運動預(yù)適應(yīng)通過間歇性缺血缺氧誘導(dǎo)細胞自噬參與早期心肌保護的研究

孫其龍，潘珊珊，黃 悅，王家銀，陸 矯

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運動預(yù)適應(yīng)通過間歇性缺血缺氧誘導(dǎo)細胞自噬參與早期心肌保護的研究

孫其龍，潘珊珊，黃 悅，王家銀，陸 矯

上海體育學(xué)院 運動科學(xué)學(xué)院, 上海 200438

目的：通過分析運動性心肌缺血缺氧與細胞自噬的關(guān)系，檢測自噬相關(guān)蛋白Beclin1/Bcl-2在早期運動預(yù)適應(yīng)（EEP）及保護期的變化，探討細胞自噬在EEP心肌保護效應(yīng)中的作用。方法：SD大鼠隨機分為對照組（C組）、早期運動預(yù)適應(yīng)組（EEP組）、力竭運動組（EE組）和早期運動預(yù)適應(yīng)+力竭運動組（EEP+EE組）。1）用化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA）檢測血漿cTnI含量，結(jié)合HE和HBFP相鄰切片染色，綜合評價心肌缺血缺氧的程度，驗證EEP心肌保護效應(yīng)。2）用免疫印跡和免疫熒光雙標法檢測并觀察Beclin1/Bcl-2的表達變化和解離程度。3）通過相關(guān)性分析評估運動性缺血缺氧與細胞自噬的關(guān)系。結(jié)果：1）與C組相比，EEP組血漿cTnI水平和MOD值均具有升高的趨勢（＞0.05），且EE組和EEP+EE組升高具有顯著性（＜0.05）；與EE組相比，EEP+EE組cTnI水平和MOD值顯著降低（＜0.05）；與C組相比，其余各組心肌組織均顯示不同程度的缺血缺氧改變，HE染色嗜酸性增強部位與HBFP染色艷紅色陽性區(qū)域趨近一致。2）與C組相比，其余各組Beclin1均顯著升高（＜0.05），Beclin1/Bcl-2解離程度增加（＜0.05），而Bcl-2并無明顯變化；與EE組相比，EEP+EE組Beclin1/Bcl-2共定位程度顯著升高（＜0.05）。3）各組IHA和IOD值均與Beclin1/Bcl-2共定位程度呈顯著負相關(guān)（＜0.05）。結(jié)論：EP通過間歇性缺血缺氧可以誘導(dǎo)心肌細胞自噬，細胞自噬參與了EP對運動性心肌損傷的早期保護效應(yīng)。

運動預(yù)適應(yīng)；缺血缺氧；Beclin1；Bcl-2；細胞自噬；早期心肌保護

反復(fù)短時間的大強度間歇有氧運動導(dǎo)致心肌間歇性相對間或絕對缺血缺氧，提高心肌耐受缺血缺氧的能力，減輕隨后長時間缺血缺氧所致的心肌損傷，這種通過運動誘導(dǎo)機體產(chǎn)生內(nèi)源性心肌保護效應(yīng)的方式稱為運動預(yù)適應(yīng)（exercise preconditioning，EP）[3,18,20,22]。研究發(fā)現(xiàn)，EP的保護效應(yīng)與缺血預(yù)適應(yīng)（ischemic preconditioning，IP）類似，具有抗缺血/再灌注（ischemic/reperfusion，I/R）損傷的心肌保護效應(yīng)，如減輕I/R損傷后心肌梗塞面積，降低惡性心率失常的發(fā)生率，預(yù)防心肌頓抑等[8,22]。本研究團隊曾發(fā)現(xiàn)，EP具有抵抗異丙腎上腺素導(dǎo)致的急性心肌損傷[25]，減輕力竭運動導(dǎo)致的運動性心肌損傷[11,24]。EP可以分為誘導(dǎo)期和保護期，通過反復(fù)短時間的大強度間歇有氧運動誘導(dǎo)早期和晚期兩個保護時相。早期EP（early exercise preconditioning，EEP）保護期在EP結(jié)束后即可產(chǎn)生，持續(xù)1～3 h，晚期EP（late exercise preconditioning，LEP）保護期在EP結(jié)束后12 h出現(xiàn)，24~48 h達到高峰，持續(xù)24~72 h[3,14]。

