不同栽培年限藍莓根際土壤微生物群落多樣性分析

董德武，劉 宇，盧存龍，王麗雪，劉愛民

(安徽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，生物環(huán)境與生態(tài)安全安徽省高校省級重點實驗室，重要生物資源保護與利用研究安徽省重點實驗室，安徽蕪湖 241000)

藍莓(Blueberry)是多年生灌木小漿果果樹，因果實呈藍色而得名[1]。藍莓果實中含有豐富的營養(yǎng)成分和活性因子，具有防止腦神經(jīng)老化、強心、抗癌、軟化血管、增強人機體免疫、活化視網(wǎng)膜功效、強化視力、防止眼球疲勞等功能。中國藍莓種植面積和產(chǎn)量以年均 50% 的速度遞增[2]，2013年藍莓產(chǎn)量達到15 130 t[3]。同時，中國學(xué)者對藍莓的研究也逐年增多，劉鳳紅[4]研究藍莓根系內(nèi)生真菌的多樣性，龔娜等[5]研究不同菌根真菌對藍莓根際土壤微生物數(shù)量的影響。但是對于藍莓根際微生物的研究鮮有報道。

根際是一個由根系分泌物輸入高能量而導(dǎo)致微生物劇烈活動的微生態(tài)系統(tǒng)[6]。根際土壤微生物可以影響土壤營養(yǎng)的分解、轉(zhuǎn)化和植物對營養(yǎng)的吸收利用，同時也是衡量土壤肥力和養(yǎng)分的重要指標[7-9]。根際微生物可促進植物根系生長，增加根系的吸收面積，間接改善植物的營養(yǎng)狀況[10]。研究植物根際土壤微生物的方法主要包括傳統(tǒng)的微生物純平板培養(yǎng)法、基于細胞膜化學(xué)成分的細胞分析技術(shù)、現(xiàn)代分子生物學(xué)方法、基于碳源利用模式的Biolog微平板分析方法。其中，現(xiàn)代分子生物學(xué)方法又包括群落水平總DNA分析方法、核酸雜交技術(shù)、克隆文庫方法和基因指紋技術(shù)。在諸多方法中，平板計數(shù)方法只能得到微生物總量的1%[11]，微生物的群落信息量很少，不可避免地會造成特殊菌種的缺失及微生物原有群落結(jié)構(gòu)的改變，不能客觀地反映微生物的多樣性[12]。核酸技術(shù)能夠克服傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的缺點，但也存在信息大量丟失的不足，如土壤細菌難以裂解引起DNA提取差異，PCR過程中也容易丟失許多信息[13-15]。PLFA(Phospholipid Fatty Acid)技術(shù)利用活體細胞細胞膜中含有的大量磷脂脂肪酸(PLFAs)，細胞中磷脂的組成與環(huán)境樣品中微生物的組成和生物量存在相對恒定的關(guān)系，不同類型的微生物通過不同的生化代謝途徑形成具有生物特異性的PLFA組成。通過分析PLFA圖譜推測細菌、真菌和放線菌的組成關(guān)系[16-17]，在微生物群落結(jié)構(gòu)研究中較為常用。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集與處理

安徽省蕪湖市南陵縣年平均氣溫15.8 ℃，冬、春兩季都在3.5 ℃以下。年平均日照時數(shù)1 935.4 h，占全年可照時數(shù)的43.7%。年平均降水量為1 402.6 mm，主要集中在4-6月，冬季較少。

莓嶺巴爾頓藍莓種植區(qū)土壤以紅色酸性土為主。利用取樣器隨機采集藍莓根基根際土壤迅速裝入塑料袋內(nèi)，分為2份，一份自然風(fēng)干、過100目篩，用于測定土壤的理化性質(zhì)，另一份用于測定土壤微生物的脂肪酸。

1.2 方 法

1.2.1 土壤理化性質(zhì)分析 凱氏定氮法測定總氮； NH4F-HCl法測定有效磷[18]；醋酸銨-火焰光度計測定速效鉀[18]；水合熱法測定有機質(zhì)。

