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    運動預(yù)適應(yīng)通過間歇性缺血缺氧誘導(dǎo)細胞自噬參與早期心肌保護的研究

    2018-08-02 01:32:10孫其龍潘珊珊王家銀
    體育科學(xué) 2018年7期

    孫其龍,潘珊珊,黃 悅,王家銀,陸 矯

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    運動預(yù)適應(yīng)通過間歇性缺血缺氧誘導(dǎo)細胞自噬參與早期心肌保護的研究

    孫其龍,潘珊珊,黃 悅,王家銀,陸 矯

    上海體育學(xué)院 運動科學(xué)學(xué)院, 上海 200438

    目的:通過分析運動性心肌缺血缺氧與細胞自噬的關(guān)系,檢測自噬相關(guān)蛋白Beclin1/Bcl-2在早期運動預(yù)適應(yīng)(EEP)及保護期的變化,探討細胞自噬在EEP心肌保護效應(yīng)中的作用。方法:SD大鼠隨機分為對照組(C組)、早期運動預(yù)適應(yīng)組(EEP組)、力竭運動組(EE組)和早期運動預(yù)適應(yīng)+力竭運動組(EEP+EE組)。1)用化學(xué)發(fā)光免疫分析法(CLIA)檢測血漿cTnI含量,結(jié)合HE和HBFP相鄰切片染色,綜合評價心肌缺血缺氧的程度,驗證EEP心肌保護效應(yīng)。2)用免疫印跡和免疫熒光雙標法檢測并觀察Beclin1/Bcl-2的表達變化和解離程度。3)通過相關(guān)性分析評估運動性缺血缺氧與細胞自噬的關(guān)系。結(jié)果:1)與C組相比,EEP組血漿cTnI水平和MOD值均具有升高的趨勢(>0.05),且EE組和EEP+EE組升高具有顯著性(<0.05);與EE組相比,EEP+EE組cTnI水平和MOD值顯著降低(<0.05);與C組相比,其余各組心肌組織均顯示不同程度的缺血缺氧改變,HE染色嗜酸性增強部位與HBFP染色艷紅色陽性區(qū)域趨近一致。2)與C組相比,其余各組Beclin1均顯著升高(<0.05),Beclin1/Bcl-2解離程度增加(<0.05),而Bcl-2并無明顯變化;與EE組相比,EEP+EE組Beclin1/Bcl-2共定位程度顯著升高(<0.05)。3)各組IHA和IOD值均與Beclin1/Bcl-2共定位程度呈顯著負相關(guān)(<0.05)。結(jié)論:EP通過間歇性缺血缺氧可以誘導(dǎo)心肌細胞自噬,細胞自噬參與了EP對運動性心肌損傷的早期保護效應(yīng)。

    運動預(yù)適應(yīng);缺血缺氧;Beclin1;Bcl-2;細胞自噬;早期心肌保護

    反復(fù)短時間的大強度間歇有氧運動導(dǎo)致心肌間歇性相對間或絕對缺血缺氧,提高心肌耐受缺血缺氧的能力,減輕隨后長時間缺血缺氧所致的心肌損傷,這種通過運動誘導(dǎo)機體產(chǎn)生內(nèi)源性心肌保護效應(yīng)的方式稱為運動預(yù)適應(yīng)(exercise preconditioning,EP)[3,18,20,22]。研究發(fā)現(xiàn),EP的保護效應(yīng)與缺血預(yù)適應(yīng)(ischemic preconditioning,IP)類似,具有抗缺血/再灌注(ischemic/reperfusion,I/R)損傷的心肌保護效應(yīng),如減輕I/R損傷后心肌梗塞面積,降低惡性心率失常的發(fā)生率,預(yù)防心肌頓抑等[8,22]。本研究團隊曾發(fā)現(xiàn),EP具有抵抗異丙腎上腺素導(dǎo)致的急性心肌損傷[25],減輕力竭運動導(dǎo)致的運動性心肌損傷[11,24]。EP可以分為誘導(dǎo)期和保護期,通過反復(fù)短時間的大強度間歇有氧運動誘導(dǎo)早期和晚期兩個保護時相。早期EP(early exercise preconditioning,EEP)保護期在EP結(jié)束后即可產(chǎn)生,持續(xù)1~3 h,晚期EP(late exercise preconditioning,LEP)保護期在EP結(jié)束后12 h出現(xiàn),24~48 h達到高峰,持續(xù)24~72 h[3,14]。