自噬是真核細胞內(nèi)特有的生命現(xiàn)象，可選擇性的將細胞內(nèi)衰老、損傷的細胞器或蛋白質(zhì)，在溶酶體內(nèi)降解再利用的生理過程[2,9]。正常生理條件下，自噬通常維持在相對較低的水平，當(dāng)細胞受到能量缺乏、氧化應(yīng)激、缺血缺氧等因素刺激時，自噬被激活，從而參與并維持細胞的存活以及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[9,15]。自噬的發(fā)生受多種信號通路的調(diào)控，有著復(fù)雜的分子機制，其中，Beclin1作為多種信號通路的匯集點，通過與Bcl-2相互作用發(fā)揮至關(guān)重要的調(diào)控作用[12]。在應(yīng)激因素刺激下，Beclin1/Bcl-2所保持的復(fù)合體形式解離，游離的Beclin1繼而發(fā)揮誘導(dǎo)自噬的功能[5]。研究發(fā)現(xiàn)，自噬的發(fā)生與Beclin1表達上調(diào)和Bcl-2表達下調(diào)相關(guān)聯(lián)，而Beclin1/Bcl-2比值也在一定程度上能夠反映自噬與凋亡的程度[19]。Peng等[23]為探討細胞自噬在缺血性心臟中的作用，發(fā)現(xiàn)IP能夠增強Beclin1/Bcl-2相互作用，誘導(dǎo)心肌細胞自噬減輕I/R損傷，參與了缺血性心臟的早期保護作用。馬曉雯等[1]在探討長期耐力訓(xùn)練對自噬相關(guān)因子Beclin1的影響時發(fā)現(xiàn)，大強度運動訓(xùn)練可以增強大鼠心肌細胞自噬的活性，同時伴有Beclin1水平的明顯升高。萬棟峰等[3]研究了心肌線粒體自噬在EP晚期保護效應(yīng)中的作用，發(fā)現(xiàn)抑制細胞自噬后EP對運動性心肌損傷的晚期保護作用減弱，提示細胞自噬部分參與了EP的晚期心肌保護效應(yīng)?；谏鲜鲅芯勘尘?，本研究假設(shè)EP通過間歇性缺血缺氧能夠誘導(dǎo)心肌細胞自噬，而細胞自噬可能參與了EP對運動性心肌損傷的早期保護效應(yīng)。本研究在EP動物模型的基礎(chǔ)上，采用相鄰切片HE和HBFP染色評價心肌缺血缺氧程度；通過相關(guān)性分析評估心肌缺血缺氧與細胞自噬的關(guān)系；采用血漿心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）檢測與HBFP染色驗證EP早期心肌保護效應(yīng)；結(jié)合免疫印跡和免疫熒光雙標實驗，檢測并觀察自噬相關(guān)蛋白Beclin1/Bcl-2的表達變化和解離程度，探討細胞自噬在EP早期保護效應(yīng)中的作用，為EP心肌保護效應(yīng)及機制的研究提供新的實驗依據(jù)。

1 研究材料與方法

1.1 動物分組和運動實驗方案

圖1 運動實驗方案示意圖

Figure 1．Exercise Experimental Protocol

1.2 動物取材

采用10%水合氯醛（40 mg/100 g體重）對大鼠進行腹腔麻醉，將麻醉后的大鼠呈仰臥位固定于解剖臺上，打開腹腔，下腔靜脈取血5 mL，用于cTnI含量檢測。每組隨機取10只大鼠進行灌注固定，打開胸腔，暴露心臟，于心尖處插入灌注針頭，先注入1%肝素2 mL，再快速灌注0.85%生理鹽水約250 mL，并迅速剪斷下腔靜脈。待流出液基本無血色后，換滴4%多聚甲醛約250 mL，整個灌注過程大約持續(xù)30 min。灌注結(jié)束后取出心臟，入4%多聚甲醛后固定24 h。常規(guī)石蠟包埋，制作相鄰切片，用于HE染色、HBFP染色和免疫熒光雙標實驗。每組其余10只大鼠麻醉取血后，打開胸腔，取出心臟，-80℃保存，用于免疫印跡實驗。

1.3 血漿cTnI 含量檢測

用化學(xué)發(fā)光免疫分析法（chemiluminescent immunoas-say, CLIA）檢測大鼠血漿cTnI含量。CLIA是一種雙抗體一步夾心免疫酶檢測方法，采用堿性磷酸酶標記的單克隆cTnI IgG抗體試劑與樣本短暫孵育后，加入順磁性微粒作為固相載體與樣本中cTnI結(jié)合，再加入化學(xué)發(fā)光底物（Lumi-Phos*530），用光度計測量發(fā)光量，發(fā)光量與cTnI的濃度成正比，采用Beckman Coulter公司的Access 2免疫分析系統(tǒng)進行測定，線性范圍為0.02～100 ng/mL。

