果膠酶對(duì)銅綠微囊藻蛋白表達(dá)的影響

沈清清，彭 謙，陳紅惠，賴(lài)泳紅，紀(jì)開(kāi)艷

(1.文山學(xué)院 環(huán)境與資源學(xué)院，云南文山 663099；2.云南大學(xué) 微生物研究所，昆明 650091；3.云南文山學(xué)院 化學(xué)與工程學(xué)院，云南文山 663099)

銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)是引起藍(lán)藻水華的主要優(yōu)勢(shì)種[1]，它的泛濫生長(zhǎng)給地球環(huán)境和人類(lèi)的正常生活帶來(lái)巨大的危害，多年來(lái)技術(shù)人員采取基于物理、化學(xué)和生物原理的除藻技術(shù)來(lái)治理藻華[2-3]，但效果一直不理想甚至引出更多的環(huán)境負(fù)效應(yīng)，因此人們?nèi)匀辉趯ふ铱沙掷m(xù)和高效的除藻技術(shù)。銅綠微囊藻細(xì)胞壁的主要成分為果膠質(zhì)，果膠酶(pectinase)具有將果膠質(zhì)分解為多聚半乳糖醛酸的功能[4]。因此，果膠酶很可能具有導(dǎo)致銅綠微囊藻細(xì)胞衰亡的能力。基于以上理論基礎(chǔ)，沈清清等[5]研究果膠酶對(duì)銅綠微囊藻的作用效果，結(jié)果表明果膠酶能顯著抑制銅綠微囊藻的生長(zhǎng)，但前提必須是在光照條件下果膠酶才能發(fā)揮此抑藻效應(yīng)。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已開(kāi)始運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)手段研究不同環(huán)境脅迫條件下水華藻類(lèi)的蛋白表達(dá)差異，以了解藻細(xì)胞脅迫反應(yīng)的內(nèi)在分子機(jī)制。 Choi等[6]分析暗培養(yǎng)和光培養(yǎng)條件下集胞藻(Synechocystissp.PCC 6803)中可溶性蛋白的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)8種蛋白質(zhì)(RbcS/L、CbbA、Gap2、AtpB、CpcB、PsbO、PsbU)與藻細(xì)胞的光合作用與呼吸作用密切相關(guān)。Fulda 等[7]研究鹽脅迫下集胞藻(Synechocystissp. PCC 6803)可溶性蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)55個(gè)蛋白表達(dá)量明顯增加，并通過(guò)相關(guān)的研究證實(shí)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)為集胞藻適應(yīng)高鹽脅迫過(guò)程中主要的調(diào)節(jié)機(jī)制。因此本試驗(yàn)從蛋白組學(xué)角度出發(fā)，在滇池中化感物質(zhì)與藻華的關(guān)系研究課題組(以下稱(chēng)本課題組)前期研究的基礎(chǔ)上，比較光培養(yǎng)和暗培養(yǎng)條件對(duì)果膠酶抑制銅綠微囊藻效應(yīng)的影響，利用SDS-PAG技術(shù)分析果膠酶作用下暗培養(yǎng)組和光培養(yǎng)組藻細(xì)胞中蛋白質(zhì)的變化動(dòng)態(tài)，尋找有價(jià)值的蛋白質(zhì)分子水平上的差異，結(jié)合差異蛋白的性質(zhì)與功能探討果膠酶對(duì)藻細(xì)胞的效應(yīng)機(jī)制，以期為銅綠微囊藻生理生態(tài)研究和果膠酶在藻華治理方面的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和幫助。

1 材料與方法

1.1 材 料

銅綠微囊藻(MicrocystisaeruginosaFACHB 469) 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所藻種保藏中心。

果膠酶：美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)，酶活為400～800 U·g-1。

1.2 方 法

1.2.1 銅綠微囊藻的培養(yǎng) 在無(wú)菌條件下，采用無(wú)菌操作，將20 mL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻種接入裝有150 mL已滅菌的BG-11藻細(xì)胞培養(yǎng)液(pH 7.1)的三角瓶中，在溫度為(25±2) ℃、光照度約3 000 lx、每天光照12 h培養(yǎng)，人工每天振搖6～9次，擴(kuò)大培養(yǎng)15 d。