    自噬是真核細胞內(nèi)特有的生命現(xiàn)象,可選擇性的將細胞內(nèi)衰老、損傷的細胞器或蛋白質(zhì),在溶酶體內(nèi)降解再利用的生理過程[2,9]。正常生理條件下,自噬通常維持在相對較低的水平,當細胞受到能量缺乏、氧化應(yīng)激、缺血缺氧等因素刺激時,自噬被激活,從而參與并維持細胞的存活以及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[9,15]。自噬的發(fā)生受多種信號通路的調(diào)控,有著復(fù)雜的分子機制,其中,Beclin1作為多種信號通路的匯集點,通過與Bcl-2相互作用發(fā)揮至關(guān)重要的調(diào)控作用[12]。在應(yīng)激因素刺激下,Beclin1/Bcl-2所保持的復(fù)合體形式解離,游離的Beclin1繼而發(fā)揮誘導(dǎo)自噬的功能[5]。研究發(fā)現(xiàn),自噬的發(fā)生與Beclin1表達上調(diào)和Bcl-2表達下調(diào)相關(guān)聯(lián),而Beclin1/Bcl-2比值也在一定程度上能夠反映自噬與凋亡的程度[19]。Peng等[23]為探討細胞自噬在缺血性心臟中的作用,發(fā)現(xiàn)IP能夠增強Beclin1/Bcl-2相互作用,誘導(dǎo)心肌細胞自噬減輕I/R損傷,參與了缺血性心臟的早期保護作用。馬曉雯等[1]在探討長期耐力訓(xùn)練對自噬相關(guān)因子Beclin1的影響時發(fā)現(xiàn),大強度運動訓(xùn)練可以增強大鼠心肌細胞自噬的活性,同時伴有Beclin1水平的明顯升高。萬棟峰等[3]研究了心肌線粒體自噬在EP晚期保護效應(yīng)中的作用,發(fā)現(xiàn)抑制細胞自噬后EP對運動性心肌損傷的晚期保護作用減弱,提示細胞自噬部分參與了EP的晚期心肌保護效應(yīng)?;谏鲜鲅芯勘尘埃狙芯考僭O(shè)EP通過間歇性缺血缺氧能夠誘導(dǎo)心肌細胞自噬,而細胞自噬可能參與了EP對運動性心肌損傷的早期保護效應(yīng)。本研究在EP動物模型的基礎(chǔ)上,采用相鄰切片HE和HBFP染色評價心肌缺血缺氧程度;通過相關(guān)性分析評估心肌缺血缺氧與細胞自噬的關(guān)系;采用血漿心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)檢測與HBFP染色驗證EP早期心肌保護效應(yīng);結(jié)合免疫印跡和免疫熒光雙標實驗,檢測并觀察自噬相關(guān)蛋白Beclin1/Bcl-2的表達變化和解離程度,探討細胞自噬在EP早期保護效應(yīng)中的作用,為EP心肌保護效應(yīng)及機制的研究提供新的實驗依據(jù)。

    1 研究材料與方法

    1.1 動物分組和運動實驗方案

    圖1 運動實驗方案示意圖

    Figure 1.Exercise Experimental Protocol

    1.2 動物取材

    采用10%水合氯醛(40 mg/100 g體重)對大鼠進行腹腔麻醉,將麻醉后的大鼠呈仰臥位固定于解剖臺上,打開腹腔,下腔靜脈取血5 mL,用于cTnI含量檢測。每組隨機取10只大鼠進行灌注固定,打開胸腔,暴露心臟,于心尖處插入灌注針頭,先注入1%肝素2 mL,再快速灌注0.85%生理鹽水約250 mL,并迅速剪斷下腔靜脈。待流出液基本無血色后,換滴4%多聚甲醛約250 mL,整個灌注過程大約持續(xù)30 min。灌注結(jié)束后取出心臟,入4%多聚甲醛后固定24 h。常規(guī)石蠟包埋,制作相鄰切片,用于HE染色、HBFP染色和免疫熒光雙標實驗。每組其余10只大鼠麻醉取血后,打開胸腔,取出心臟,-80℃保存,用于免疫印跡實驗。

