激流式生物反應(yīng)器制備豬瘟高效細(xì)胞苗

陳 樨 福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司 福州 350014

隨著市場對獸用疫苗的質(zhì)量和數(shù)量要求的不斷提高，疫苗生產(chǎn)技術(shù)也正經(jīng)歷著一場具有重大意義的技術(shù)變革，即由傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)疫苗技術(shù)向大規(guī)模高效的反應(yīng)器生產(chǎn)疫苗的發(fā)展[1]。近年來，激流式生物反應(yīng)器培養(yǎng)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于獸用疫苗的研究與生產(chǎn)中[2]。該技術(shù)通過優(yōu)化培養(yǎng)工藝與條件，高密度培養(yǎng)細(xì)胞，以達(dá)到提升抗原含量的目的，已經(jīng)取得了顯著的效果。其應(yīng)用既能降低生產(chǎn)成本，又能提高產(chǎn)品質(zhì)量。

目前傳統(tǒng)豬瘟細(xì)胞苗生產(chǎn)仍是以轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝為主，提高病毒增殖滴度是目前疫苗生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)，而大規(guī)模生物反應(yīng)器的生產(chǎn)技術(shù)為細(xì)胞苗的生產(chǎn)帶來新的思路[3]。本試驗旨在采用激流式生物反應(yīng)器培養(yǎng)技術(shù)，培養(yǎng)高效價的豬瘟ST細(xì)胞抗原。通過兩次反應(yīng)器試驗，初步建立了應(yīng)用反應(yīng)器培養(yǎng)ST細(xì)胞及增殖豬瘟病毒的方法。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料

1.1.1 大兔脾毒 批號20121028，代次F5，脾毒效價為10萬RID/g，由公司脾淋苗組提供。

1.1.2 ST細(xì)胞 由北京大北農(nóng)疫苗產(chǎn)業(yè)科技研究院提供。

1.1.3 試驗動物 營養(yǎng)良好，體重2.5～3 kg家兔，由福建省連江玉華山自然生態(tài)農(nóng)業(yè)試驗場提供。

1.1.4 主要試劑 新生牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；DMEM高糖型、胰酶購自GIBCO公司。

1.1.5 主要設(shè)備與儀器 AP20-II激流式生物反應(yīng)器購自杭州安普生物工程有限公司；UV-1200紫外分光光度計購自上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 ST細(xì)胞復(fù)蘇與擴(kuò)繁 采用常規(guī)方法復(fù)蘇ST細(xì)胞，細(xì)胞按1：5比例擴(kuò)繁出10個10 L轉(zhuǎn)瓶，其中8個轉(zhuǎn)瓶用于反應(yīng)器培養(yǎng)，2個轉(zhuǎn)瓶作為對照組，按轉(zhuǎn)瓶的生產(chǎn)工藝培養(yǎng)。

1.2.2 反應(yīng)器試驗前的準(zhǔn)備工作 試驗前應(yīng)對溫度傳感器、DO傳感器、pH傳感器進(jìn)行校準(zhǔn)與滅菌。完成培養(yǎng)袋氣密性檢測，以確保其完整性。在超凈工作臺內(nèi)將傳感器、呼吸袋、取樣器與培養(yǎng)袋的連接。裝罐完畢后將已滅菌的PBS注入灌注袋內(nèi)，浸泡紙片載體。將浸泡紙片的PBS緩沖液通過出液泵打出，將6 L細(xì)胞生長液泵入激流袋，啟動自動運(yùn)行，并開始循環(huán)，溫度設(shè)定為37℃，設(shè)定細(xì)胞生長相應(yīng)的參數(shù)值。細(xì)胞上罐前需進(jìn)行無菌驗證。