1.4 心肌組織相鄰切片HE和HBFP染色

用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色觀察心肌細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，其嗜酸性增強用于顯示缺血缺氧的心肌組織。用蘇木素-堿性復(fù)紅-苦味酸（hematoxylin basic fuchsin picric staining，HBFP）染色特異性顯示心肌組織的缺血缺氧變化，正常心肌組織被染成棕黃色，而缺血缺氧的心肌組織則被染成艷紅色。用HE和HBFP染色的相鄰切片綜合評價心肌組織缺血缺氧的程度。使用Leica（RM2235）切片機進行連續(xù)切片，用心肌組織相鄰切片分別進行常規(guī)HE染色和HBFP染色。HBFP染色切片常規(guī)脫蠟至水，蘇木素染液浸染5 min，1%鹽酸酒精分化3 s，用0.1%堿性復(fù)紅液浸染3 min，去離子水沖洗后丙酮漂洗30 s，0.1%苦味酸純丙酮浸染40 s，脫水透明后，中性樹膠封片。

1.5 心肌組織HBFP染色圖像采集與處理

每組隨機選取5張HBFP染色切片，每張切片隨機選取5個視野，每組共測25個視野，使用Olympus（BX60）顯微鏡進行形態(tài)學(xué)觀察，DP70數(shù)碼攝影裝置采集圖像，使用Image-ProPlus 6.0圖像分析軟件進行圖像處理。在同一放大倍數(shù)下（×400），測定缺血缺氧面積（ischemia-hypoxia area，IHA）與積分光密度（integral optical density，IOD），并計算平均光密度（mean optical density，MOD），以表示單位面積內(nèi)缺血缺氧損傷的程度（MOD=IOD/ IHA）。

1.6 心肌組織Beclin1/Bcl-2免疫印跡實驗

用免疫印跡實驗檢測心肌組織Beclin1/Bcl-2的表達變化。大鼠心肌組織提取總蛋白，BCA法檢測并調(diào)整蛋白濃度。加入上樣緩沖液，100℃恒溫加熱10 min使蛋白變性。SDS凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉封閉2 h。分別孵育一抗（小鼠抗大鼠Beclin1，美國Santa Cruz公司，sc-11427，1:1 000；兔抗大鼠Bcl-2，美國Santa Cruz公司，sc-492，1:1 000），4℃過夜。加HRP標記的二抗，室溫孵育1 h。滴加發(fā)光液后，采用Fusion FX全自動化學(xué)發(fā)光成像圖像獲取系統(tǒng)進行曝光顯影，采用Image J分析軟件測定Beclin1、Bcl-2及內(nèi)參GAPDH的條帶灰度值。

1.7 心肌組織Beclin1/Bcl-2免疫熒光雙標實驗

用免疫熒光雙標實驗觀察Beclin1/Bcl-2熒光強度及共定位程度。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，微波熱修復(fù)20 min。山羊血清封閉20 min后，加入Beclin1/Bcl-2混合一抗（小鼠抗大鼠Beclin1，美國Santa Cruz公司，sc-11427，1:200；兔抗大鼠Bcl-2，美國Santa Cruz公司，sc-492，1:200），4℃孵育過夜。滴加Alexa Fluor 647（紅）、Alexa Fluor 488（綠）標記的混合二抗(Alexa Fluor 647標記山羊抗小鼠IgG，美國abcam公司，ab150111，1:400；Alexa Fluor 488標記山羊抗兔IgG，美國abcam公司，ab150081，1:400），37℃溫箱孵育60 min。DAPI染核，5 min后流水沖洗終止反應(yīng)，PVP防熒光淬滅劑封片。采用Zeiss LSM700激光共聚焦顯微鏡觀察并采集圖像。每組隨機選取5張切片，每張切片隨機選取5個視野，每組共測25個視野，在同一放大倍數(shù)下（×400），用Zen 2012（black version）計算機圖像分析軟件分析熒光強度和共定位程度。熒光強度反映Beclin1/Bcl-2蛋白的表達變化情況，共定位程度反映Beclin1/Bcl-2復(fù)合體的解離情況。