    1.3 血漿cTnI 含量檢測

    用化學(xué)發(fā)光免疫分析法(chemiluminescent immunoas-say, CLIA)檢測大鼠血漿cTnI含量。CLIA是一種雙抗體一步夾心免疫酶檢測方法,采用堿性磷酸酶標記的單克隆cTnI IgG抗體試劑與樣本短暫孵育后,加入順磁性微粒作為固相載體與樣本中cTnI結(jié)合,再加入化學(xué)發(fā)光底物(Lumi-Phos*530),用光度計測量發(fā)光量,發(fā)光量與cTnI的濃度成正比,采用Beckman Coulter公司的Access 2免疫分析系統(tǒng)進行測定,線性范圍為0.02~100 ng/mL。

    1.4 心肌組織相鄰切片HE和HBFP染色

    用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining,HE)染色觀察心肌細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu),其嗜酸性增強用于顯示缺血缺氧的心肌組織。用蘇木素-堿性復(fù)紅-苦味酸(hematoxylin basic fuchsin picric staining,HBFP)染色特異性顯示心肌組織的缺血缺氧變化,正常心肌組織被染成棕黃色,而缺血缺氧的心肌組織則被染成艷紅色。用HE和HBFP染色的相鄰切片綜合評價心肌組織缺血缺氧的程度。使用Leica(RM2235)切片機進行連續(xù)切片,用心肌組織相鄰切片分別進行常規(guī)HE染色和HBFP染色。HBFP染色切片常規(guī)脫蠟至水,蘇木素染液浸染5 min,1%鹽酸酒精分化3 s,用0.1%堿性復(fù)紅液浸染3 min,去離子水沖洗后丙酮漂洗30 s,0.1%苦味酸純丙酮浸染40 s,脫水透明后,中性樹膠封片。

    1.5 心肌組織HBFP染色圖像采集與處理

    每組隨機選取5張HBFP染色切片,每張切片隨機選取5個視野,每組共測25個視野,使用Olympus(BX60)顯微鏡進行形態(tài)學(xué)觀察,DP70數(shù)碼攝影裝置采集圖像,使用Image-ProPlus 6.0圖像分析軟件進行圖像處理。在同一放大倍數(shù)下(×400),測定缺血缺氧面積(ischemia-hypoxia area,IHA)與積分光密度(integral optical density,IOD),并計算平均光密度(mean optical density,MOD),以表示單位面積內(nèi)缺血缺氧損傷的程度(MOD=IOD/ IHA)。

    1.6 心肌組織Beclin1/Bcl-2免疫印跡實驗

    用免疫印跡實驗檢測心肌組織Beclin1/Bcl-2的表達變化。大鼠心肌組織提取總蛋白,BCA法檢測并調(diào)整蛋白濃度。加入上樣緩沖液,100℃恒溫加熱10 min使蛋白變性。SDS凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜后,5%脫脂奶粉封閉2 h。分別孵育一抗(小鼠抗大鼠Beclin1,美國Santa Cruz公司,sc-11427,1:1 000;兔抗大鼠Bcl-2,美國Santa Cruz公司,sc-492,1:1 000),4℃過夜。加HRP標記的二抗,室溫孵育1 h。滴加發(fā)光液后,采用Fusion FX全自動化學(xué)發(fā)光成像圖像獲取系統(tǒng)進行曝光顯影,采用Image J分析軟件測定Beclin1、Bcl-2及內(nèi)參GAPDH的條帶灰度值。

    1.7 心肌組織Beclin1/Bcl-2免疫熒光雙標實驗

    用免疫熒光雙標實驗觀察Beclin1/Bcl-2熒光強度及共定位程度。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,微波熱修復(fù)20 min。山羊血清封閉20 min后,加入Beclin1/Bcl-2混合一抗(小鼠抗大鼠Beclin1,美國Santa Cruz公司,sc-11427,1:200;兔抗大鼠Bcl-2,美國Santa Cruz公司,sc-492,1:200),4℃孵育過夜。滴加Alexa Fluor 647(紅)、Alexa Fluor 488(綠)標記的混合二抗(Alexa Fluor 647標記山羊抗小鼠IgG,美國abcam公司,ab150111,1:400;Alexa Fluor 488標記山羊抗兔IgG,美國abcam公司,ab150081,1:400),37℃溫箱孵育60 min。DAPI染核,5 min后流水沖洗終止反應(yīng),PVP防熒光淬滅劑封片。采用Zeiss LSM700激光共聚焦顯微鏡觀察并采集圖像。每組隨機選取5張切片,每張切片隨機選取5個視野,每組共測25個視野,在同一放大倍數(shù)下(×400),用Zen 2012(black version)計算機圖像分析軟件分析熒光強度和共定位程度。熒光強度反映Beclin1/Bcl-2蛋白的表達變化情況,共定位程度反映Beclin1/Bcl-2復(fù)合體的解離情況。