1.2.2 果膠酶的固定化處理 將w=4%海藻酸鈉與w=4%明膠各100 mL于80 ℃水浴中混合溶解，約1 h后將混合液降至50 ℃左右，加入w=2%果膠酶液100 mL攪拌2～3 min，待充分混合后加入w=5%戊二醛15 mL攪拌均勻，保持混合液在50 ℃水浴中，制成小球。靜置2 h后放入w=0.05% 戊二醛中固定過(guò)夜(4 ℃冰箱中浸泡)，濾出小球并以蒸餾水洗滌數(shù)次，濾紙吸干，4 ℃保存，備用[5]。固定化果膠酶酶活為4～8 U·g-1。

1.2.3 果膠酶作用藻細(xì)胞 嚴(yán)格采用無(wú)菌操作，將培養(yǎng)15 d的銅綠微囊藻液倒入已滅菌的1 000 mL大三角瓶充分搖動(dòng)混勻分別取150 mL藻液裝入250 mL三角瓶(初始藻細(xì)胞濃度約為2.8×107mL-1，葉綠素a質(zhì)量濃度4 mg·L-1)。分為對(duì)照組(光)、對(duì)照組(暗)、光培養(yǎng)處理組和暗培養(yǎng)處理組共4組進(jìn)行試驗(yàn)[下文圖表中分別采用control(light)、control(dark)、light、dark表示]，每個(gè)組設(shè)3個(gè)平行，采用一次性培養(yǎng)方式進(jìn)行試驗(yàn)。對(duì)照組(光)：藻液在“1.2.1”培養(yǎng)條件下培養(yǎng)；對(duì)照組(暗)：裝有藻液的三角瓶用鋁箔嚴(yán)密包裹，置于無(wú)光箱培養(yǎng)。光培養(yǎng)處理組：藻液中加入15 g果膠酶，搖勻后在“1.2.1”培養(yǎng)條件下培養(yǎng)；暗培養(yǎng)處理組：藻液中加入15 g果膠酶，三角瓶用鋁箔嚴(yán)密包裹，置于無(wú)光箱，溫度為(25±2) ℃，人工每天振搖6～9 次培養(yǎng)。

1.2.4 藻細(xì)胞全蛋白分離與鑒定全蛋白分離 分別提取對(duì)照組(光)、對(duì)照組(暗)、光培養(yǎng)組和暗培養(yǎng)組條件下培養(yǎng)的藻細(xì)胞全蛋白。采用SDS-PAGE電泳分離蛋白，分離膠濃度φ=12%，電極緩沖液為T(mén)ris-甘氨酸電泳緩沖液，銀染顯色[8]。

蛋白質(zhì)譜鑒定：從凝膠上割下蛋白條帶，φ=30%乙腈，0.025 mol·L-1碳酸氫銨洗脫1次，之后再用φ=50%乙腈，0.01 mol·L-1碳酸氫銨洗脫一次進(jìn)行脫水處理。脫水條帶裝入離心管-20 ℃下保存送檢。蛋白條帶利用美國(guó)ABI4700 MALDI串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF/TOF)做質(zhì)譜分析。

數(shù)據(jù)庫(kù)檢索：利用軟件Mascot distiller過(guò)濾基線(xiàn)峰、識(shí)別信號(hào)峰。利用Mascot軟件搜索SwissPort數(shù)據(jù)庫(kù)，尋找匹配的相關(guān)蛋白質(zhì)且確定其功能，以明確鑒定出蛋白質(zhì)的性質(zhì)。查詢(xún)條件：MS-MS離子檢索，選用酶Trypsin，漏切位點(diǎn)l，一個(gè)樣品點(diǎn)的全部MS-MS峰值數(shù)據(jù)合并為一個(gè)檢索數(shù)據(jù)文件。固定修飾為Carbamidomethy(C)，可變修飾為Oxsidation(M)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16.0軟件包和Microsoft Excel 2003進(jìn)行ANOVA統(tǒng)計(jì)分析，以P<0.05為顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 光照和黑暗條件對(duì)果膠酶抑藻效應(yīng)的影響

觀察果膠酶加入后在光照和黑暗條件下銅綠微囊藻的生長(zhǎng)情況，如圖1所示，4個(gè)試驗(yàn)組藻液培養(yǎng)第3天與第15天相比前后差異最大的為光培養(yǎng)處理組，藻液由黃綠色變?yōu)闇\黃色；其次為對(duì)照組(暗)，藻液由深綠色變?yōu)闇\綠色；而暗培養(yǎng)處理組和對(duì)照組(光)藻液顏色無(wú)明顯變化。

