孕驢尿中雌激素類物質(zhì)的組成及活性

左曉佳，張蓉銀，柴 婷，高維明

(新疆畜牧科學(xué)院 畜牧業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，烏魯木齊 830000)

天然的雌激素類物質(zhì)最早是從馬尿中獲得的多種天然結(jié)合態(tài)雌激素的混合物，可以用于制備雌激素替代療法的藥物，對(duì)人體多種因雌激素缺乏而引起的更年期綜合疾病有較好療效，早在20世紀(jì)40年代，美國(guó)惠氏-艾爾斯特制藥公司生產(chǎn)的結(jié)合雌激素藥物倍美力就已經(jīng)正式上市使用[1-2]。而目前該類原料藥的來源基本都是孕期馬尿，其他動(dòng)物孕期尿液的研究鮮見報(bào)道。

馬屬動(dòng)物的消化器官構(gòu)造和代謝機(jī)能基本相同，理論上尿液中也應(yīng)包括雌激素代謝的所有中間產(chǎn)物，即雌激素結(jié)構(gòu)類似物。據(jù)世界糧油組織(FDA)統(tǒng)計(jì)，截至2013年，全球馬的存欄量5 977萬頭，驢4 353萬頭。中國(guó)養(yǎng)驢歷史悠久，家驢的遺傳多態(tài)性豐富[3]，據(jù)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局公布的2017年統(tǒng)計(jì)年鑒，截至2016年，中國(guó)馬的存欄量達(dá)到550.7萬頭，驢456.9萬頭，新疆地區(qū)馬存欄量達(dá)到89萬頭，驢54.6萬頭。因此，驢尿?qū)⑹谦@得天然雌激素類藥物的又一強(qiáng)勢(shì)來源，同時(shí)也將為農(nóng)牧民帶來極大的經(jīng)濟(jì)效益。鑒于此，本研究通過采集懷孕6個(gè)月孕驢的尿液，提取雌激素類似物，通過動(dòng)物試驗(yàn)檢測(cè)其活性，為孕驢尿的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

孕驢尿采自懷孕6個(gè)月的新疆驢(新疆沙灣縣隆源養(yǎng)殖合作社提供)；試驗(yàn)小鼠為50只SPF級(jí)昆明小鼠(新疆醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，雌性，18～19日齡，個(gè)體質(zhì)量12～16 g，以陰門未開作為未性成熟標(biāo)志。按小鼠個(gè)體質(zhì)量隨機(jī)分為5組，飼養(yǎng)在SPF級(jí)動(dòng)物房，保持12 h照明/12 h黑暗的光照周期，溫度(23±1)℃，濕度(60±10)%，自由飲水進(jìn)食。

雌激素標(biāo)準(zhǔn)品：雌酮硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品、馬烯雌酮標(biāo)準(zhǔn)品、17α-馬烯雌酮標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)USP公司)、雌二醇、雌三醇(中國(guó)食品藥品檢定研究院)；DH100大孔吸附樹脂(鄭州勤實(shí)科技有限公司)；陽性藥物：紅利來結(jié)合雌激素片(新疆新姿源生物制藥有限責(zé)任公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20090172)。

1.2 主要儀器

UPLC超高效液相色譜儀(Waters公司，美國(guó))；RM 2126 組織切片機(jī)(Leica公司，德國(guó))；LC-MS TQD三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀(Waters公司，美國(guó))。

1.3 方 法

1.3.1 雌激素類似物提取 采集到的孕驢尿低溫避光靜置6 h，10 000 r/min 離心后，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾去除不溶物，得到清澈明亮的黃色液體。采用固液萃取方式分離獲得雌激素類物質(zhì)的混合物[4-5]，用DH100大孔樹柱層析，流速6 mL/min，按填料體積∶上樣體積=1∶10上樣，乙醇洗脫。再使用UPLC超高效液相色譜C18柱分離樣品[6-7]，流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(磷酸二氫鉀)=30∶70溶液，流速0.4 mL/min。在紫外檢測(cè)器215 nm下檢測(cè)目標(biāo)產(chǎn)物峰。收集產(chǎn)物峰經(jīng)質(zhì)譜定性[8-9]。

1.3.2 純化產(chǎn)物活性檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[10-11]的方法對(duì)小鼠進(jìn)行處理。處理方式如下：試驗(yàn)小鼠分別用280、140、70 ng/g提取物進(jìn)行灌胃，每天給藥1次，以常規(guī)飼養(yǎng)為陰性對(duì)照組，陽性對(duì)照組用280 ng/g陽性藥物處理。

陰道開口時(shí)間及開口率：從第2天開始觀察陰道是否開口，記錄時(shí)間和數(shù)量，以開口>2 mm作為開口標(biāo)準(zhǔn)，最后計(jì)算陰道開口率。