    1.8 心肌組織缺血缺氧與Beclin1/Bcl-2共定位程度的相關(guān)性

    采用HBFP染色中IHA和IOD值,分別與免疫熒光雙標實驗中Beclin1/Bcl-2共定位程度進行相關(guān)性分析,評估心肌組織缺血缺氧與細胞自噬的關(guān)系。每組隨機選取5張HBFP染色切片,每張切片隨機選取5個視野,每組共測25個視野,使用Olympus(BX60)顯微鏡進行形態(tài)學(xué)觀察,DP70數(shù)碼攝影裝置采集圖像,使用Image-ProPlus 6.0圖像分析軟件進行圖像處理,測定IHA和IOD值。每組選取5張免疫熒光雙標相鄰切片,每張切片選取相對應(yīng)的5個視野,每組共測25個視野,使用Zeiss LSM700激光共聚焦顯微鏡觀察并采集圖像,采用Zen 2012(black version)計算機圖像分析軟件測定Beclin1/Bcl-2共定位程度。每組IHA和IOD值與Beclin1/Bcl-2共定位測定值相對應(yīng),進行相關(guān)性分析。

    1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

    實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行處理,實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差(M±SD)表示,采用單因素方差分析(one-way ANOVA)檢驗進行組間比較,相關(guān)性分析用CORRELATE中Bivariate檢驗,以<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 實驗結(jié)果

    2.1 血漿cTnI含量檢測結(jié)果

    大鼠血漿cTnI含量檢測結(jié)果顯示(表1),與C組相比,EEP組大鼠血漿cTnI水平有升高的趨勢(>0.05),且EE組和EEP+EE組升高具有顯著性(<0.05);與EE組相比,EEP+EE組血漿cTnI水平顯著降低(<0.05)。

    表 1 大鼠血漿cTnI水平變化

    注:*表示與C組相比<0.05;#表示與EE組相比<0.05,下同。

    2.2 心肌組織相鄰切片HE和HBFP染色結(jié)果

    大鼠心肌組織相鄰切片HE和HBFP染色結(jié)果顯示(圖2),HE染色中C組心肌細胞輪廓界限清晰,細胞核呈卵圓形,被染為淡藍色,細胞質(zhì)著色均勻,被染為淡紅色,未見嗜酸性增強區(qū)域(圖2-A);EEP組心肌細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)與C組相似,偶有心肌細胞出現(xiàn)嗜酸性增強的現(xiàn)象(圖2-B);EE組大量心肌細胞出現(xiàn)嗜酸性增強的現(xiàn)象(圖2-C);EEP+EE組少部分心肌細胞出現(xiàn)了嗜酸性變化,較EE組明顯減少(圖2-D)。HBFP染色中正常心肌組織被染為棕黃色,缺血缺氧心肌組織被染為艷紅色;C組心肌細胞輪廓清晰,細胞核被染為淡紫藍色,未見艷紅色陽性區(qū)域(圖2-E);EEP組偶有心肌細胞出現(xiàn)斑點狀的艷紅色陽性區(qū)域(圖2-F);EE組中大量心肌細胞出現(xiàn)艷紅色陽性區(qū)域(圖2-G);EEP+EE組部分心肌細胞出現(xiàn)了團塊狀艷紅色陽性改變,較EE組明顯降低(圖2-H)。在HE染色和HBFP染色的相鄰切片上,從缺血缺氧損傷區(qū)域的位置比照中發(fā)現(xiàn),各組HE染色嗜酸性增強部位與HBFP染色艷紅色陽性區(qū)域趨近一致(圖2)。

    圖2 大鼠心肌組織相鄰切片HE和HBFP染色結(jié)果圖(×400)

    Figure 2. Results of HE and HBFP Staining of Adjacent Slices in Rats Myocardium(×400)

    2.3 心肌組織HBFP染色圖像分析結(jié)果

    心肌組織HBFP染色圖像分析結(jié)果顯示(表2),心肌組織IHA和IOD值變化趨勢相似,用MOD值表示各組大鼠心肌組織中單位面積內(nèi)缺血缺氧的程度。與C組相比,EEP組MOD值具有升高的趨勢(>0.05),且EE組和EEP+EE組升高具有顯著性(<0.05);與EE組相比,EEP+EE組MOD值明顯降低,差異具有顯著性(<0.05)。