圖1 果膠酶對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of pectinase on the growing of M.aeruginosa

2.2 差異蛋白質(zhì)的確定

為了解果膠酶對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響，從各試驗(yàn)組中取相同體積的藻液離心棄上清獲得藻細(xì)胞后提取總蛋白進(jìn)行分析。總蛋白的SDS-PAGE分析結(jié)果如圖2所示，試驗(yàn)第3天時(shí)4個(gè)試驗(yàn)組藻細(xì)胞表達(dá)的蛋白組分無(wú)差異，但在蛋白豐度上卻存在差異，其中對(duì)照組(光)(泳道6)、對(duì)照組(暗)(泳道9)和暗培養(yǎng)處理組(泳道2)3個(gè)試驗(yàn)組相同Rf值位置處的各蛋白譜帶的豐度無(wú)明顯差異，而與這3組相比光培養(yǎng)處理組(泳道3和泳道7)在譜帶的蛋白豐度上差異顯著，尤其在2～105 ku的多肽變化明顯，有多條蛋白譜帶顏色變淺，表明其含量降低，其中約42 ku和68 ku處的2條譜帶(分別命名為ADa和ADb)顏色最淺，著色模糊，甚至有消失的趨勢(shì)，這一現(xiàn)象與其他試驗(yàn)組的ADa和ADb譜帶清晰及著色較深的情況形成鮮明對(duì)比。以上數(shù)據(jù)表明試驗(yàn)第3天在光照條件下果膠酶能使銅綠微囊藻細(xì)胞某些種類(lèi)的蛋白表達(dá)量減少，而黑暗條件下無(wú)此效應(yīng)，結(jié)合“2.1”結(jié)果分析表明光照條件下ADa和ADb蛋白豐度的降低與藻細(xì)胞的消亡有一定的相關(guān)性。另外，本試驗(yàn)對(duì)處理第30 天的藻細(xì)胞總蛋白也進(jìn)行了SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)光培養(yǎng)處理組(4和8泳道)的蛋白譜帶與處理第3 天的相比無(wú)論在蛋白組分還是在蛋白豐度上都有極顯著差異，分析其原因可能是果膠酶長(zhǎng)時(shí)間作用藻細(xì)胞后，使果膠酶中的蛋白成分分解或藻細(xì)胞死亡后胞壁破損，胞內(nèi)大量的蛋白類(lèi)物質(zhì)分解釋放的緣故，另外經(jīng)過(guò)30 d處理，細(xì)胞數(shù)量變化很大，取與試驗(yàn)第3天相同體積的藻液進(jìn)行分析所造成的誤差相對(duì)也比較大，為此，針對(duì)這一方面不再進(jìn)行研究與討論。 Pandey 等[9]研究了聚球藻(Synechococcussp. PCC 7942)在不同光源條件下蛋白質(zhì)的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)對(duì)黑暗適應(yīng)的聚球藻細(xì)胞能產(chǎn)生8種特有的多肽，表明利用黑暗能誘導(dǎo)藻細(xì)胞合成新的多肽。而本試驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)相似的現(xiàn)象。

0、1. Marker；2.果膠酶處理第3天的樣品(黑暗) Tracks represent the proteins that separated fromM.aeruginosacells after treatment with pectinase on the 3th day(dark);3、7.果膠酶處理第3天的樣品(光照) Tracks represent the proteins that separated fromM.aeruginosacells after treatment with pectinaseon the 3th day;4、8.果膠酶處理第30天的樣品(光照) 4 and 8 tracks are the proteins of 30th day in the experiment(light);5.果膠酶 Pectinase；6.對(duì)照樣品(光照) Control(light)；9.對(duì)照樣品(黑暗) Control(dark)

圖2SDS-PAGE分離藻細(xì)胞全蛋白
Fig.2SDS-PAGEseparationoftotalproteinsfromM.aeruginosa

2.3 蛋白質(zhì)譜分析

為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)變化最顯著的ADa和ADb蛋白與藻細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)系，將6泳道中相應(yīng)Rf值位置處的ADa和ADb條帶割下，用MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀分析鑒定，僅獲得ADa蛋白的詳細(xì)數(shù)據(jù)，分析ADb不能解出的原因可能是蛋白未達(dá)到質(zhì)譜對(duì)樣品的要求。如圖3所示MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜分析顯示在質(zhì)荷比(m/z)為976.404 5、1 132.485 8、1 198.655 4、1 790.824 8和2 211.011 0這5個(gè)離子信號(hào)位點(diǎn)的特征峰相對(duì)豐度較高，對(duì)這5個(gè)肽段碎片進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析得到精確結(jié)果。利用Mascot軟件提交至數(shù)據(jù)庫(kù)查找相匹配的蛋白質(zhì)[10]。檢索結(jié)果顯示肽序列和Microcystisaeruginosa在數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白序列比較無(wú)顯著相似性結(jié)果，推測(cè)該蛋白為功能未知的新蛋白。

