煙堿型乙酰膽堿受體亞單位a5基因多態(tài)性與吸煙老年人肺癌的關(guān)系

解寶泉 黃 艷 張志艷 王 袁 郭 霞 王紅陽

(華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸科，河北 唐山 063000)

流行病學(xué)研究顯示肺癌以男性、吸煙病人居多，且發(fā)病年齡多在60歲以后，成為造成老年人死亡的第一位癌癥殺手〔1〕。肺癌發(fā)生是環(huán)境和遺傳因素協(xié)同作用的結(jié)果。研究顯示人類第15號(hào)染色體長(zhǎng)臂15q24-25區(qū)域上編碼的煙堿型乙酰膽堿受體的候選基因簇即尼古丁受體家族(CHRNA3-CHRNA5-CHRNAB4，CHRNA3/5)與吸煙行為導(dǎo)致肺部疾病密切相關(guān)，但有關(guān)煙堿型乙酰膽堿受體基因位點(diǎn)突變與肺癌的關(guān)系目前尚有爭(zhēng)議〔2，3〕。本研究采用病例對(duì)照研究方法，分析煙堿型乙酰膽堿受體亞單位a5(CHRNA5)-rs 17486278位點(diǎn)基因多態(tài)性與吸煙老年人肺癌的關(guān)聯(lián)性，為肺癌病因的研究提供流行病學(xué)依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象 2011年1月至2016年1月華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院確診的216例男性、吸煙的老年原發(fā)性肺癌患者為研究對(duì)象，年齡60～80歲；按照年齡±2歲、同性別進(jìn)行1∶3配對(duì)抽取健康體檢人群648例，后期采集血標(biāo)本基因測(cè)序過程中9例患者血液凝固未完成實(shí)驗(yàn)，被剔除，對(duì)照組樣本有效率98.6%，符合實(shí)驗(yàn)要求，對(duì)照組最終入組人群639例，年齡61～79歲。病例組入選標(biāo)準(zhǔn)：①病理組織學(xué)確診為原發(fā)性支氣管肺癌，參照WHO肺癌組織學(xué)分型標(biāo)準(zhǔn)分為鱗癌、大細(xì)胞癌、小細(xì)胞癌、腺癌、腺鱗癌及其他；②單一肺癌，未合并其他腫瘤；③知情同意。對(duì)照組入選標(biāo)準(zhǔn)：①與病例無血緣關(guān)系；②無慢性非傳染性疾病者；③知情同意。

1.2方法 由統(tǒng)一培訓(xùn)的調(diào)查員進(jìn)行面訪調(diào)查，現(xiàn)場(chǎng)回收問卷。

1.2.1一般資料 吸煙史(持續(xù)1年或1年以上者認(rèn)定為吸煙)、飲酒(平均每周飲白酒1兩及以上，或相當(dāng)酒精含量的其他酒類，并連續(xù)飲1年以上者)、工作環(huán)境(是否接觸有害物質(zhì)如長(zhǎng)期接觸醫(yī)源性X線、工作中煤塵、玻璃纖維、橡膠制品、塑料加工等)、是否合并慢性肺部疾病(如支氣管炎、慢性阻塞性肺部疾病、肺結(jié)核及塵肺等)、家族腫瘤史等。

1.2.2CHRNA5基因多態(tài)性 采集5 ml清晨空腹靜脈血標(biāo)本，置-80℃低溫冰箱貯存。按試劑盒說明書進(jìn)行DNA抽提(血液基因組提取試劑盒：BiomigaSanDiego，CA)。采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)檢測(cè)各基因各位點(diǎn)的基因型。操作流程：配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的瓊脂糖凝膠，內(nèi)含0.5 μg/ml的溴乙錠。取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μl加電泳載樣液少量(6倍上樣緩沖液)，120 V電壓泳動(dòng)30 min，于凝膠成像系統(tǒng)下觀察，根據(jù)PCR產(chǎn)物泳動(dòng)的距離，參照DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量泳動(dòng)的位置確定擴(kuò)增效果。將已擴(kuò)增出來的DNA產(chǎn)物用限制性酶進(jìn)行酶切后，判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的基因型。內(nèi)切酶NIaⅢ0.4 μl，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μl，10×NEB緩沖液1.2 μl，100×牛血清白蛋白(BSA)緩沖液0.12 μl，滅菌雙蒸水5.28 μl，混合后，置37℃水浴消化3 h。15 ml Tris硼酸(TBE)緩沖液中加入6 g瓊脂糖，電磁爐上加熱溶解，溶解后冷至60℃，加入2 μl EB染料，倒入已插入梳子的制膠槽中，待其冷卻凝固后待用。取5 μl酶切產(chǎn)物，加6倍上樣緩沖液少量，混合后，瓊脂糖凝膠電泳，電壓100 V，電泳60 min，于凝膠成像系統(tǒng)下觀察，根據(jù)條帶數(shù)(與標(biāo)準(zhǔn)分子量對(duì)照)確定其基因型。