    2.4 心肌組織Beclin1/Bcl-2免疫印跡檢測結(jié)果

    大鼠心肌組織Beclin1免疫印跡檢測結(jié)果顯示(圖3),與C組相比,其余各組Beclin1蛋白水平均明顯升高,差異具有顯著性(<0.05);Bcl-2免疫印跡檢測結(jié)果顯示(圖4),各組Bcl-2蛋白水平無顯著性變化;Beclin1/Bcl-2比值結(jié)果顯示(圖5),與C組相比,EEP組Beclin1/Bcl-2比值具有升高的趨勢(>0.05),且EE組、EEP+EE組升高具有顯著性(<0.05)。

    表2 大鼠心肌組織HBFP染色結(jié)果圖像分析

    注:*與C組相比<0.05;#與EE組相比<0.05。

    圖3 大鼠心肌組織Beclin1水平變化圖

    Figure3. Change of Beclin1 Level in Rats Myocardium

    圖4 大鼠心肌組織Bcl-2水平變化圖

    Figure4. Change of Bcl-2 Level in Rats Myocardium

    圖5 大鼠心肌組織Beclin1/Bcl-2水平變化圖

    Figure5. Change of Beclin1/Bcl-2 Level in Rats Myocardium

    2.5 心肌組織Beclin1/Bcl-2免疫熒光雙標結(jié)果

    大鼠心肌組織Beclin1/Bcl-2免疫熒光雙標檢測結(jié)果顯示(圖6),Beclin1被標記為紅色熒光,Bcl-2被標記為綠色熒光,二者的共定位重疊區(qū)域為黃色,均散在分布于胞質(zhì)中,細胞核被DAPI標記為藍色。與C組(圖6-A)相比,EEP組(圖6-B)、EE組(圖6-C)、EEP+EE組(圖6-D)Beclin1紅色熒光強度均有不同程度的增加,而黃色共定位區(qū)域則均有不同程度的降低,提示,EEP組、EE組和EEP+EE組Beclin1蛋白表達升高,Beclin1/Bcl-2復(fù)合體解離程度加強;與EE組(圖6-C)相比,EEP+EE組(圖6-D)紅色熒光強度減弱,而黃色共定位區(qū)域增多,提示,EEP+EE組Beclin1蛋白表達降低,Beclin1/Bcl-2復(fù)合體解離程度降低。

    圖6 大鼠心肌組織Beclin1和Bcl-2免疫熒光雙標實驗結(jié)果圖(×400)

    Figure 6. Double Immunotluorescence Results of Beclin1 and Bcl-2 in Rats Myocardium(×400)

    Beclin1熒光強度結(jié)果顯示(圖7),與C組相比,其余各組Beclin1熒光強度均顯著升高(<0.05)。Bcl-2熒光強度結(jié)果顯示(圖8),各組Bcl-2熒光強度無顯著性差異。Beclin1/Bcl-2共定位程度結(jié)果顯示(圖9),與C組相比,其余各組Beclin1/Bcl-2共定位程度均明顯降低,差異具有顯著性(<0.05);與EE組相比,EEP+EE組Beclin1/Bcl-2共定位程度則顯著升高(<0.05)。

