草莓土赤殼菌根腐病病原鑒定及生物學特性

申光輝，薛泉宏，趙 娟

(1. 西北農林科技大學 生命科學學院 ,陜西楊凌 712100；2. 西北農林科技大學 資源環(huán)境學院 ,陜西楊凌 712100；3.四川農業(yè)大學 食品學院，四川雅安 625014；4. 北京市農林科學院 植物保護環(huán)境保護研究所，北京 100097)

草莓酸甜可口，營養(yǎng)豐富，是中國廣泛栽培的重要小漿果。草莓根腐病是由土傳病原真菌及線蟲等因素單獨或共同引起的復合根部病害，世界范圍內已報道的草莓根腐病病原物多達20余種[1]。不同地區(qū)或同一地區(qū)不同年份生態(tài)條件的差異性，導致草莓根腐病優(yōu)勢致病菌種類往往存在較大的地域差異，已報道從中國河北、湖北、北京、安徽、河南和山東等地分離確定的草莓根腐病病原差異很大，包括擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis)[2-3]、鐮刀菌屬(Fusarium)[4-9]、絲核菌屬(Rhizoctonia)[6,10]、疫霉屬(Phytophthora)[6,11]和鏈格孢屬(Alternaria)[2-3,12]等，其中鐮刀菌屬致病菌的報道較多。

長安區(qū)是陜西省重要的草莓栽培主產區(qū)，草莓種植已有30多年時間，近年來隨著設施栽培的快速推廣發(fā)展，當地草莓根腐病害逐年加重，特別是連作田塊，嚴重危害草莓苗的健康生長，導致減產，甚至絕收，已成為制約當地草莓產業(yè)持續(xù)發(fā)展的重要瓶頸。而目前鮮見對引起該地草莓根腐病發(fā)生的具體病原的詳細報道。為查明該地區(qū)草莓根腐病發(fā)生的主要病原真菌種類，本研究對采集到的草莓根腐病株進行病原菌分離純化和柯赫氏法則驗證，采用形態(tài)學特征，結合rDNA-ITS序列分析進行病原菌鑒定，并探究其生物學特征，旨在為該地區(qū)草莓根腐病發(fā)生規(guī)律以及防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

草莓典型根腐病株于2010年4月采自西安市長安區(qū)。

1.2 病原菌的分離純化

用自來水沖洗草莓根腐病病株根系表面泥沙，選取發(fā)病根系，采用組織分離法進行病原菌的分離[13]：剪取病健交界根系組織，以φ=70%乙醇消毒10 s，再用1 g/L升汞表面消毒20 s，無菌水反復沖洗5次，切成1 cm長度根段，置于PDA培養(yǎng)基平板25 ℃ 培養(yǎng)2～3 d，待組織塊表面長出菌落并產孢后，采用單孢分離法獲得純培養(yǎng)物[13]，純化后的菌株轉接于PDA斜面，25 ℃培養(yǎng)7 d，4 ℃冰箱保存。