1.8 心肌組織缺血缺氧與Beclin1/Bcl-2共定位程度的相關(guān)性

采用HBFP染色中IHA和IOD值，分別與免疫熒光雙標實驗中Beclin1/Bcl-2共定位程度進行相關(guān)性分析，評估心肌組織缺血缺氧與細胞自噬的關(guān)系。每組隨機選取5張HBFP染色切片，每張切片隨機選取5個視野，每組共測25個視野，使用Olympus（BX60）顯微鏡進行形態(tài)學(xué)觀察，DP70數(shù)碼攝影裝置采集圖像，使用Image-ProPlus 6.0圖像分析軟件進行圖像處理，測定IHA和IOD值。每組選取5張免疫熒光雙標相鄰切片，每張切片選取相對應(yīng)的5個視野，每組共測25個視野，使用Zeiss LSM700激光共聚焦顯微鏡觀察并采集圖像，采用Zen 2012（black version）計算機圖像分析軟件測定Beclin1/Bcl-2共定位程度。每組IHA和IOD值與Beclin1/Bcl-2共定位測定值相對應(yīng)，進行相關(guān)性分析。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行處理，實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差（M±SD）表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）檢驗進行組間比較，相關(guān)性分析用CORRELATE中Bivariate檢驗，以＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 血漿cTnI含量檢測結(jié)果

大鼠血漿cTnI含量檢測結(jié)果顯示（表1），與C組相比，EEP組大鼠血漿cTnI水平有升高的趨勢（＞0.05），且EE組和EEP+EE組升高具有顯著性（＜0.05）；與EE組相比，EEP+EE組血漿cTnI水平顯著降低（＜0.05）。

表 1 大鼠血漿cTnI水平變化

注：*表示與C組相比＜0.05；#表示與EE組相比＜0.05，下同。

2.2 心肌組織相鄰切片HE和HBFP染色結(jié)果

大鼠心肌組織相鄰切片HE和HBFP染色結(jié)果顯示（圖2），HE染色中C組心肌細胞輪廓界限清晰，細胞核呈卵圓形，被染為淡藍色，細胞質(zhì)著色均勻，被染為淡紅色，未見嗜酸性增強區(qū)域（圖2-A）；EEP組心肌細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)與C組相似，偶有心肌細胞出現(xiàn)嗜酸性增強的現(xiàn)象（圖2-B）；EE組大量心肌細胞出現(xiàn)嗜酸性增強的現(xiàn)象（圖2-C）；EEP+EE組少部分心肌細胞出現(xiàn)了嗜酸性變化，較EE組明顯減少（圖2-D）。HBFP染色中正常心肌組織被染為棕黃色，缺血缺氧心肌組織被染為艷紅色；C組心肌細胞輪廓清晰，細胞核被染為淡紫藍色，未見艷紅色陽性區(qū)域（圖2-E）；EEP組偶有心肌細胞出現(xiàn)斑點狀的艷紅色陽性區(qū)域（圖2-F）；EE組中大量心肌細胞出現(xiàn)艷紅色陽性區(qū)域（圖2-G）；EEP+EE組部分心肌細胞出現(xiàn)了團塊狀艷紅色陽性改變，較EE組明顯降低（圖2-H）。在HE染色和HBFP染色的相鄰切片上，從缺血缺氧損傷區(qū)域的位置比照中發(fā)現(xiàn)，各組HE染色嗜酸性增強部位與HBFP染色艷紅色陽性區(qū)域趨近一致（圖2）。

圖2 大鼠心肌組織相鄰切片HE和HBFP染色結(jié)果圖（×400）

Figure 2. Results of HE and HBFP Staining of Adjacent Slices in Rats Myocardium（×400）

2.3 心肌組織HBFP染色圖像分析結(jié)果

心肌組織HBFP染色圖像分析結(jié)果顯示（表2），心肌組織IHA和IOD值變化趨勢相似，用MOD值表示各組大鼠心肌組織中單位面積內(nèi)缺血缺氧的程度。與C組相比，EEP組MOD值具有升高的趨勢（＞0.05），且EE組和EEP+EE組升高具有顯著性（＜0.05）；與EE組相比，EEP+EE組MOD值明顯降低，差異具有顯著性（＜0.05）。