1.2.3應(yīng)對(duì)方式 采用醫(yī)學(xué)應(yīng)對(duì)問卷(MCMQ)進(jìn)行評(píng)測(cè)。該量表共20個(gè)條目3個(gè)維度：面對(duì)、回避和屈服。20個(gè)條目均按1～4四級(jí)計(jì)分，其中第1，4，9，10，12，13，18，19條等8個(gè)條目需反評(píng)計(jì)分?！懊鎸?duì)”量表分由1，2，5，10，12，15，16，19 等條目分累計(jì)；“回避”量表分由3，7，8，9，11，14，17等條目分累計(jì)；“屈服”量表分由4，6，13，18，20等條目分累計(jì)。按各分量表的總分計(jì)分。通過對(duì)這3個(gè)分量的評(píng)分，計(jì)算各維度平均分值，平均分值/各維度滿分，計(jì)算出患者相對(duì)得分，以評(píng)估3類應(yīng)對(duì)策略，某分量表相對(duì)得分越高，表明個(gè)體越傾向于采用這種應(yīng)對(duì)方式。由于樣本量有限，將傾向于面對(duì)應(yīng)對(duì)方式確定為積極應(yīng)對(duì)，將回避、屈服應(yīng)對(duì)方式確定為消極應(yīng)對(duì)〔4〕。

1.2.4營(yíng)養(yǎng)認(rèn)知行為 根據(jù)最新公布的《中國居民膳食指南》，以胡倩倩等〔5〕研制營(yíng)養(yǎng)(K-A-P)問卷為藍(lán)本，修改其中有關(guān)孕婦的膳食理念為老年人膳食基本原則，修改孕婦營(yíng)養(yǎng)素來源為老年人常見疾病，包括癌癥與營(yíng)養(yǎng)素等。對(duì)老年人營(yíng)養(yǎng)知識(shí)、態(tài)度、行為調(diào)查。共30題，每題2 分共60分，≥40分判定營(yíng)養(yǎng)認(rèn)知行為良好，<40分為差〔5〕。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，兩組間樣本均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)，各相關(guān)因素與肺癌的關(guān)系用條件Logistic回歸模型行多因素統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1兩組相關(guān)因素比較 兩組年齡、文化程度、婚姻情況方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；兩組吸煙年限、每天吸煙量、是否飲酒、是否有腫瘤家族史、是否存在職業(yè)有毒物質(zhì)暴露危險(xiǎn)、是否合并肺部慢性疾病、應(yīng)對(duì)方式及營(yíng)養(yǎng)認(rèn)知行為方面，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組人群相關(guān)因素比較(n)

1)為t檢驗(yàn)，其他為χ2檢驗(yàn)；2)合并肺結(jié)核、慢性阻塞性肺疾病、塵肺等

2.2兩組CHRNA5-rs 17486278位點(diǎn)基因類型和基因頻率比較 兩組均可檢測(cè)到CHRNA5-rs 17486278位點(diǎn)基因片段，且符合Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)(P>0.05)。CHRNA5-rs 17486278位點(diǎn)基因型包括野生型(AA)、雜合變異型(AC)、純合變異型(CC)。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，病例組和對(duì)照組間該多態(tài)性位點(diǎn)基因型、各等位基因分布頻率之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.045，P=0.005；χ2=10.067，P=0.002)。見表2。

表2 兩組CHRNA5-rs 17486278位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較〔n(%)〕

2.3CHRNA5-rs 17486278位點(diǎn)基因多態(tài)性與原發(fā)性肺癌關(guān)聯(lián)性的多因素回歸分析 以是否發(fā)生肺癌為因變量y，以基因型(CC=1、AC=2、AA=0)、基因頻率(C等位=1、A等位=0)、文化程度(≥9年=1、<9=0)、配偶情況(無=1、有=0)、吸煙年限(≥25年=1、<25=0)、每天吸煙量(≥10支=1、<10支=0)、飲酒(否=1、是=0)、合并肺部疾病(是=1、否=0)、腫瘤家族史(否=1、是=0)、職業(yè)有毒物質(zhì)暴露(否=1、是=0)、應(yīng)對(duì)方式(積極=1、消極=0)和營(yíng)養(yǎng)認(rèn)知行為(良好=1、一般=0)為自變量進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示吸煙年限、每天吸煙量、合并肺部疾病和營(yíng)養(yǎng)認(rèn)知行為是吸煙老年人肺癌發(fā)生的影響因素(P<0.05)；CA和CC基因型、C等位基因頻率與原發(fā)性肺癌存在一定關(guān)聯(lián)性。見表3。