1.2.3 細(xì)胞上罐與培養(yǎng) 細(xì)胞上罐前應(yīng)先將反應(yīng)器罐體內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)液取樣作無菌檢驗。將8個10 L轉(zhuǎn)瓶的細(xì)胞消化后裝入預(yù)先準(zhǔn)備的已滅菌接種瓶，并取樣計數(shù)，細(xì)胞量應(yīng)達(dá)到（2～3）×109個，細(xì)胞懸液體積約4 L，裝入接種瓶。通過相應(yīng)管道的連接將細(xì)胞泵入細(xì)胞培養(yǎng)袋中靜止1.5 h。待細(xì)胞吸附完畢，補(bǔ)充4 L細(xì)胞生長液（工作體積為8 L），并調(diào)節(jié)設(shè)定參數(shù) DO值 150；pH值上限 7.5，下限 7.15；培養(yǎng)溫度37℃；泵速 500 r/min；振蕩器轉(zhuǎn)速 63 r/min，繼續(xù)培養(yǎng)。

細(xì)胞上罐培養(yǎng)24 h后取樣測耗糖并無菌檢驗，培養(yǎng)48 h后進(jìn)行全換液，再培養(yǎng)24 h取樣檢測耗糖值，當(dāng)耗糖量達(dá)到2 g/L時，就可進(jìn)行細(xì)胞接毒。

1.2.4 接毒 配制相應(yīng)的接毒用液體，分別為4 L細(xì)胞清洗液、4 L吸附液、7.5 L含2%牛血清的維持液。先將罐體內(nèi)的廢液用蠕動泵排出，泵入4 L清洗液，清洗罐內(nèi)細(xì)胞后排出，再泵入含脾毒的4 L吸附液，吸附1 h后排出3.5 L，最后泵入7.5 L含2%牛血清的維持液，調(diào)整設(shè)定參數(shù)DO值100；pH值上限8.0，下限7.3；培養(yǎng)溫度上限38℃，下限36℃；泵速550 r/min；振蕩器轉(zhuǎn)速63 r/min，打開循環(huán)進(jìn)行培養(yǎng)。病毒培養(yǎng)過程中要根據(jù)每天取樣測定的耗糖值，決定是否添加相應(yīng)的營養(yǎng)物質(zhì) （如：2倍濃縮的DMEM溶液、葡萄糖溶液）。

1.2.5 抗原收獲、效價檢測與卸罐 當(dāng)病毒培養(yǎng)4 d后進(jìn)行第1次收獲，總共收獲4次病毒液，每次病毒培養(yǎng)時間為4 d。根據(jù)耗糖值的變化來判定罐內(nèi)細(xì)胞的生長狀態(tài)，再確定卸罐的時間。

2 結(jié)果與分析

2.1 應(yīng)用激流式生物反應(yīng)器培養(yǎng)ST細(xì)胞情況 本次反應(yīng)器前期ST細(xì)胞培養(yǎng)試驗參照安普反應(yīng)器廠家提供的工藝技術(shù)及參數(shù)完成，ST細(xì)胞上罐數(shù)量為2.01×109個細(xì)胞。由于細(xì)胞培養(yǎng)過程中紙片載體無法實時觀察細(xì)胞的狀態(tài)與生長情況，只能通過每天定時取樣檢測培養(yǎng)基的耗糖值與調(diào)堿量來判斷細(xì)胞的情況。表1表明，細(xì)胞上罐后第1 d，由于細(xì)胞數(shù)量少，且經(jīng)過胰酶消化，細(xì)胞狀態(tài)還沒有完全恢復(fù)，此時生長速度較緩慢，耗糖值較低；培養(yǎng)至第3 d，細(xì)胞耗糖值上升至2.18 mmol/L。試驗設(shè)立10 L轉(zhuǎn)瓶對照組，細(xì)胞1：5分種后培養(yǎng)48 h已長滿單層。

表1 反應(yīng)器培養(yǎng)豬瘟病毒全過程

2.2 接毒情況 反應(yīng)器上罐后第3 d，耗糖值上升至2.18 mmol/L。前期預(yù)試驗數(shù)據(jù)表明，耗糖值大于2 mmol/L時細(xì)胞已經(jīng)適合接種，完成脾毒接毒工序。大兔脾毒按0.5%接毒量共計2 L接入灌注袋中，關(guān)閉蠕動泵，使得灌注袋內(nèi)的紙片載體浸潤在2 L脾毒中，吸附1 h后，開啟蠕動泵。