2.4 心肌組織Beclin1/Bcl-2免疫印跡檢測結(jié)果

大鼠心肌組織Beclin1免疫印跡檢測結(jié)果顯示（圖3），與C組相比，其余各組Beclin1蛋白水平均明顯升高，差異具有顯著性（＜0.05）；Bcl-2免疫印跡檢測結(jié)果顯示（圖4），各組Bcl-2蛋白水平無顯著性變化；Beclin1/Bcl-2比值結(jié)果顯示（圖5），與C組相比，EEP組Beclin1/Bcl-2比值具有升高的趨勢（＞0.05），且EE組、EEP+EE組升高具有顯著性（＜0.05）。

表2 大鼠心肌組織HBFP染色結(jié)果圖像分析

注：*與C組相比＜0.05；#與EE組相比＜0.05。

圖3 大鼠心肌組織Beclin1水平變化圖

Figure3. Change of Beclin1 Level in Rats Myocardium

圖4 大鼠心肌組織Bcl-2水平變化圖

Figure4. Change of Bcl-2 Level in Rats Myocardium

圖5 大鼠心肌組織Beclin1/Bcl-2水平變化圖

Figure5. Change of Beclin1/Bcl-2 Level in Rats Myocardium

2.5 心肌組織Beclin1/Bcl-2免疫熒光雙標結(jié)果

大鼠心肌組織Beclin1/Bcl-2免疫熒光雙標檢測結(jié)果顯示（圖6），Beclin1被標記為紅色熒光，Bcl-2被標記為綠色熒光，二者的共定位重疊區(qū)域為黃色，均散在分布于胞質(zhì)中，細胞核被DAPI標記為藍色。與C組（圖6-A）相比，EEP組（圖6-B）、EE組（圖6-C）、EEP+EE組（圖6-D）Beclin1紅色熒光強度均有不同程度的增加，而黃色共定位區(qū)域則均有不同程度的降低，提示，EEP組、EE組和EEP+EE組Beclin1蛋白表達升高，Beclin1/Bcl-2復(fù)合體解離程度加強；與EE組（圖6-C）相比，EEP+EE組（圖6-D）紅色熒光強度減弱，而黃色共定位區(qū)域增多，提示，EEP+EE組Beclin1蛋白表達降低，Beclin1/Bcl-2復(fù)合體解離程度降低。

圖6 大鼠心肌組織Beclin1和Bcl-2免疫熒光雙標實驗結(jié)果圖（×400）

Figure 6. Double Immunotluorescence Results of Beclin1 and Bcl-2 in Rats Myocardium（×400）

Beclin1熒光強度結(jié)果顯示（圖7），與C組相比，其余各組Beclin1熒光強度均顯著升高（＜0.05）。Bcl-2熒光強度結(jié)果顯示（圖8），各組Bcl-2熒光強度無顯著性差異。Beclin1/Bcl-2共定位程度結(jié)果顯示（圖9），與C組相比，其余各組Beclin1/Bcl-2共定位程度均明顯降低，差異具有顯著性（＜0.05）；與EE組相比，EEP+EE組Beclin1/Bcl-2共定位程度則顯著升高（＜0.05）。

圖7 大鼠心肌組織Beclin1熒光強度柱狀圖

Figure 7. Intensity of Beclin1 in Rats Myocardium

圖8 大鼠心肌組織Bcl-2熒光強度柱狀圖

Figure 8. Intensity of Bcl-2 in Rats Myocardium

圖9 大鼠心肌組織Beclin1/Bcl-2共定位程度柱狀圖

Figure 9. Colocalization of Beclin1/Bcl-2 in Rats Myocardium

2.6 心肌組織缺血缺氧與Beclin1/Bcl-2共定位程度相關(guān)性

大鼠心肌組織HBFP染色IHA和IOD值與免疫熒光雙標Beclin1/Bcl-2共定位程度的相關(guān)分析結(jié)果顯示（圖10），EEP組（圖10-a）大鼠心肌組織IHA值與Beclin1/Bcl-2共定位程度高度負相關(guān)（=-0.783，＜0.05），IOD值與Beclin1/Bcl-2共定位程度高度負相關(guān)（=-0.772，＜0.05）；EE組（圖10-b）大鼠心肌組織IHA值與Beclin1/Bcl-2共定位程度高度負相關(guān)（=-0.905，＜0.05），IOD值與Beclin1/Bcl-2共定位程度高度負相關(guān)（=-0.912，＜0.05）；EEP+EE組（圖10-c）大鼠心肌組織IHA值與Beclin1/Bcl-2共定位程度高度負相關(guān)（=-0.861，＜0.05），IOD值與Beclin1/Bcl-2共定位程度之間高度負相關(guān)（=-0.853，＜0.05）。以上結(jié)果顯示，EEP組（圖10-a）、EE組（圖10-b）、EEP+EE組（圖10-c）IHA和IOD值與Beclin1/Bcl-2共定位程度之間，均存在高度負相關(guān)關(guān)系，提示，隨著缺血缺氧損傷程度的升高，Beclin1/Bcl-2復(fù)合體解離，更多游離的Beclin1參與了自噬發(fā)生的誘導(dǎo)作用，心肌細胞自噬水平也因此升高。