1.3 病原菌形態(tài)學鑒定

采用插片法將病原菌接種于PDA平板，25 ℃培養(yǎng)3～7 d，鏡檢觀察記錄病原菌菌絲、產孢構造及孢子形態(tài)特征。

1.4 病原菌致病性測定

將病原菌接種于PDA平板，25 ℃培養(yǎng)10 d，待大量產孢后用無菌水洗脫，采用血球板計數法計數，制備成濃度為1.8×106mL-1的孢子懸浮液。采用根部離體接種法和活體傷根接種法測定病原菌致病性。根部離體接種法[13]：取健康草莓植株，自來水沖洗根系，剪至長約4～6 cm小根段，浸于φ=70%乙醇溶液中消毒30 s，再用無菌水沖洗3次。將取自于同一草莓植株的小根段隨機分成兩組，置于皿底鋪有滅菌濾紙的無菌培養(yǎng)皿中，其中一組加入3 mL病原菌孢子懸浮液，另一組加等體積無菌水作為對照，于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察根段發(fā)病狀況，定期補水以保持皿內相對濕度≥85%?；铙w傷根接種法：選取根系發(fā)達程度較為一致的健康草莓苗，沖洗根系表面泥沙，無菌水反復沖洗3次，用無菌刀片切去根尖新生組織進行傷根處理后，移栽于裝有無菌蛭石的營養(yǎng)缽中，沿根莖部位灌入10 mL病原菌孢子懸液，以灌入10 mL無菌水作對照，于25 ℃下室內培養(yǎng)，常規(guī)方法進行管理，各處理均重復6株。觀察記錄病原菌侵染草莓離體根段情況和營養(yǎng)缽內草莓根系生長與發(fā)病情況。參照文獻[14]的病株分級方法：0級，根系健康無侵染褐變；1級，根系稍有侵染褐變，發(fā)病腐爛部分占全部根系比例<25%；2級，根系明顯腐爛褐變，發(fā)病腐爛部分占全部根系比例為25%～50%；3級，腐爛褐變根系占全部根系的51%～75%，并可見少量菌絲及孢子；4級，發(fā)病腐爛根系占全部根系的76%～90%，并產生大量孢子；5級，腐爛褐變根系占全部根系的比例>90%。病情指數(RDSI)=∑(Di×Ni)/(N×5) ×100，式中Di為病情級數，Ni為各病級株數，N為調查樣本數；5為最高病級。按照柯赫氏法則，從發(fā)病根系組織部位進行致病菌再分離，通過菌落特征和顯微特征進行比較，確定再分離菌株與接種病原菌是否相同。

1.5 病原菌分子生物學鑒定

采用CTAB法提取病原菌株基因組DNA，以ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4[15](5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)為引物，擴增rDNA-ITS片段。25 μL PCR體系：Taq酶0.2 μL，10倍Buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，ITS1/ITS4引物各1.0 μL， ddH2O 16.3 μL，DNA模板2.0 μL。反應程序：94 ℃預變性 3 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火40 s，72 ℃ 延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR擴增產物經20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測確認，送交生工生物工程(上海)股份有限公司進行純化并測序。登陸NCBI網站Nucleotide-nucleotide BLAST工具與GenBank數據庫中相似模式菌株序列進行比對，獲得同源性較高的真菌rDNA-ITS序列，采用MEGA 5.1軟件，鄰接法(Neighbor-joining method)構建系統發(fā)育樹[16]，自舉檢驗次數(Bootstrap)1 000次。結合病原菌形態(tài)特征，參考魏景超《真菌鑒定手冊》[17]及相關參考文獻[18-20]確定病原真菌分類地位。

1.6 病原菌生物學特性的測定

1.6.1 培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長的影響 病原菌接種于PDA培養(yǎng)基25 ℃培養(yǎng)3～5 d，沿菌落邊緣打取病原菌菌餅(直徑7.0 mm)，接于7種不同培養(yǎng)基平板中央[13]，25 ℃ 培養(yǎng)7 d后十字交叉法測量菌落直徑，每種培養(yǎng)基重復3次。

1.6.2 光照對病原菌菌絲生長的影響 設置24 h 全光照、12 h光照與12 h黑暗交替、24 h全黑暗3種不同的光照條件，按“1.6.1”方法將菌餅置于PDA平板培養(yǎng)并測量菌落直徑，各處理重復3次。

1.6.3 溫度對病原菌菌絲生長及孢子萌發(fā)的影響 設置20～35 ℃溫度條件，按“1.6.1”方法將菌餅置于PDA平板培養(yǎng)，每24 h測量菌落直徑，并計算菌絲平均生長速率。各溫度培養(yǎng)均重復3次。用馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基洗脫病原菌平板表面的孢子，制成孢子懸浮液，并調整至每個視野(15×10倍)25～30個孢子，采用懸滴法[13]測定各溫度條件下不同萌發(fā)時間的分生孢子萌發(fā)情況，并隨機鏡檢300個分生孢子萌發(fā)情況，計算分生孢子萌發(fā)率。