2.3 抗原收獲、效價檢測與卸罐 本次反應(yīng)器試驗共收獲抗原4個收次，抗原每間隔4 d收獲1次，與轉(zhuǎn)瓶對照組抗原收獲工藝相吻合。反應(yīng)器與轉(zhuǎn)瓶各收獲4個收次抗原，并用兔體熱反應(yīng)方法檢測抗原效價。轉(zhuǎn)瓶對照組與反應(yīng)器試驗組各收次產(chǎn)毒結(jié)果見表2、圖1，表明利用反應(yīng)器培養(yǎng)豬瘟抗原效價比轉(zhuǎn)瓶組高，最高可以達(dá)到50萬倍，但是抗原收獲批次較少，只有第2、第3兩個收次達(dá)到要求。

第4收次抗原收獲完畢后，取出灌注袋從袋子上中下及內(nèi)部四個不同位置分別取5張紙片載體，經(jīng)過結(jié)晶紫溶液處理后，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，經(jīng)過計算得出培養(yǎng)第20 d灌注袋內(nèi)細(xì)胞總數(shù)為1.22×1010個細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)增長了6倍左右。從細(xì)胞上罐到最后卸罐培養(yǎng)周期為20 d。簡單[4]。其缺點(diǎn)是：（1）生產(chǎn)過程不完全可控，不能適時調(diào)整培養(yǎng)條件，無法保證細(xì)胞培養(yǎng)處于最佳條件，因而培養(yǎng)的病毒滴度相對較低；（2）批間差異大，產(chǎn)品質(zhì)量不均一、不穩(wěn)定；（3）轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細(xì)胞勞動強(qiáng)度大、生產(chǎn)效力低、成本高。（4）細(xì)胞培養(yǎng)瓶使用前嚴(yán)格按要求清洗與滅菌，如果未達(dá)到細(xì)胞培養(yǎng)的潔凈要求會影響細(xì)胞的增殖與產(chǎn)毒，嚴(yán)重會造成細(xì)胞污染。

本試驗應(yīng)用激流式生物反應(yīng)器通過對細(xì)胞數(shù)、pH值、溫度、DO值等參數(shù)監(jiān)控進(jìn)行CSFV大規(guī)模培養(yǎng)的研究。二種培養(yǎng)方法相比較，從單位體積細(xì)胞數(shù)上，轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)可達(dá)到2.5×105個/mL，反應(yīng)器是1.5×106個/mL，反應(yīng)器培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)是轉(zhuǎn)瓶的6倍；從病毒滴度上，轉(zhuǎn)瓶制備的豬瘟抗原效價最高可達(dá)40萬RID/mL，反應(yīng)器可達(dá)60萬RID/mL，反應(yīng)器比轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的抗原效價提升50%。

激流式生物反應(yīng)器作為新型的生物反應(yīng)器克服了轉(zhuǎn)瓶的不足，它可適時調(diào)整培養(yǎng)條件，確保細(xì)胞處于最佳條件下增殖，提高了過程的可控性；操作簡單，1～2人就可操作，勞動強(qiáng)度低；一次性細(xì)胞培養(yǎng)袋減少了污染的風(fēng)險，紙片載體的立體結(jié)構(gòu)增大了細(xì)胞培養(yǎng)的表面積，更有利于細(xì)胞的吸附，從而實現(xiàn)高密度培養(yǎng)細(xì)胞，配合獨(dú)特的傳氧與細(xì)胞培養(yǎng)方式，進(jìn)一步提升病毒滴度。但它同樣也存在弊端，細(xì)胞在紙片載體中生長，無法適時取樣觀察細(xì)胞生長情況，只能借助耗糖值推測細(xì)胞生長狀況，判斷接毒收獲時間，不能精確地把握接毒與收獲的時機(jī)，直接影響

表2 轉(zhuǎn)瓶與生物反應(yīng)器培養(yǎng)豬瘟抗原效價對比

圖1 轉(zhuǎn)瓶與生物反應(yīng)器培養(yǎng)豬瘟抗原效價對比柱形圖

3 討 論

目前大多數(shù)廠家生產(chǎn)豬瘟細(xì)胞苗都是采用轉(zhuǎn)瓶的培養(yǎng)工藝，其優(yōu)勢是投資少、操作簡單、放大工藝抗原效價提升的效果，此次反應(yīng)器試驗抗原效價提升幅度偏低。