    圖7 大鼠心肌組織Beclin1熒光強度柱狀圖

    Figure 7. Intensity of Beclin1 in Rats Myocardium

    圖8 大鼠心肌組織Bcl-2熒光強度柱狀圖

    Figure 8. Intensity of Bcl-2 in Rats Myocardium

    圖9 大鼠心肌組織Beclin1/Bcl-2共定位程度柱狀圖

    Figure 9. Colocalization of Beclin1/Bcl-2 in Rats Myocardium

    2.6 心肌組織缺血缺氧與Beclin1/Bcl-2共定位程度相關(guān)性

    大鼠心肌組織HBFP染色IHA和IOD值與免疫熒光雙標Beclin1/Bcl-2共定位程度的相關(guān)分析結(jié)果顯示(圖10),EEP組(圖10-a)大鼠心肌組織IHA值與Beclin1/Bcl-2共定位程度高度負相關(guān)(=-0.783,<0.05),IOD值與Beclin1/Bcl-2共定位程度高度負相關(guān)(=-0.772,<0.05);EE組(圖10-b)大鼠心肌組織IHA值與Beclin1/Bcl-2共定位程度高度負相關(guān)(=-0.905,<0.05),IOD值與Beclin1/Bcl-2共定位程度高度負相關(guān)(=-0.912,<0.05);EEP+EE組(圖10-c)大鼠心肌組織IHA值與Beclin1/Bcl-2共定位程度高度負相關(guān)(=-0.861,<0.05),IOD值與Beclin1/Bcl-2共定位程度之間高度負相關(guān)(=-0.853,<0.05)。以上結(jié)果顯示,EEP組(圖10-a)、EE組(圖10-b)、EEP+EE組(圖10-c)IHA和IOD值與Beclin1/Bcl-2共定位程度之間,均存在高度負相關(guān)關(guān)系,提示,隨著缺血缺氧損傷程度的升高,Beclin1/Bcl-2復(fù)合體解離,更多游離的Beclin1參與了自噬發(fā)生的誘導(dǎo)作用,心肌細胞自噬水平也因此升高。

    3 討論

    3.1 運動預(yù)適應(yīng)通過間歇性缺血缺氧誘導(dǎo)心肌細胞自噬

    運動作為一種強烈的刺激因素,極大地提高了心肌耗氧量,導(dǎo)致心肌相對間或絕對缺血缺氧[11]。HE染色便于對心肌組織結(jié)構(gòu)全面觀察,以往也常用心肌細胞的嗜酸性增強間接顯示心肌組織的缺血缺氧,但其不具備特異性。HBFP染色是顯示心肌組織早期缺血缺氧的形態(tài)學(xué)方法,顯示心肌組織的缺血缺氧具有特異性,因此,長期以來本研究團隊采用HBFP染色方法,用于評價心肌組織的缺血缺氧改變。本次實驗采用HE染色和HBFP染色的相鄰切片,綜合評價心肌組織缺血缺氧的改變程度。結(jié)果顯示,與C組相比,其余各組HE染色中,心肌組織均出現(xiàn)了不同程度嗜酸性增強的現(xiàn)象;HBFP染色中心肌組織同樣出現(xiàn)了不同程度的艷紅色陽性區(qū)域,EEP組MOD值具有升高的趨勢,且EE組和EEP+EE組升高具有顯著性;在相鄰切片的基礎(chǔ)上,通過心肌組織缺血缺氧區(qū)域的位置比照,本研究發(fā)現(xiàn),各組HE染色中嗜酸性增強部位與HBFP染色中艷紅色陽性區(qū)域趨近一致。這提示,不論是EEP及EEP保護期,還是一次大強度力竭運動,均導(dǎo)致大鼠心肌組織發(fā)生不同程度的缺血缺氧改變。

    Beclin1是介導(dǎo)哺乳動物自噬的基因,對于自噬的發(fā)生有著重要的促進作用。Bcl-2是一種抗凋亡基因,可通過與Beclin1相互作用影響自噬過程[12]。在正常生理條件下,Bcl-2與Beclin1以蛋白復(fù)合體形式存在,由此抑制了Beclin1誘導(dǎo)自噬的功能[5]。但當細胞受到應(yīng)激因素刺激時,Beclin1/Bcl-2復(fù)合體解離,游離的Beclin1繼而與PI3KC3結(jié)合形成新的復(fù)合體,從而誘導(dǎo)細胞自噬的發(fā)生[4]。研究發(fā)現(xiàn),自噬的發(fā)生與Beclin1表達上調(diào)和Bcl-2表達下調(diào)相關(guān)聯(lián),而Beclin1/Bcl-2比值也在一定程度上能夠反映凋亡與自噬的程度[19]。Huang等[13]在探討細胞自噬與IP心臟保護效應(yīng)的關(guān)系時,發(fā)現(xiàn)IP能夠激活心肌細胞自噬,并能有效減小I/R后心肌梗死面積。Yuan等[26]在EP心肌保護效應(yīng)的研究中發(fā)現(xiàn),EP可以減輕一次大強度力竭運動所致的心肌缺血缺氧損傷,同時伴有自噬相關(guān)蛋白的明顯變化。為進一步探討心肌缺血缺氧與細胞自噬的關(guān)系,本研究特別采用免疫熒光雙標實驗檢測Beclin1/Bcl-2共定位程度,并分別與HBFP染色中的IHA和IOD值進行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示,EEP組、EE組和EEP+EE組中,IHA和IOD值均與Beclin1/Bcl-2共定位程度呈顯著負相關(guān)關(guān)系,提示,隨著心肌缺血缺氧程度的升高,Beclin1/Bcl-2復(fù)合體解離,更多游離的Beclin1參與了自噬發(fā)生的誘導(dǎo)作用,心肌細胞自噬水平也因此升高。此結(jié)果進一步提示,不論是EEP及EEP保護期,還是一次大強度力竭運動,均可通過缺血缺氧誘導(dǎo)心肌細胞自噬。