1.6.4 pH對病原菌菌絲生長及孢子萌發(fā)的影響 按“1.6.1”制備病原菌菌餅并接于不同pH的PDA平板中央，于25 ℃培養(yǎng)并測定菌落直徑，各處理均重復3次。用不同pH的PBS制備每視野(15×10倍)25～30個孢子的病原菌分生孢子懸浮液，25 ℃培養(yǎng)萌發(fā)，懸滴法[7]檢測萌發(fā)3 h和12 h的分生孢子萌發(fā)情況，并隨機鏡檢300個分生孢子，計算分生孢子萌發(fā)率。

1.6.5 分生孢子致死溫度測定 將病原菌分生孢子懸浮液分別置于35～50 ℃的恒溫水浴鍋中熱致死處理10 min，再置于25 ℃培養(yǎng)24 h，檢測分生孢子萌發(fā)情況，每處理隨機鏡檢300個分生孢子，計算分生孢子萌發(fā)率。

菌落平均生長速率(AGR)=(D-7)/d，式中D為菌落直徑大小(mm)，d為培養(yǎng)時間(以天表示)。

采用DPS 7.05軟件處理試驗數據，采用鄧肯氏(Duncan’s)新復極差法進行不同處理間差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 草莓根腐病病害癥狀

通過病害病情調查，發(fā)現長安區(qū)連作草莓根腐病始發(fā)于3月底至4月份，4月下旬達到病害盛發(fā)期，植株死亡率在60%以上，對草莓生產危害嚴重。病株相對健康植株矮小、分蘗數少、發(fā)病初期老葉變黃、發(fā)病后期全株葉片萎蔫枯死、病株根系枯萎壞死、新生須根不發(fā)達、根系表面呈褐色至黑色銹斑腐爛癥狀、表皮與木質部分嚴重分離(圖1-B)；而健康草莓植株新生毛細根發(fā)達，無腐爛褐變癥狀(圖1-A)。

A.健康草莓根系 Healthy strawberry roots; B.發(fā)病草莓根系 Symptoms on rot roots of strawberry

2.2 病原菌形態(tài)學鑒定

病原菌菌株CF9在PDA培養(yǎng)基上生長較為緩慢，菌落圓形，但邊緣不規(guī)則，培養(yǎng)初期邊緣菌絲呈乳白色絮狀絨毛狀，菌落由外向內從米黃色漸變至褐黃色，整體呈氈狀(圖 2-A)。菌絲無色有隔，直徑2.0～4.9 μm，以單?；蚍稚咦幼绞疆a大型分生孢子或小型分生孢子(圖2-B)，分生孢子無色、壁光滑，粘質狀。大型分生孢子(圖 2-C)圓柱狀，兩端鈍圓，直或彎曲，有1～3個橫隔膜，其中一隔膜分生孢子大小(20～40)μm×(5～10)μm，兩隔分生孢子大小(30～42)μm×(7～12)μm，三隔分生孢子大小(33～47)μm×(6～10)μm，偶見呈梨形的單胞小型分生孢子(17～37)μm×(5～9)μm，培養(yǎng)后期部分菌絲末端或中間細胞壁加厚形成厚垣孢子，成熟的厚垣孢子金黃色至棕褐色，單生或串生，近圓形，直徑8～14 μm(圖 2-D)。根據上述形態(tài)特性，將病原菌初步鑒定為土赤殼屬(Ilyonectriasp.)。