圖3 蛋白的MALDI-TOF-TOF一級(jí)質(zhì)譜分析Fig.3 The first MALDI-TOF-TOF mass spectrum analysis of proteins

2.4 蛋白的鑒定與分析

為確定ADa蛋白的屬性，檢索所有物種數(shù)據(jù)庫(kù)蛋白，結(jié)果顯示該蛋白與許多真核生物中的actin 蛋白都有不同程度匹配分值(表1為8類(lèi)較高匹配值的蛋白參數(shù))，如綠藻Mesostigmaviride肌動(dòng)蛋白(actin)(SwissPort數(shù)據(jù)庫(kù)中編號(hào)為ACT-MESVI)，結(jié)果匹配得分56，大于25(P<0.05)，可信度較高。長(zhǎng)期以來(lái)，人們認(rèn)為原核細(xì)胞中缺乏細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，只有真核生物中才能找到。但近年來(lái)，許多種類(lèi)的原核生物中都發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞骨架蛋白的存在，并且在功能與結(jié)構(gòu)上與真核生物相似，具有決定細(xì)胞形態(tài)、調(diào)控染色體分離、維持生物活性和調(diào)控細(xì)胞壁合成等方面的功能[11]。Carballido[12]研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌中存在肌動(dòng)蛋白絲類(lèi)似物MreB、ParM和MamK，微管蛋白類(lèi)似物FtsZ和BtubA/B和中間絲類(lèi)似物CreS；人們也在魚(yú)腥藻(Anabaenasp．PCC 7120)中發(fā)現(xiàn)了MreB[13]和FtsZ[14]； Guljamow 等[15]發(fā)現(xiàn)在銅綠微囊藻PCC 7806的基因組中存在一個(gè)基因島，這個(gè)基因島編碼兩類(lèi)蛋白即actin(肌動(dòng)蛋白)和profilin(肌動(dòng)蛋白的結(jié)合蛋白)，這兩類(lèi)蛋白與真核生物的相關(guān)蛋白具有高度同一性，林重陽(yáng)[16]經(jīng)研究推測(cè)Guljamow等[15]報(bào)道的銅綠微囊藻ActM蛋白可能是擬核區(qū)染色體的附著與支撐結(jié)構(gòu)，具有近似真核生物細(xì)胞核骨架的功能。Kaneko 等[17]研究也發(fā)現(xiàn)銅綠微囊藻PCC 7806中存在MreB蛋白。由此推測(cè)ADa蛋白可能是與肌動(dòng)蛋白有關(guān)聯(lián)的一類(lèi)蛋白或是原核藍(lán)藻中的actin類(lèi)似物；另外結(jié)合沈清清等[5]的研究結(jié)果觀察發(fā)現(xiàn)大量藻細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)有不同程度的損傷和缺失、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)降解斷裂的情況分析，ADa蛋白可能與維持細(xì)胞基本形態(tài)相關(guān)，后期本課題組將對(duì)該蛋白的功能及性質(zhì)進(jìn)行更深入的研究。

表1 SwissPort數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索結(jié)果Table 1 Result of searching SwissProt protein database