1.2.2 土壤微生物總脂肪酸的提取 取10 g土壤樣品加入20 mL KOH-甲醇溶液，37 ℃水浴震蕩2 h (震蕩頻率130次·min-1)，再加入3 mL1.0 mol·L-1的乙酸，旋轉(zhuǎn)震蕩(震蕩頻率500次·min-1，時間30 s)后，加入10 mL正己烷，同時加入內(nèi)標50 μL，震蕩，37 ℃旋轉(zhuǎn)震蕩搖勻30 min后，4 000 r·min-1離心10 min，取5 mL上清置于離心管中，氮氣吹干。向離心管中加入1 mL 體積比1∶1的正己烷-甲基叔丁基醚溶液，充分溶解2 h，轉(zhuǎn)入GC小瓶，用于脂肪酸分析[19-20]。所有使用的試驗器材都用色譜級的甲醇45 ℃浸泡過夜，再用超純水清洗，烘干。C19∶0內(nèi)標配制：稱取0.1 g C19∶0樣品溶于1 000 mL正己烷中，配成0.1 mg·L-1的溶液。0.2 mol·L-1的KOH-甲醇溶液：參照國標(GB-601-2008)中0.1 mol·L-1KOH-乙醇的標準溶液配制。

1.2.3 脂肪酸的測定 采用島津GC/MS2010 PLUS測定，分析柱類型為RTX(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm)。取1 μL待測樣進行分析。GC測定條件：以氦氣為載體，柱內(nèi)流量為2 mL·min-1，總流量為40.2 mL·min-1。進樣口溫度為250 ℃，分流比為30∶1，柱溫箱程序升溫至40 ℃起始，保持2 min，以15 ℃·min-1升至170 ℃，保持2 min，再以1.5 ℃·min-1升至200 ℃，保持3 min，再以2 ℃·min-1升至225 ℃，保持3 min，以1.5 ℃·min-1升至250 ℃，保持2 min。MS條件：離子原溫度 250 ℃，溶劑切割時間為6 min，采用Scan掃描方式。

1.2.4 脂肪酸的命名方法 脂肪酸常用的命名格式為：X∶YWZ(a/i)，其中，X表示總碳數(shù)，Y表示雙鍵數(shù)，W表示甲基末端，Z表示距離甲基端的距離，表1中a和i分別表示支鏈的反異構(gòu)和異構(gòu)，10 Me表示在距分子末端第10個碳原子上有一個甲基，環(huán)丙烷脂肪酸用cy表示[21]。不同的磷脂脂肪酸代表特定的微生物[22-31]。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法 測定數(shù)據(jù)的方差分析、數(shù)據(jù)差異性分析、相關(guān)性分析利用SPASS 19.0統(tǒng)計軟件、Origin8.0繪圖軟件、Excel2010軟件進行，數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標準差”表示。

表1 表征微生物的PLFATable 1 Characterization of microbial PLFA

2 結(jié)果與分析

2.1 藍莓不同栽培年限根際土壤的理化性質(zhì)

如表2所示，不同栽培年限的藍莓根際土壤理化指標差異明顯，且有效磷變化最大，其中6 a藍莓根際土壤中有機質(zhì)、有效磷、全氮質(zhì)量分數(shù)最高。不同栽培年限藍莓的土壤理化性質(zhì)不同，藍莓植株吸收土壤中各成分的能力也不同。藍莓植株的不同栽培年限與土壤養(yǎng)分因子的相關(guān)系數(shù)存在差異。隨著栽培年限的增大，藍莓根際土壤中速效鉀和有效磷顯著下降，呈現(xiàn)負相關(guān)，而栽培年限與有機質(zhì)、全氮質(zhì)量分數(shù)的相關(guān)性小。土壤養(yǎng)分因子間的相關(guān)性有差異，其中，有機質(zhì)與速效鉀質(zhì)量分數(shù)呈現(xiàn)高度負相關(guān)，而有機質(zhì)與全氮呈顯著正相關(guān)。相對非栽培區(qū)土壤理化性質(zhì)，栽培區(qū)土壤理化指標變化顯著，特別是栽培年限越長，土壤中速效鉀質(zhì)量分數(shù)越小，表明藍莓生長需要大量的速效鉀。

表2 不同栽培年限藍莓根際土壤的理化指標Table 2 The physical and chemical properties of rhizosphere soil in different cultivating year of blueberries

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P≤0.01)。

Note：In each column, means followed by different lowercase letters are significantly different(P≤0.01).

表3 不同栽培年限藍莓土壤微生物磷脂脂肪酸的質(zhì)量分數(shù)Table 3 Mass fraction of PLFA biomarkers in rhizosphere soil of blueberries under different cultivating year ng·g-1

注:- 未檢到。

Note：-Undetected.