    圖10 大鼠心肌組織缺血缺氧與Beclin1/Bcl-2共定位程度相關(guān)分析圖

    Figure 10. The Correlation between the Ischemia-hypoxia and the Colocalization of Beclin1/Bcl-2 in Rat Myocardium

    3.2 細胞自噬參與運動預(yù)適應(yīng)早期心肌保護效應(yīng)

    EP早期保護效應(yīng)已被較多研究所證實。Parra等[22]在EP結(jié)束10 min后對狗進行的I/R中發(fā)現(xiàn),心肌梗死面積相比對照組減少了76%,提示,EP誘導(dǎo)的早期保護效應(yīng)可以減輕I/R損傷。Shen等[24]探討EP心肌保護作用時,在EP結(jié)束后30 min對大鼠進行了一次大強度力竭運動,發(fā)現(xiàn)EP可以明顯減輕力竭運動所致的心肌損傷,對運動性心肌損傷產(chǎn)生了早期保護作用。cTnI是心肌細胞特有的結(jié)構(gòu)蛋白,對心肌損傷具有較高的特異性、敏感性以及較長的窗口期,現(xiàn)已成為診斷心肌損傷的“金標準”。Eijsvogels等[7]在運動強度與cTnI釋放量關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn),運動員血液中cTnI含量與運動強度之間存在顯著正相關(guān)關(guān)系。本研究在EP結(jié)束30 min后,對大鼠進行一次大強度力竭運動,采用血漿cTnI檢測與HBFP染色相結(jié)合的方法,從血液和形態(tài)學(xué)方面綜合評價心肌損傷與保護程度。結(jié)果顯示,與EE組相比,EEP+EE組血漿cTnI水平和MOD值均顯著降低,進一步證實EP可以提高心肌耐受缺血缺氧的能力,減輕心肌在一次大強度力竭運動中的缺血缺氧損傷,對運動性心肌損傷具有早期保護作用。

    細胞自噬可能是EP參與心肌保護的機制之一。Gurusamy等[10]在自噬相關(guān)蛋白BAG-1與IP心臟保護效應(yīng)的研究中發(fā)現(xiàn),IP誘導(dǎo)了Beclin1表達升高的細胞自噬,參與了I/R所致心肌損傷的保護作用。Mcginnis等[21]在探討EP對心肌I/R損傷的保護作用時,對小鼠進行速度為18 m/min的跑臺運動,發(fā)現(xiàn)EP同樣減輕了心肌I/R損傷,同時增強了自噬相關(guān)蛋白的活性,但并未發(fā)現(xiàn)Beclin1發(fā)生顯著性變化。本研究對大鼠進行速度為30 m/min的大強度跑臺運動,采用免疫印跡與免疫熒光雙標實驗相結(jié)合的方法,綜合評價Beclin1/Bcl-2的表達變化和解離程度。結(jié)果顯示,與C組相比,其余各組Beclin1蛋白水平均顯著升高,Beclin1/Bcl-2共定位程度顯著降低,同時,Beclin1/Bcl-2比值有升高趨勢,且EE組和EEP+EE組升高具有顯著性,提示,不論是EEP及EEP保護期,還是一次大強度力竭運動,均可促使Beclin1蛋白表達的升高,促進Beclin1/Bcl-2復(fù)合體解離,并有效上調(diào)心肌細胞自噬水平。本研究免疫熒光雙標實驗結(jié)果顯示,與EE組相比,EEP+EE組Beclin1/Bcl-2共定位程度顯著升高,提示,在EP早期心肌保護效應(yīng)中,Beclin1表達升高的細胞自噬部分參與了EP對運動性心肌損傷的保護作用。