2.3 病原菌致病性測定

對草莓發(fā)病植株與健康植株根系及根域土壤真菌分離結果進行比較，可以發(fā)現，在發(fā)病植株樣品中分離獲得多株真菌，其中1株真菌菌株CF9在發(fā)病后期樣品中的數量占真菌總數的68.0%[21]，而在健康植株中并未分離到。初步認為該菌株為疑似病原菌。致病性測定結果表明，離體根段接種和活體傷根接種草莓植株均表現出與田間病株相似的根系腐爛癥狀(圖3)。由圖3-B可見，草莓根系受病原菌侵染后呈棕褐色至黑色，后期表皮呈現典型腐爛癥狀，部分根系表面有明顯淺褐色病原菌菌絲，而未接種離體根系腐爛褐變明顯低于接種根系(圖3-A)。由圖3-D可見，活體傷根接種處理草莓植株生長矮小，新生白色毛狀根數量減少，地上部葉片萎蔫癥狀明顯，而未接種對照植株根系相對較發(fā)達，毛狀根數量多(圖3-C)。由表1可知，未接種草莓根系(對照組)在離體狀態(tài)下僅有兩端小部分由于切傷而發(fā)生輕微褐變，其腐爛率和病情指數分別為13.2%和29.1，但根部離體接種處理草莓根系腐爛率和病情指數明顯高于對照組，分別達73.7%和73.0，表明病原菌分生孢子對草莓離體根系的侵染致腐能力較強?；铙w傷根未接種草莓植株根系腐爛率及病情指數分別為7.3%和17.9，而活體傷

A.PDA平板上菌落形態(tài) Colony of mycelia on PDA plate (5 d); B.分生孢子梗 Conidiophor；C.分生孢子 Macroconidia and microconidia; D.厚垣孢子 Chlamydospore

圖2草莓根腐病原真菌CF9形態(tài)特征
Fig.2MorphologicalcharacteristicsofIlyonectriamacrodidymaCF9

A.未接種離體草莓根段 Control roots in vitro; B.孢子懸浮液離體接種草莓根段 Rot roots inoculated with pathogen conidia suspension in vitro; C.活體對照草莓植株 Control strawberry plants; D.孢子懸浮液活體傷根接種草莓植株 Strawberry plants inoculated with pathogen conidia suspension

圖3 草莓根腐病病原真菌致病性Fig.3 Symptom of strawberry root rot caused by Ilyonectria macrodidyma CF9

根接種草莓植株根系腐爛率及病情指數顯著高于未接種對照，分別為57.7%和60.4，表明病原菌分生孢子對草莓活體根系也具有較強的侵染致腐能力。從上述2種致病性測定方法的根系病健交界處重新分離得到與接種病原菌相同的病原菌。

2.4 病原菌分子生物學鑒定

將病原菌菌株CF9的rDNA-ITS基因測序結果(GenBank登錄號：JN641882)提交GenBank數據庫進行BLAST比對分析，結果發(fā)現病原菌CF9與大雙孢土赤殼(Ilyonectriamacrodidyma) isolate REF202(GenBank登錄號：JN859422)的序列相似度高達99.79%，與模式菌株(N.macrodidyma) CBS 112615T(GenBank登錄號：AY677290)序列相似度達到99.76%，且均與其位于系統發(fā)育進化樹同一分支 (圖4)，并以100%的高支持率與其他(I.macrodidyma)聚為一支，而與其他近緣種距離較遠。結合形態(tài)學特征，確定引起陜西長安草莓根腐病的病原為土赤殼屬(Ilyonectria)大雙孢土赤殼(Ilyonectriamacrodidyma)，其無性型為大雙孢柱孢(Cylindrocarponmacrodidymum)。

2.5 病原菌生物學特性

2.5.1 培養(yǎng)基對菌絲生長的影響 由圖5可見，病原菌在不同培養(yǎng)基上的菌絲生長速度存在明顯差異。在CMA培養(yǎng)基上病原菌菌絲生長最快，培養(yǎng)至第7天時，菌落直徑可達58.17 mm，菌絲平均生長速率為7.31 mm/d。在PDA和PSA上病原菌氣生菌絲較發(fā)達，培養(yǎng)至第7天表面產生大量孢子，而在其他培養(yǎng)基上氣生菌絲稀疏，孢子產量較低，尤以CMA培養(yǎng)產孢最少。

