(AY150564)、NADC30(JN654459)、QYYZ(JQ308798)、LV(M96262)等參考毒株的ORF5基因序列進行同源性分析和序列比對。用MEGA6軟件Neighbor-Joining法進行遺傳變異分析,設(shè)置自展值(bootstrap)為1000,構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

    2 結(jié)果

    2.1 ORF5基因的測序結(jié)果 經(jīng)測序后共得到12個ORF5基因序列。對測序結(jié)果進行剪切后,長度均為603bp,編碼200個氨基酸。

    2.2 序列同源性分析 12個ORF5基因序列之間的核苷酸序列同源性為82.3%~99.8%,推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為81.1%~99.5%。與美洲型毒株CH-1a、JXA1、VR-2332、NADC30、QYYZ 的 ORF5 基因的核苷酸序列同源性分別為85.1%~95.4%、83.6%~99.5%、85.1%~89.4%、83.9%~94.2%、82.8%~90.9%,與歐洲型代表株LV的核苷酸序列同源性僅為61.4%~64.6%;推導(dǎo)的氨基酸序列同源性分別為85.6%~93.5%、83.6%~98.5%、83.1%~88.6%、84.1%~93.5%、80.6%~93.0%,與LV氨基酸序列的同源性僅為53.3%~58.9%。

    2.3 遺傳變異分析 基于ORF5基因序列構(gòu)建的遺傳進化樹如圖1所示。

    圖1 基于ORF5基因序列的遺傳進化樹

    PRRSV毒株分為美洲型(Type 2)和歐洲型(Type 1)兩個基因型。美洲型毒株可以分為5個亞群,分別以JXA1、CH-1a、NADC30、VR-2332 和 QYYZ 毒株為代表。本研究中的12個序列均屬于美洲型,其中有10個 (O-01-2016、O-02-2016、O-03-2016、O-04-2016、O-01-2017、O-02-2017、O-03-2017、O-04-2017、O-07-2017、O-08-2017)屬于以 JXA1 毒株為代表的 I亞群,另 2個(O-06-2017、O-05-2017)分別屬于以NADC30株為代表的Ⅲ亞群和以QYYZ毒株為代表的V亞群。

    2.4 ORF5基因推導(dǎo)的氨基酸比對分析 抗原表位區(qū)域和毒力位點均存在氨基酸變異。與所在亞群的代表株相比,在 B 細胞表位 1(27~30aa)中,O-08-2017株發(fā)生 V29→A29突變,O-06-2017株發(fā)生A27→V27突變;在 B 細胞表位 2(37~45aa)中,O-02-2016株發(fā)生I39→F39突變;在B細胞表位3(180~197aa)中,O-02-2016株發(fā)生 L196→Q196突變,O-04-2016株發(fā)生 R191→K191突變,O-07-2017、O-08-2017株發(fā)生L196→R196突變。在T細胞表位區(qū)域,與所在亞群的代表株相比,I亞群中O-02-2016株發(fā)生 I121→V121、V124→I124突變,O-07-2017株發(fā)生R151→K151突變,O-08-2017株發(fā)生I121→L121突變;Ⅲ亞群中O-06-2017株發(fā)生120LI121→120FF121、K129→R129、K163→R163 突變;V亞群中O-05-2017株發(fā)生F117→L117、I121→T121、I124→V124、Y153→H153 突變。在毒力位點的第 13 位 aa,O-05-2017、O-06-2017 株為 Q13,其余為 R13;第 151 位 aa,O-05-2017、O-06-2017、O-07-2017株為K151,其余為R151。

    3 討論

    在PRRSV的結(jié)構(gòu)蛋白中,普遍認為編碼GP5蛋白的ORF5基因最容易發(fā)生變異,因此可通過分析ORF5基因的變異情況來研究PRRSV的分子流行病學(xué)[6-7]。PRRSV主要分為以LV株為代表的歐洲型毒株和以VR-2332株為代表的美洲型毒株,兩者之間的核苷酸序列同源性約60%。本研究中12個美洲型ORF5序列與LV株ORF5基因的核苷酸序列同源性僅為61.4%~64.6%,符合這一現(xiàn)象。此外,雖然都屬于美洲型,但12個ORF5序列之間的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性相互之間有較大差異,也符合ORF5基因變異大的特點。

    PRRSV流行毒株的ORF5基因在抗原表位區(qū)域和毒力位點均有發(fā)生氨基酸突變的報道[8]。在抗原表位區(qū)域有6個ORF5序列(O-02-2016、O-04-2016、O-05-2017、O-06-2017、O-07-2017、O-08-2017)發(fā)生了以下突變:A27→V27、V29→A29、I39→F39、I121→V121、V124→I124、K163→R163、R191→K19 1、L196→R196、L196→Q196 等。這些突變可能會引起抗原性改變,進而影響疫苗免疫效果。在毒力相關(guān)位點,強毒株為R13和R151,弱毒株為Q13和G151。在第 13 位 aa,2 株(O-05-2017、O-06-2017)出現(xiàn)毒力致弱(R13→Q13);在第 151位 aa,3株(O-05-2017、O-06-2017、O-07-2017)可能出現(xiàn)毒力改變(R151→K151)。此外,已知ORF5序列的前31位氨基酸為信號肽序列,是GP5蛋白的高變區(qū),本研究中除 O-02-2016、O-03-2016、O-04-2016 外的其他序列在第10~30aa均有氨基酸突變。

    4 結(jié)論

    本研究12個ORF5序列中,有10株與高致病性毒株JXA1的親緣關(guān)系較近,有1株與NADC30毒株的親緣關(guān)系較近,另1株與廣東分離株QYYZ的親緣關(guān)系較近,可見四川地區(qū)近兩年流行的PRRSV以高致病性的JXA1亞型為主,也有少量NADC30亞型和QYYZ亞型毒株出現(xiàn),應(yīng)密切關(guān)注。

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