表3 CHRNA5基因-rs 17486278多態(tài)性與原發(fā)性肺癌關(guān)聯(lián)性的多因素Logistic回歸分析

2.4吸煙和 CHRNA5-rs 17486278位點(diǎn)基因的交互作用對(duì)肺癌發(fā)生的影響 進(jìn)一步應(yīng)用條件Logistic回歸分析，結(jié)果顯示吸煙年限、每天吸煙量與CHRNA5-rs 17486278位點(diǎn)基因多態(tài)性之間聯(lián)合作用對(duì)肺癌發(fā)生的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05) 。見表4。

表4 兩組吸煙和CHRNA5-rs 17486278位點(diǎn)基因交互作用的Logistic回歸分析

調(diào)整合并肺部慢性疾病、營(yíng)養(yǎng)認(rèn)知行為

3 討 論

目前國內(nèi)肺癌的發(fā)病率為每年增長(zhǎng)26.9%，死亡率居癌癥之首〔1〕。流行病學(xué)調(diào)查顯示肺癌發(fā)病危險(xiǎn)因素復(fù)雜，目前普遍認(rèn)為吸煙是肺癌的主要危險(xiǎn)因素，吸煙者發(fā)生肺癌的相對(duì)危險(xiǎn)度為2.5～10.0〔6〕。本研究以吸煙老年人為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)肺癌發(fā)生與吸煙年限和吸煙量密切相關(guān)，與目前國內(nèi)外報(bào)道〔6〕相似。肺癌的發(fā)生有一定家族聚集性，有惡性腫瘤家族史者肺癌風(fēng)險(xiǎn)上升〔7〕；具有呼吸系統(tǒng)疾病史尤其是慢性呼吸道炎癥可引起肺部免疫功能降低和局部氣管黏膜增生和鱗狀上皮化生等病變，使肺癌風(fēng)險(xiǎn)亦有一定程度地上升〔8〕。本研究未發(fā)現(xiàn)腫瘤家族史與肺癌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)，可能與本組病例均為老年人，對(duì)家族疾病史認(rèn)識(shí)或了解不清楚有關(guān)。本文發(fā)現(xiàn)良好的營(yíng)養(yǎng)認(rèn)知行為可使肺癌風(fēng)險(xiǎn)一定程度降低。合理的飲食行為可增加機(jī)體抗氧化能力、免疫能力，并有一定改善肺功能的作用，因而對(duì)肺癌的發(fā)生有一定的保護(hù)作用〔9〕。

流行病學(xué)研究顯示編碼煙堿型乙酰膽堿受體的CHRNA基因變異與肺癌發(fā)生相關(guān)，可能是肺癌發(fā)生的候選基因，例如Thorgeirsson等〔10〕在歐洲人群中發(fā)現(xiàn)CHRNA5基因簇上的rs 1051730、rs 8042374和rs 12914385多態(tài)性對(duì)肺癌的影響存在交互作用，但因研究的人群種族或樣本量等原因，Amos等〔11〕和Wei等〔12〕研究未得出相似的結(jié)論。本研究發(fā)現(xiàn)CHRNA5-rs 17486278位點(diǎn)基因多態(tài)與吸煙老年人肺癌有關(guān)，且CHRNA5-rs 17486278位點(diǎn)基因的變異與吸煙的年限和吸煙的量有關(guān)，這和李琴等〔13〕的研究結(jié)果相似，該作者通過回顧性研究發(fā)現(xiàn)每天吸煙量>15支者肺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)高于不吸煙者(OR=3.49，95%CI：2.29～5.32)，且吸煙與CHRNA5-rs 17486278位點(diǎn)基因的變異存在交互作用。研究已證實(shí)體外煙草中的主要成分尼古丁與肺癌細(xì)胞表面的煙堿型乙酰膽堿受體結(jié)合，可調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α、促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及腫瘤血管新生，同時(shí)誘導(dǎo)凋亡抑制基因，抑制肺癌細(xì)胞凋亡〔14，15〕。但減少煙草攝入能否抑制該位點(diǎn)基因突變，減少疾病的發(fā)生率，有待進(jìn)一步的研究。