3 討論

3.1 運動預(yù)適應(yīng)通過間歇性缺血缺氧誘導(dǎo)心肌細胞自噬

運動作為一種強烈的刺激因素，極大地提高了心肌耗氧量，導(dǎo)致心肌相對間或絕對缺血缺氧[11]。HE染色便于對心肌組織結(jié)構(gòu)全面觀察，以往也常用心肌細胞的嗜酸性增強間接顯示心肌組織的缺血缺氧，但其不具備特異性。HBFP染色是顯示心肌組織早期缺血缺氧的形態(tài)學(xué)方法，顯示心肌組織的缺血缺氧具有特異性，因此，長期以來本研究團隊采用HBFP染色方法，用于評價心肌組織的缺血缺氧改變。本次實驗采用HE染色和HBFP染色的相鄰切片，綜合評價心肌組織缺血缺氧的改變程度。結(jié)果顯示，與C組相比，其余各組HE染色中，心肌組織均出現(xiàn)了不同程度嗜酸性增強的現(xiàn)象；HBFP染色中心肌組織同樣出現(xiàn)了不同程度的艷紅色陽性區(qū)域，EEP組MOD值具有升高的趨勢，且EE組和EEP+EE組升高具有顯著性；在相鄰切片的基礎(chǔ)上，通過心肌組織缺血缺氧區(qū)域的位置比照，本研究發(fā)現(xiàn)，各組HE染色中嗜酸性增強部位與HBFP染色中艷紅色陽性區(qū)域趨近一致。這提示，不論是EEP及EEP保護期，還是一次大強度力竭運動，均導(dǎo)致大鼠心肌組織發(fā)生不同程度的缺血缺氧改變。

Beclin1是介導(dǎo)哺乳動物自噬的基因，對于自噬的發(fā)生有著重要的促進作用。Bcl-2是一種抗凋亡基因，可通過與Beclin1相互作用影響自噬過程[12]。在正常生理條件下，Bcl-2與Beclin1以蛋白復(fù)合體形式存在，由此抑制了Beclin1誘導(dǎo)自噬的功能[5]。但當(dāng)細胞受到應(yīng)激因素刺激時，Beclin1/Bcl-2復(fù)合體解離，游離的Beclin1繼而與PI3KC3結(jié)合形成新的復(fù)合體，從而誘導(dǎo)細胞自噬的發(fā)生[4]。研究發(fā)現(xiàn)，自噬的發(fā)生與Beclin1表達上調(diào)和Bcl-2表達下調(diào)相關(guān)聯(lián)，而Beclin1/Bcl-2比值也在一定程度上能夠反映凋亡與自噬的程度[19]。Huang等[13]在探討細胞自噬與IP心臟保護效應(yīng)的關(guān)系時，發(fā)現(xiàn)IP能夠激活心肌細胞自噬，并能有效減小I/R后心肌梗死面積。Yuan等[26]在EP心肌保護效應(yīng)的研究中發(fā)現(xiàn)，EP可以減輕一次大強度力竭運動所致的心肌缺血缺氧損傷，同時伴有自噬相關(guān)蛋白的明顯變化。為進一步探討心肌缺血缺氧與細胞自噬的關(guān)系，本研究特別采用免疫熒光雙標實驗檢測Beclin1/Bcl-2共定位程度，并分別與HBFP染色中的IHA和IOD值進行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，EEP組、EE組和EEP+EE組中，IHA和IOD值均與Beclin1/Bcl-2共定位程度呈顯著負相關(guān)關(guān)系，提示，隨著心肌缺血缺氧程度的升高，Beclin1/Bcl-2復(fù)合體解離，更多游離的Beclin1參與了自噬發(fā)生的誘導(dǎo)作用，心肌細胞自噬水平也因此升高。此結(jié)果進一步提示，不論是EEP及EEP保護期，還是一次大強度力竭運動，均可通過缺血缺氧誘導(dǎo)心肌細胞自噬。