2.2 不同栽培年限藍莓土壤微生物群落 PLFA 標記分析

由表3可知，不同栽培年限藍莓根際土壤中共檢測到21種PLFA，其中，細菌15種，真菌3種，放線菌2種。從圖1可以看出，在不同栽培年限的藍莓土壤中，占比最高的PLFA為16∶0和18∶1w9，皆占總量的37%以上。不同微生物類群的 PLFA在不同栽培年限藍莓根際土壤中存在顯著或極顯著差異，并且呈不同的變化趨勢。隨著栽培年限增加，物種豐富度降低，但種類變化不明顯，與栽培5 a的植株相比，栽培6 a的植株缺少16∶1w9細菌類型，栽培9 a的植株缺少a15∶0和16∶1w9細菌。

圖1 不同栽培年限藍莓根際土壤微生物種類差別Fig.1 Microorganism differences in rhizosphere soil of blueberries cultivated for different years

由圖2可知，除微生物種類有變化外，微生物總量也隨栽培年限的增加而逐漸降低：5 a>6 a>9 a。其中，放線菌總量隨栽培年限的增加而增加，呈完全直線性相關(guān)。與細菌、真菌相比，放線菌在各個樣本中相對較少，且栽培年限與細菌、真菌總量呈高度負相關(guān)，說明藍莓根際微生物群落主要由細菌和真菌構(gòu)成。與非栽培區(qū)土壤微生物相比，栽培區(qū)根際土壤中微生物的類型和總量都高，說明根際微生物對藍莓生長具有重要的影響。

如圖3所示，各類群的PLFA 在不同栽培年限藍莓根際土壤中存在差異，且種類和比例皆不相同。其中15∶0、i16∶0、16∶0、18∶2w6,9、18∶1w9、18∶0占生物總量的76.68%～73.02%。16∶0的豐富度最高，在各個樣品中占20.49%～27.49%，18∶1w9占16.38%～24.32%，18∶2w6,9占11.23%～17.56%，說明這3個類型是藍莓根際微生物的主要類群。

圖2 不同栽培年限藍莓根際土壤不同微生物類群PLFA的質(zhì)量分數(shù)(左)和所占比例(右)Fig.2 PLFA mass fraction(left) and proportion(right) of different microbial groups in rhizosphere soil of blueberries under different cultivating year

樣品中微生物菌群具有相似性，主要優(yōu)勢群體在不同栽培年限的藍莓根際土壤中普遍存在，隨栽培年限的增長，部分類群含量發(fā)生變化，但構(gòu)成沒有明顯差異，說明在不同栽培年限中，根際優(yōu)勢菌群的構(gòu)成具有穩(wěn)定性。相對非栽培區(qū)土壤，藍莓根際多4個類群，為a17∶0、i17∶1w5、7cy17∶0、9cy19∶0。因此，推測這 4 個類群可能是與藍莓生長有關(guān)的根際微生物，占生物總量的5.18%～6.57%，且隨著栽培年限的增加有上升趨勢，呈高度相關(guān)性，聯(lián)合a15∶0和16∶1w9可作為藍莓栽培年限的推測。

2.3 不同栽培年限藍莓根際微生物磷脂脂肪酸質(zhì)量分數(shù)與養(yǎng)分因子間的相關(guān)性分析

土壤養(yǎng)分相關(guān)因子與不同栽培年限藍莓根際土壤微生物總量、細菌、放線菌和真菌的PLFA 的相關(guān)系數(shù)存在差異。如表4所示，細菌總 PLFA 與有機質(zhì)、全氮呈極顯著負相關(guān)，與速效鉀呈極顯著正相關(guān)；放線菌總 PLFA 與速效鉀和有效磷呈顯著負相關(guān)，而與全氮有弱相關(guān)性；真菌總 PLFA 與有機質(zhì)、全氮呈極顯著負相關(guān)；微生物總量與土壤速效鉀有顯著相關(guān)性。

圖3 不同栽培年限藍莓根際土壤微生物磷脂脂肪酸的質(zhì)量分數(shù)(左)及所占比例(右)Fig.3 Mass fraction (left)and proportion (right)of phospholipid fatty acid biomarkers(PLFA) of microorganism in rhizosphere soil in different cultivated years of blueberries