圖4 基于rDNA-ITS序列的草莓根腐病原真菌CF9系統發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of Ilyonectria macrodidyma CF9 and related strains based on rDNA-ITS sequence

圖5 不同培養(yǎng)基上草莓根腐病原真菌CF9菌落直徑Fig.5 Colony diameter of pathogen strain CF9 on different growth media

2.5.2 光照對菌絲生長的影響 由圖6可知，病原菌CF9菌絲在不同光照條件生長速度存在明顯差異。在全黑暗(24D)條件下培養(yǎng)7 d菌落直徑最大，可達43.83 mm，菌絲平均生長速率為5.26 mm/d，顯著大于全光照(24L)和光暗交替(12L/12D)條件(P<0.05)，全光照和光暗交替之間無顯著差異(P>0.05)，全黑暗條件利于菌絲生長。

24L為24 h全光照 24L indicates 24 hours light;12L/12D為12 h光照與12 h黑暗交替 12L/12D indicates 12 hours light each day;24D為24 h全黑暗 24D indicates 24 hours darkness one day

圖6不同光照條件下草莓根腐病原真菌CF9菌落直徑
Fig.6ColonydiameterofpathogenstrainCF9underdifferentlighthours

2.5.3 溫度對菌絲生長及孢子萌發(fā)的影響 由圖7可見，草莓根腐病病原菌CF9在20～30 ℃ 范圍內均可生長。在25 ℃下菌落直徑最大，培養(yǎng)至第7天時，菌落直徑為52.7 mm。在35 ℃下菌落大小未見變化，未見菌絲生長。

由圖8可知，30 ℃條件下病原菌孢子萌發(fā)率最高，12 h孢子萌發(fā)率為68.0%，25 ℃ 12 h的孢子萌發(fā)率為66.2%。表明25～30 ℃是CF9孢子萌發(fā)的最適溫度。

2.5.4 培養(yǎng)基pH對菌絲生長及孢子萌發(fā)的影響 由圖9可知，培養(yǎng)基pH對病原菌菌絲生長速度影響顯著。病原菌CF9在培養(yǎng)基pH 3～8內均可生長，生長范圍較寬，其中菌絲在pH為4的培養(yǎng)基上生長蔓延最快，至第7天菌落直徑可達44.67 mm，菌絲平均生長速率為5.38 mm/d，表明菌絲生長嗜酸性。在培養(yǎng)基pH 5～7時菌落直徑差異不顯著(P>0.05)，菌絲生長速率略低于pH 4條件，第7天菌落直徑可達34.7～36.3 mm，菌絲平均生長速率為3.95～4.19 mm/d。

圖7 不同培養(yǎng)溫度下草莓根腐病原真菌CF9菌落直徑Fig.7 Colony diameter of pathogen under different temperatures

圖8 不同溫度下病原真菌CF9孢子萌發(fā)率Fig.8 Conidia germination rate of pathogen under different temperatures

圖9 不同培養(yǎng)基pH條件下原真菌CF9菌落直徑Fig.9 Colony diameter of pathogen under different pH conditions

由圖10可見，pH為5、6、7條件下病原菌孢子萌發(fā)率和芽管平均長度均高于其他pH條件，其中pH 7時最有利于孢子萌發(fā)及芽管伸長，培養(yǎng)3 h和12 h后，孢子萌發(fā)率分別為34.6%和94.8%，芽管平均長度分別可達33.8 μm和207.9 μm，芽管伸長速率為19.34 μm/h，表明中性偏酸環(huán)境利于病原菌CF9孢子萌發(fā)及芽管生長。