圖10 大鼠心肌組織缺血缺氧與Beclin1/Bcl-2共定位程度相關(guān)分析圖

Figure 10. The Correlation between the Ischemia-hypoxia and the Colocalization of Beclin1/Bcl-2 in Rat Myocardium

3.2 細胞自噬參與運動預(yù)適應(yīng)早期心肌保護效應(yīng)

EP早期保護效應(yīng)已被較多研究所證實。Parra等[22]在EP結(jié)束10 min后對狗進行的I/R中發(fā)現(xiàn)，心肌梗死面積相比對照組減少了76%，提示，EP誘導(dǎo)的早期保護效應(yīng)可以減輕I/R損傷。Shen等[24]探討EP心肌保護作用時，在EP結(jié)束后30 min對大鼠進行了一次大強度力竭運動，發(fā)現(xiàn)EP可以明顯減輕力竭運動所致的心肌損傷，對運動性心肌損傷產(chǎn)生了早期保護作用。cTnI是心肌細胞特有的結(jié)構(gòu)蛋白，對心肌損傷具有較高的特異性、敏感性以及較長的窗口期，現(xiàn)已成為診斷心肌損傷的“金標準”。Eijsvogels等[7]在運動強度與cTnI釋放量關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，運動員血液中cTnI含量與運動強度之間存在顯著正相關(guān)關(guān)系。本研究在EP結(jié)束30 min后，對大鼠進行一次大強度力竭運動，采用血漿cTnI檢測與HBFP染色相結(jié)合的方法，從血液和形態(tài)學(xué)方面綜合評價心肌損傷與保護程度。結(jié)果顯示，與EE組相比，EEP+EE組血漿cTnI水平和MOD值均顯著降低，進一步證實EP可以提高心肌耐受缺血缺氧的能力，減輕心肌在一次大強度力竭運動中的缺血缺氧損傷，對運動性心肌損傷具有早期保護作用。

細胞自噬可能是EP參與心肌保護的機制之一。Gurusamy等[10]在自噬相關(guān)蛋白BAG-1與IP心臟保護效應(yīng)的研究中發(fā)現(xiàn)，IP誘導(dǎo)了Beclin1表達升高的細胞自噬，參與了I/R所致心肌損傷的保護作用。Mcginnis等[21]在探討EP對心肌I/R損傷的保護作用時，對小鼠進行速度為18 m/min的跑臺運動，發(fā)現(xiàn)EP同樣減輕了心肌I/R損傷，同時增強了自噬相關(guān)蛋白的活性，但并未發(fā)現(xiàn)Beclin1發(fā)生顯著性變化。本研究對大鼠進行速度為30 m/min的大強度跑臺運動，采用免疫印跡與免疫熒光雙標實驗相結(jié)合的方法，綜合評價Beclin1/Bcl-2的表達變化和解離程度。結(jié)果顯示，與C組相比，其余各組Beclin1蛋白水平均顯著升高，Beclin1/Bcl-2共定位程度顯著降低，同時，Beclin1/Bcl-2比值有升高趨勢，且EE組和EEP+EE組升高具有顯著性，提示，不論是EEP及EEP保護期，還是一次大強度力竭運動，均可促使Beclin1蛋白表達的升高，促進Beclin1/Bcl-2復(fù)合體解離，并有效上調(diào)心肌細胞自噬水平。本研究免疫熒光雙標實驗結(jié)果顯示，與EE組相比，EEP+EE組Beclin1/Bcl-2共定位程度顯著升高，提示，在EP早期心肌保護效應(yīng)中，Beclin1表達升高的細胞自噬部分參與了EP對運動性心肌損傷的保護作用。