子宮質(zhì)量及子宮系數(shù)：最后一次給藥24 h后用乙醚麻醉處死，解剖后稱量小鼠個(gè)體質(zhì)量及子宮質(zhì)量，計(jì)算公式為子宮系數(shù)=子宮質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。

陰道上皮組織切片：解剖后每組隨機(jī)選3只取陰道上皮組織(5 mm×5 mm×2 mm)，使用Bouin固定液(飽和苦味酸300 mL+甲醛100 mL+冰醋酸200 mL)固定5 h；用φ=50%酒精浸洗數(shù)次，之后逐級(jí)增加酒精體積分?jǐn)?shù)(60%～100%)，各體積分?jǐn)?shù)分別浸泡2 h至完全脫水；使用V(純酒精)∶V(二甲苯)=1∶1和二甲苯溶液

分別浸泡30 min進(jìn)行透明化處理；然后浸在溶解并保溫55 ℃的石蠟內(nèi)1 h，再將組織與石蠟一起包埋入包埋盒中，將組織待觀察面平鋪向下擺放好，并趕出氣泡；冷水中冷卻凝固后將蠟塊固定在切片機(jī)的持臘器上，以厚度5～7 μm 進(jìn)行切片；將較好的切片在40 ℃水浴中鋪展，然后固定在載玻片上于烘箱45 ℃烤干；經(jīng)HE染色(蘇木精5 min，伊紅2 min)，同樣上述方法脫水和透明化處理，之后用樹膠封固，加蓋蓋玻片，晾干后用顯微鏡觀察陰道上皮細(xì)胞的角質(zhì)化情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 22進(jìn)行顯著性分析和單因素方差分析，對(duì)差異顯著的數(shù)據(jù)用LSD和S-N-K法進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取純化試驗(yàn)中雌激素結(jié)構(gòu)類似物的結(jié)構(gòu)初步鑒定

避光靜置6 h后，經(jīng)0.22 μm避光微孔濾膜多次過濾，最后用透明橙黃色的液體作為純化原料最好，超過則會(huì)引起雌激素類化合物的降解或析出。從圖1可以看出，洗脫液在0.95 min有一個(gè)明顯的特征峰與圖2一致，對(duì)照混合標(biāo)準(zhǔn)品(包括雌酮硫酸鈉、17α-馬烯雌酮、馬烯雌酮、雌二醇、雌三醇)液相譜圖(圖3)可以發(fā)現(xiàn)，該峰有可能是馬烯雌酮峰。

圖1 洗脫液超高效液相譜圖Fig.1 UPLC spectrogram of eluent

圖2 紅利來結(jié)合雌激素藥物液相譜圖Fig.2 UPLC spectrogram of conjugated estrange drug Honglilai

鑒于此，分離該峰進(jìn)行質(zhì)譜分析，結(jié)果如圖4所示，可以明顯看出有一個(gè)質(zhì)核比為267.31的物質(zhì)響應(yīng)強(qiáng)烈，對(duì)比馬烯雌酮分子質(zhì)量可以斷定該物質(zhì)為馬烯雌酮的母離子，證實(shí)液相對(duì)比的分析結(jié)果，定量分析其質(zhì)量濃度為500 μg/mL。

圖3 混標(biāo)液相譜圖Fig.3 UPLC spectrogram of mixed standards

圖4 馬烯雌酮質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectrogram of equilin

2.2 純化產(chǎn)物活性評(píng)價(jià)

2.2.1 陰道開口時(shí)間及開口率 由表1可知，陽性對(duì)照組和處理組都從第3天給藥結(jié)束后，開始有陰道開口現(xiàn)象，之后逐天增加，而陰性對(duì)照組直到試驗(yàn)結(jié)束也未有陰道開口的小鼠出現(xiàn)。所有處理組小鼠無體質(zhì)量明顯減少或死亡等不良現(xiàn)象。

結(jié)果表明，在純化的雌激素結(jié)構(gòu)類似物作用下，小鼠呈明顯提前發(fā)育狀態(tài)，并且隨質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，陰道開口的小鼠數(shù)量呈明顯上升趨勢(shì)。280 ng/g組的開口率略低于陽性對(duì)照組。

2.2.2 子宮質(zhì)量及子宮系數(shù) 由表2可知，2 個(gè)指標(biāo)分析結(jié)果一致，4個(gè)給藥組與陰性對(duì)照組差異均極顯著(P<0.01)，陽性對(duì)照組和70 ng/g組差異極顯著(P<0.01)，與其他處理組差異不顯著，280 ng/g組和140 ng/g組與70 ng/g組差異顯著(P<0.05)。