2.5.5 分生孢子致死溫度 由表2可知，病原菌CF9分生孢子在45 ℃條件下處理10 min即失去萌發(fā)能力，因此分生孢子的致死溫度為45 ℃，作用10 min。

圖10 不同pH條件下病原菌CF9孢子萌發(fā)率和芽管長度Fig.10 Conidia germination rate and germ tube length of pathogen under different pH values

溫度/℃ Temperature3540414243444550孢子萌發(fā)率/%Conidia germination rate 76.3±0.537.7±0.330.5±0.421.2±0.68.2±0.52.5±0.200

3 討 論

根腐病是長期危害中國各大草莓種植區(qū)的重要土傳根部病害。草莓根腐病的致病菌種類多，包括絲核菌屬、鐮刀菌屬、輪枝菌屬等20多種[1]。不同地域氣候及土壤栽培環(huán)境下主要致病菌種類往往不同，因此明確不同地域生產環(huán)境中導致草莓根腐病發(fā)生的主要致病菌是實現草莓栽培可持續(xù)發(fā)展的關鍵問題之一。而目前對陜西長安區(qū)草莓根腐病發(fā)生的主要病原種類尚不清楚，明確該地區(qū)草莓根腐病的病原對進行病害有效防控具有重要意義。本試驗基于病原菌形態(tài)學特征、rDNA-ITS序列分析及致病性測定，證明土赤殼屬大雙孢土赤殼(Ilyonectriamacrodidyma)是陜西省長安區(qū)草莓根腐病的主要病原菌，與已報道的國內其他地區(qū)草莓根腐病病原菌不同。土赤殼屬(IlyonectriaP. Chaverri & C. Salgado)及其無性型柱孢屬(CylindrocarponWollenw.)真菌分布廣泛，常見于木本和草本植物根內或土壤中[22]，屬于腐生真菌或弱寄生真菌，該屬大多數種類為植物病原菌，可引起根腐病和黑腐病等[23]。已有研究發(fā)現，土赤殼屬真菌(Ilyonectriaspp.)可導致葡萄藤黑腳病[18-19]、蘋果莖腐病[20]、高麗參銹腐病[24]、三七銹斑病[25]和獼猴桃根腐病[26]等多種作物病害的發(fā)生，但尚未見關于此菌引起草莓根腐病的報道。本研究在國內首次報道大雙孢土赤殼對草莓根系具有較強侵染能力，可引起連作草莓栽培過程中根腐病發(fā)生，而在國內其他地區(qū)尚未見報道，該病原菌是否來源于種苗或周邊其他栽培作物等問題尚需進一步研究。

病原菌的生物學特性與病害發(fā)生規(guī)律密切相關，是進行病害爆發(fā)預測與控制的前提。本研究表明，病原菌大雙孢土赤殼營養(yǎng)要求低，在所有供試培養(yǎng)基上均可生長，在CMA培養(yǎng)基上生長最快，但菌絲稀疏較薄，產孢能力弱，在其他培養(yǎng)基上生長速度無顯著差異；黑暗條件培養(yǎng)利于菌絲生長，菌絲最適生長溫度和pH分別為25 ℃和4，分生孢子最適萌發(fā)溫度和pH分別為30 ℃和7，這與長安地區(qū)4月份前后設施栽培環(huán)境條件較為一致。草莓是一種極易受連作影響的經濟作物，長期單一種植易導致土壤酸化等問題，給病原真菌提供更適宜的土壤環(huán)境，同時連作土壤肥料不平衡導致植株生長障礙，更易受病原菌侵染。因此，生產上降低棚內溫濕度，施用有機肥調節(jié)土壤酸堿度可能有助于減輕草莓根腐病發(fā)生。申光輝等[21]在開展本研究的同時，還從健康草莓植株根際土壤中分離獲得2株具有很好應用前景的防病促生真菌灰黃青霉素HF3和土曲霉HF7，并通過盆栽試驗發(fā)現其防效分別為53.0%和46.9%。