自噬在心血管應(yīng)激中是把“雙刃劍”，適度自噬有助于細胞保護和生存，但自噬過度或自噬缺陷將導(dǎo)致細胞損傷或死亡。有研究表明，在一定條件下自噬可以轉(zhuǎn)化為自噬性細胞凋亡[17]。Liu等[16]探討了細胞自噬在不同強度運動中的作用，發(fā)現(xiàn)隨著運動強度的增加，細胞自噬和凋亡程度均明顯升高，超負荷運動會使大鼠心肌細胞自噬體數(shù)量增加，凋亡細胞增多，同時伴有Beclin1表達升高和Bcl-2/Bax比值的下降。Meyer等人[6]認為，在應(yīng)激刺激的初始階段，自噬可通過維持細胞內(nèi)能量穩(wěn)態(tài)參與細胞的保護作用，但隨著刺激強度的增加，自噬角色可能會在細胞保護和損傷之間發(fā)生切換。本研究結(jié)果提示，不論是EEP及EEP保護期，還是一次大強度力竭運動，均可通過缺血缺氧誘導(dǎo)心肌細胞自噬，但EEP本身并未導(dǎo)致明顯的心肌損傷，且EEP誘導(dǎo)的細胞自噬參與了EP對力竭所致的心肌損傷的早期保護作用。一次大強度力竭運動導(dǎo)致明顯的心肌損傷，其誘導(dǎo)的心肌細胞自噬是進一步減輕心肌損傷，還是使心肌損傷程度進一步加重，尚待深入探討。

4 結(jié)論

EP通過間歇性心肌缺血缺氧可以上調(diào)自噬相關(guān)蛋白Beclin1的表達，促進Beclin1/Bcl-2復(fù)合體解離，誘導(dǎo)心肌細胞自噬。細胞自噬參與了EP對力竭運動所致的心肌缺血缺氧損傷的早期保護作用。

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Exercise Preconditioning Induces Cellular Autophagy by Intermittent Ischemia-Hypoxia to Participate in Early Myocardial Protection

SUN Qi-long，PAN Shan-shan，HUANG Yue，WANG Jia-yin，LU Jiao

Shanghai University of Sport, Shanghai 200438, China.

Objective: By analyzing the relationships between myocardial ischemia-hypoxia and cellular autophagy in exercise, and by detecting changes of autophagy-associated proteins Beclin1/Bcl-2 in early exercise preconditioning (EEP) and in early protective phase, the effects of cellular autophagy on EEP-cardioprotection were discussed. Methods: SD rats were randomly divided into the groups of control (C group), early exercise preconditioning (EEP group), exhaustive exercise (EE group), and early exercise preconditioning+exhaustive exercise (EEP+EE group). 1）The plasma cTnI contents were detected by chemiluminescence immunoassay (CLIA) method, which were combined with the adjacent slices between HE-staining and HBFP-staining, to comprehensively assess the extents of myocardial ischemia-hypoxia, and to verify the EEP-cardioprotection. 2) The expressional changes and the dissociated degrees in Beclin1/Bcl-2 were detected by immune-blotting, and were observed by double-labeling immunofluorescence, respectively. 3) The relationships between exercise-induced hypoxia-ischemia and cellular autophagy were assessed by the correlational analysis. Results: 1) Compared with the C group, the plasma cTnI levels and the MOD values in the EEP group to both have increasing tendencies (>0.05), and these in the EE group and in the EEP+EE group to were both significant increase (＜0.05). Compared with the EE group, the plasma cTnI levels and the MOD values in the EEP group to were both significant decrease (＜0.05). Compared with the C group, all other groups to represent ischemia-hypoxia changes in different degree, which were as the acidophily-enhanced positions in HE-staining approaching to the positive areas of crimson in HBFP-staining. 2) Compared with the C group, all other groups to have significantly increased Beclin1 levels (＜0.05), and to have increased extents of Beclin1/Bcl-2 dissociations (＜0.05), but which were without any changes in Bcl-2 levels. Compared with the EE group, the extents of Beclin1/Bcl-2 co-localization were significant increase (＜0.05). All groups represented with significantly negative correlations between the Beclin1/Bcl-2 co-localization and the ischemia-hypoxia areas, and the IOD values respectively. Conclusion: EP can induces autophagy in cardiomyocytes by intermittent ischemia-hypoxia, in which the cellular autophagy participates in the early myocardial protection against the exercise-induced myocardial injury.

1000-677X(2018)07-0025-08

10.16469/j.css.2018070015

G804.7

A

2018-02-12；

2018-07-08

國家自然科學(xué)基金資助項目(31471136)。

孫其龍,男,在讀碩士研究生,主要研究方向為運動與心血管健康,E-mail:578926656@qq.com; 潘珊珊,女,教授,博士,博士研究生導(dǎo)師,主要研究方向為運動與心血管健康, E-mail:panshanshan@sus.edu.cn。