項目 Item有機質(zhì)Organic matter速效鉀Rapidly available potassium有效磷Available phosphorus全氮Total nitrogen真菌 Fungus0.969-0.7460.4420.977放線菌 Actinomyces0.321-0.772-0.8720.157細菌 Bacteria-0.9540.9850.118-0.892微生物總量 Microorganism amount-0.5640.8820.706-0.417

3 討 論

土壤微生物是土壤中活的有機體，是最活躍的土壤肥力因子之一。細菌、放線菌、真菌是構(gòu)成土壤微生物的主要生物量，其組成和數(shù)量變化反映土壤生物活性水平。根際作為根系、土壤界面的一個微環(huán)境，是土壤-根系-微生物三者緊密結(jié)合且相互影響的場所，是物質(zhì)轉(zhuǎn)化的活躍區(qū)域[5]。通過改善根際微生態(tài)環(huán)境來促進植物的生長、提高植物抗性等方面的研究正日益受到人們的重視。根際中的有益微生物在增加土壤肥力、改善根際環(huán)境、促進根系生長和防治植物病害等方面均有積極的促進作用。根際內(nèi)生真菌與藍莓根系互利共生，從而影響藍莓的生長，劉鳳紅[4]研究表明，不同品種藍莓根系內(nèi)生真菌的群落組成和結(jié)構(gòu)存在一定差異，各菌屬在不同栽培品種藍莓根系內(nèi)的優(yōu)勢度不同，不同栽培品種藍莓根系內(nèi)生真菌區(qū)系結(jié)構(gòu)也不同，同一栽培品種在不同栽培地區(qū)其根系內(nèi)生真菌優(yōu)勢度、群落組成和結(jié)構(gòu)也存在一定差異。龔娜等[5]研究表明，不同菌根真菌影響藍莓根際微生物的數(shù)量和多樣性，通過改善根際微生態(tài)環(huán)境來改善植物的營養(yǎng)狀況和促進植物生長。目前，土壤中大多數(shù)微生物不可培養(yǎng)，本試驗采用PLFA技術(shù)測定活體微生物細胞膜中的磷脂脂肪酸(PLFAs)，通過分析PLFAs圖譜推測細菌、真菌和放線菌的組成關(guān)系。

在不同栽培年限的藍莓根際中，真菌/細菌：6 a>9 a>5 a，其與有機質(zhì)呈高度相關(guān)。根際微生物隨根齡變化顯著，但也有部分種屬在各根齡相同，如i17∶1w5為黃桿菌屬，不同根齡中始終保持在0.5～0.58。黃桿菌屬的占比與環(huán)境狀況密切相關(guān)，推斷此藍莓栽種過程中，土壤較少受到Cd和烴類等物質(zhì)的污染。假單胞菌(18∶1w7)能夠改善植物營養(yǎng)、促進植物生長，同時假單胞菌還能對土壤中的有毒物質(zhì)進行降解[32-34]，可作為一種理想的植物微生態(tài)制劑生產(chǎn)菌種進行開發(fā)。通過與土壤的理化指標相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)假單胞菌質(zhì)量分數(shù)與全氮、有效磷、有機質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)顯著相關(guān)，可以通過施加全氮、有效磷和有機質(zhì)等來提高假單胞菌的質(zhì)量分數(shù)，從而改善藍莓根際的生長環(huán)境。腐生真菌可以分解有機質(zhì)、改善土壤和提高植物的抗病性和抗逆性[35-37]，同時為其他生物提供硫、磷、鉀、鈣、鐵等礦物質(zhì)營養(yǎng)元素[39-40]，降解某些有毒物質(zhì)，保護環(huán)境[41]。分析AM真菌[37-38]、腐生真菌與土壤的理化指標，AM真菌和腐生真菌總量與有效磷具有高度相關(guān)性，從而可以通過增加土壤有效磷改變AM真菌和腐生真菌的量，改善藍莓根系生長環(huán)境，提高藍莓產(chǎn)量。

通過各微生物類群和土壤理化指標分析可知，藍莓根際微生物生長需要有效磷和速效鉀，特別是腐生真菌、AM真菌、18∶1w7等對植物生長有益的微生物。在藍莓栽培和種植過程中，可以通過提高磷肥和鉀肥的施加量來增加土壤中速效鉀和速效磷的質(zhì)量分數(shù)，有利于改善土壤有益微生物的生存環(huán)境，從而改善藍莓根際的生長環(huán)境，進一步提高藍莓的品質(zhì)和產(chǎn)量。