    自噬在心血管應(yīng)激中是把“雙刃劍”,適度自噬有助于細胞保護和生存,但自噬過度或自噬缺陷將導(dǎo)致細胞損傷或死亡。有研究表明,在一定條件下自噬可以轉(zhuǎn)化為自噬性細胞凋亡[17]。Liu等[16]探討了細胞自噬在不同強度運動中的作用,發(fā)現(xiàn)隨著運動強度的增加,細胞自噬和凋亡程度均明顯升高,超負荷運動會使大鼠心肌細胞自噬體數(shù)量增加,凋亡細胞增多,同時伴有Beclin1表達升高和Bcl-2/Bax比值的下降。Meyer等人[6]認為,在應(yīng)激刺激的初始階段,自噬可通過維持細胞內(nèi)能量穩(wěn)態(tài)參與細胞的保護作用,但隨著刺激強度的增加,自噬角色可能會在細胞保護和損傷之間發(fā)生切換。本研究結(jié)果提示,不論是EEP及EEP保護期,還是一次大強度力竭運動,均可通過缺血缺氧誘導(dǎo)心肌細胞自噬,但EEP本身并未導(dǎo)致明顯的心肌損傷,且EEP誘導(dǎo)的細胞自噬參與了EP對力竭所致的心肌損傷的早期保護作用。一次大強度力竭運動導(dǎo)致明顯的心肌損傷,其誘導(dǎo)的心肌細胞自噬是進一步減輕心肌損傷,還是使心肌損傷程度進一步加重,尚待深入探討。

    4 結(jié)論

    EP通過間歇性心肌缺血缺氧可以上調(diào)自噬相關(guān)蛋白Beclin1的表達,促進Beclin1/Bcl-2復(fù)合體解離,誘導(dǎo)心肌細胞自噬。細胞自噬參與了EP對力竭運動所致的心肌缺血缺氧損傷的早期保護作用。

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    Exercise Preconditioning Induces Cellular Autophagy by Intermittent Ischemia-Hypoxia to Participate in Early Myocardial Protection

    SUN Qi-long,PAN Shan-shan,HUANG Yue,WANG Jia-yin,LU Jiao

    Shanghai University of Sport, Shanghai 200438, China.

    Objective: By analyzing the relationships between myocardial ischemia-hypoxia and cellular autophagy in exercise, and by detecting changes of autophagy-associated proteins Beclin1/Bcl-2 in early exercise preconditioning (EEP) and in early protective phase, the effects of cellular autophagy on EEP-cardioprotection were discussed. Methods: SD rats were randomly divided into the groups of control (C group), early exercise preconditioning (EEP group), exhaustive exercise (EE group), and early exercise preconditioning+exhaustive exercise (EEP+EE group). 1)The plasma cTnI contents were detected by chemiluminescence immunoassay (CLIA) method, which were combined with the adjacent slices between HE-staining and HBFP-staining, to comprehensively assess the extents of myocardial ischemia-hypoxia, and to verify the EEP-cardioprotection. 2) The expressional changes and the dissociated degrees in Beclin1/Bcl-2 were detected by immune-blotting, and were observed by double-labeling immunofluorescence, respectively. 3) The relationships between exercise-induced hypoxia-ischemia and cellular autophagy were assessed by the correlational analysis. Results: 1) Compared with the C group, the plasma cTnI levels and the MOD values in the EEP group to both have increasing tendencies (>0.05), and these in the EE group and in the EEP+EE group to were both significant increase (<0.05). Compared with the EE group, the plasma cTnI levels and the MOD values in the EEP group to were both significant decrease (<0.05). Compared with the C group, all other groups to represent ischemia-hypoxia changes in different degree, which were as the acidophily-enhanced positions in HE-staining approaching to the positive areas of crimson in HBFP-staining. 2) Compared with the C group, all other groups to have significantly increased Beclin1 levels (<0.05), and to have increased extents of Beclin1/Bcl-2 dissociations (<0.05), but which were without any changes in Bcl-2 levels. Compared with the EE group, the extents of Beclin1/Bcl-2 co-localization were significant increase (<0.05). All groups represented with significantly negative correlations between the Beclin1/Bcl-2 co-localization and the ischemia-hypoxia areas, and the IOD values respectively. Conclusion: EP can induces autophagy in cardiomyocytes by intermittent ischemia-hypoxia, in which the cellular autophagy participates in the early myocardial protection against the exercise-induced myocardial injury.

    1000-677X(2018)07-0025-08

    10.16469/j.css.2018070015

    G804.7

    A

    2018-02-12;

    2018-07-08

    國家自然科學(xué)基金資助項目(31471136)。

    孫其龍,男,在讀碩士研究生,主要研究方向為運動與心血管健康,E-mail:578926656@qq.com; 潘珊珊,女,教授,博士,博士研究生導(dǎo)師,主要研究方向為運動與心血管健康, E-mail:panshanshan@sus.edu.cn。

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