2.2.3 陰道上皮細(xì)胞角質(zhì)化程度 小鼠性成熟后，陰道上皮細(xì)胞發(fā)生角質(zhì)化，并隨著角質(zhì)層的增厚出現(xiàn)脫落現(xiàn)象，因此，從小鼠陰道上皮細(xì)胞切片圖能直觀地看出陰道角質(zhì)化程度。從圖5可以看出，陰性對(duì)照組陰道上皮細(xì)胞完整，未見角質(zhì)化，陽性對(duì)照組角質(zhì)化明顯，各處理組均有較明顯的角質(zhì)化，甚至140 ng/g組程度比280 ng/g組和陽性對(duì)照組強(qiáng)烈。

表1 各組小鼠陰道開口狀態(tài)Table 1 Vaginal opening state of mice in each group

表2 子宮質(zhì)量及子宮系數(shù)顯著性分析Table 2 Significance analysis of uterine massand uterine coefficient

注：同列數(shù)據(jù)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note：Different lowercase letters in the same columns indicate significant difference (P<0.05), and uppercase letters indicate extremely significant difference (P<0.01).

3 討 論

目前，治療雌激素缺乏癥所使用的藥物主要是從孕馬尿中提取的結(jié)合雌激素，是多種天然固醇類結(jié)合態(tài)雌激素的混合物[1-2]。早在20世紀(jì)30年代就圍繞其開展多方面的研究。

中國(guó)驢種資源豐富，然而隨著社會(huì)進(jìn)步和運(yùn)輸業(yè)的快速發(fā)展，驢在中國(guó)大部分地方的役用地位明顯降低，主要驢品種種質(zhì)資源逐步退化，目前驢的飼養(yǎng)主要用于產(chǎn)皮、產(chǎn)肉、產(chǎn)奶，而尿液的利用研究鮮見報(bào)道。相較于馬，驢飲水量小，食量小，但纖維消化能力強(qiáng)，不易得消化器官疾病，對(duì)蛋白質(zhì)的吸收略低于反芻動(dòng)物，而高于馬、騾子。

圖5 陰道上皮組織切片圖Fig.5 Vaginal epithelial tissue slices

并且驢性成熟早，繁殖率比馬高，驢體內(nèi)雌激素的代謝率理論上比孕馬高，從其尿液中應(yīng)該能夠提取出更多的雌激素結(jié)構(gòu)類似物。

本研究發(fā)現(xiàn)，孕驢尿中的確含有雌激素結(jié)構(gòu)類似物并分離出馬烯雌酮，質(zhì)量濃度約為500 μg/mL，同時(shí)發(fā)現(xiàn)有少量17α-馬烯雌酮的脫氫化合物和雌二醇的脫水產(chǎn)物，具體結(jié)構(gòu)并不能確定，但已基本證實(shí)孕驢尿中同樣可以獲得雌激素結(jié)構(gòu)類似物的混合物。

本研究中隨提取物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，陰道開口率明顯呈上升趨勢(shì)，然而280 ng/g組的藥效比280 ng/g的陽性對(duì)照組略差，推測(cè)可能是由于提取物中除馬烯雌酮外，其他雌激素類似物的組成比例不同，協(xié)同效應(yīng)不同。同樣可以解釋陰道上皮細(xì)胞觀察到的角質(zhì)化結(jié)果，140 ng/g組角質(zhì)化比陽性對(duì)照組更明顯。子宮系數(shù)也證明140 ng/g和280 ng/g 組和陽性對(duì)照組均與陰性對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)，說明孕驢尿中獲得的雌激素結(jié)構(gòu)類似物同樣具有令小鼠性成熟提前的效果，可以考慮作為替代藥物來源。

試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，提取物與陽性藥物的藥效差異較小，而且140 ng/g組和280 ng/g組藥效差異不大，從成本考慮，孕驢尿中提取的雌激素類物質(zhì)將成為更低廉高效的原料藥物。然而從子宮質(zhì)量數(shù)據(jù)中也可以看出，提取物的子宮質(zhì)量低于陽性藥物組，從另一方面說明提取物的純度還有待提高，純化方法還有待優(yōu)化，混合物中除馬烯雌酮外其他組分的結(jié)構(gòu)還有待進(jìn)一步確認(rèn)。

4 結(jié) 論

發(fā)現(xiàn)孕驢尿中存在和孕馬尿中相似的成分，尿液原樣中含有馬烯雌酮500 μg/mL，此外還檢測(cè)到其他雌激素結(jié)構(gòu)類似物，具體結(jié)構(gòu)還有待證實(shí)。該提取物具使小鼠性成熟明顯提高的藥效。