3 討論與結(jié)論

銅綠微囊藻是喜光物種，藻華爆發(fā)的時(shí)節(jié)正是光照強(qiáng)和日照時(shí)間長(zhǎng)的夏季，光照對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)具有重要意義。諸多研究表明，藻類(lèi)在光照弱或黑暗條件下對(duì)外界刺激耐受力較弱，且生長(zhǎng)較容易受到抑制[18]；另外，低光照會(huì)使藻細(xì)胞分泌的胞外多糖含量下降及群體尺寸變小[18-19]；一些研究還報(bào)道抑藻劑在黑暗條件下的抑藻效果更為顯著，原因可能是光合作用的停止限制了藻細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收，從而抑制藻細(xì)胞的生長(zhǎng)，在此情況下，抑藻劑更易侵蝕藻細(xì)胞，導(dǎo)致藻細(xì)胞死亡[20-21]。然而，本試驗(yàn)結(jié)果卻表明黑暗條件反而有助于銅綠微囊藻抵抗果膠酶的損傷效應(yīng)，甚至黑暗條件下果膠酶對(duì)其生長(zhǎng)有緩慢的促進(jìn)作用，表明光照條件是果膠酶對(duì)銅綠微囊藻起抑制作用的一個(gè)敏感條件。林必桂等[22]在研究賴(lài)氨酸的抑制作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，光照條件下賴(lài)氨酸對(duì)銅綠微囊藻具有專(zhuān)性抑制作用，而黑暗條件下不同濃度賴(lài)氨酸對(duì)微囊藻均無(wú)明顯的抑制作用，質(zhì)量濃度為2.0 mg·L-1的賴(lài)氨酸反而使處理的微囊藻葉綠素a 含量顯著增加，表明黑暗條件下微囊藻具有利用賴(lài)氨酸進(jìn)行化能異養(yǎng)生長(zhǎng)的能力。近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)有些藻類(lèi)在遇到不良環(huán)境或極限條件時(shí)能夠生存下來(lái)，是因?yàn)樗鼈儠?huì)啟動(dòng)一些保護(hù)機(jī)制清除能量消散、自由基等對(duì)光合系統(tǒng)及其他一些重要的細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損害，或采取減慢生長(zhǎng)速率以保持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的生存策略[23-24]；另外，有研究還發(fā)現(xiàn)銅綠微囊藻不僅可以利用無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)元素光合自養(yǎng)，還可以在無(wú)光照條件下生長(zhǎng)于有機(jī)物中，利用小分子有機(jī)底物進(jìn)行化能異養(yǎng)生長(zhǎng)的能力，如藻類(lèi)可在黑暗條件下利用糖類(lèi)物質(zhì)作為碳源維持細(xì)胞生長(zhǎng)[25]。由此推測(cè)，本試驗(yàn)中黑暗條件下銅綠微囊藻細(xì)胞可能選擇了異養(yǎng)生長(zhǎng)途徑，藻細(xì)胞不再利用光合系統(tǒng)進(jìn)行自養(yǎng)生長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)的代謝調(diào)控機(jī)制發(fā)生改變，從而導(dǎo)致果膠酶無(wú)法發(fā)揮效應(yīng)，但因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的缺乏，藻細(xì)胞也無(wú)法快速增殖，只能以緩慢生長(zhǎng)甚至近似休眠狀態(tài)的方式存活下來(lái)；因此本課題組大膽推測(cè)果膠酶的作用位點(diǎn)之一可能在藻細(xì)胞的光合系統(tǒng)，接下來(lái)筆者也將從這一角度繼續(xù)探究果膠酶抑制銅綠微囊藻生長(zhǎng)的分子機(jī)制。目前，關(guān)于抑藻物質(zhì)對(duì)藻細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)影響的研究較少，報(bào)道也主要集中在化感物質(zhì)作用藻細(xì)胞方面，化感物質(zhì)是指植物代謝過(guò)程中向外界分泌的化學(xué)物質(zhì)[26]，其抑藻機(jī)制研究比較深入，其中一種機(jī)制就是化感物質(zhì)會(huì)對(duì)藻細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成產(chǎn)生影響[27]。Wu 等[28]在馬來(lái)眼子菜與銅綠微囊藻的共培養(yǎng)體系蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中發(fā)現(xiàn)，馬來(lái)眼子菜的化感作用能導(dǎo)致銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)蛋白的降解，雙向凝膠電泳圖譜中差異較大的蛋白表達(dá)均呈2倍下調(diào)的趨勢(shì)。汪麗等[29]在研究荇菜種植水對(duì)銅綠微囊藻的效應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)3種藻膽蛋白(包括藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、藻紅蛋白)相對(duì)含量均有不同程度的下降。本試驗(yàn)結(jié)果也表明光照條件下果膠酶具有降解多種蛋白或抑制蛋白表達(dá)的效應(yīng)，其中對(duì)ADa蛋白表現(xiàn)的效應(yīng)最顯著。而黑暗條件下ADa蛋白豐度變化不明顯，表明ADa蛋白的減少與藻細(xì)胞消亡存在相關(guān)性且該蛋白與光合作用有一定的聯(lián)系。