細(xì)顆粒物(PM2.5)主要組分模擬溶液對發(fā)光細(xì)菌的光抑制分析

孫成華，劉保獻(xiàn)，鹿海峰，張大偉,*，洪姍姍，劉康，常淼，杜澤瑞

1. 北京市環(huán)境保護監(jiān)測中心，北京 100048 2. 大氣顆粒物監(jiān)測技術(shù)北京市重點實驗室，北京 100048

大氣污染與健康的關(guān)系越來越受到人們的關(guān)注，眾多的研究表明，顆粒物的濃度與人群死亡率和肺癌發(fā)病率增加顯著相關(guān)?！度蚣膊∝?fù)擔(dān)2013研究》報告顯示[1]：空氣污染已成為2013年影響中國人健康的三大風(fēng)險因素之一。研究發(fā)現(xiàn)，顆粒物短期或長期暴露均會對人體產(chǎn)生不良的健康效應(yīng)[2-10]，主要包括：致使重病和慢性病患者的死亡率升高；使肺功能和免疫功能下降，造成呼吸系統(tǒng)和心腦血管系統(tǒng)疾病惡化；增加惡性腫瘤的患病率等。顆粒物對生物體的毒性效應(yīng)已經(jīng)成為近年來的研究熱點。顆粒物的健康效應(yīng)不僅來自其物理性質(zhì)，其復(fù)雜的化學(xué)組成也是健康效應(yīng)的影響因素[4, 6]。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

MicroTox稀釋液，MicroTox滲透壓調(diào)節(jié)液，MicroTox補充液，實驗用小玻璃試管，費氏弧菌凍干粉(批號16C4029，17B4040)(美國Modern Water公司)。10～100 μL可調(diào)節(jié)取樣槍，100～1 000 μL可調(diào)節(jié)取樣槍(吉爾森)。硫酸氨、硝酸氨、硫酸氫氨、七水硫酸鋅(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。硝酸鉛(分析純，天津市福晨化工廠)。

Microtox Model 500毒性檢測系統(tǒng)(美國Modern Water公司)，儀器配備了30孔溫控培養(yǎng)室，溫度控制在(15±0.5) ℃；恒溫調(diào)節(jié)溫控菌種培養(yǎng)槽，溫度控制在(5.5±1) ℃；實驗樣品測試井，溫度控制于(15±1.0) ℃。AD-2100F連續(xù)測定pH計(上海儀樂)。

1.2 方法

1.2.1 模擬溶液配制方法

分析2014—2015年P(guān)M2.5組分濃度與發(fā)光抑制率的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)樣品提取液發(fā)光抑制率值均與Pb、Zn、Cu、Mn相關(guān)性較強，Cu、Mn的鹽溶液有顏色會干擾發(fā)光細(xì)菌發(fā)光測試結(jié)果，本實驗選擇Pb、Zn開展發(fā)光細(xì)菌發(fā)光抑制測試。Charrier等[19]研究發(fā)現(xiàn)，顆粒物中大部分金屬以可溶性的離子態(tài)形式存在，因此選用發(fā)光細(xì)菌光抑制測試實驗中常用標(biāo)準(zhǔn)參照物硫酸鋅和易溶的硝酸鉛配制模擬溶液；鋅、鉛等元素在PM2.5中含量較低，其當(dāng)量濃度比硝酸根、硫酸根當(dāng)量濃度低近千倍，在模擬硫酸氨、硫酸氫氨、硝酸氨溶液中加入硫酸鋅、硝酸鉛對溶液中硫酸根和硝酸根的濃度影響極低。參照2014—2015年P(guān)b、Zn在不同濃度級別顆粒物樣品中的平均濃度(表1)，估算了不同級別PM2.5提取液中的硫酸鋅、硝酸鉛濃度，分別模擬配制硫酸鋅、硝酸鉛、硫酸鋅和硝酸鉛的混合溶液以及不同濃度級別硫酸鋅、硝酸鉛與硫酸氨、硫酸氫氨、硝酸氨的混合溶液。

1.2.2 模擬溶液pH值測試

1.2.3 發(fā)光細(xì)菌光抑制測試方法及質(zhì)量控制

采用Model 500毒性檢測系統(tǒng)，按照標(biāo)準(zhǔn)方法(ISO11348-3：2007，水樣對費氏弧菌發(fā)光抑制效應(yīng)的測試-使用凍干細(xì)菌的方法)，實驗步驟參見文獻(xiàn)[11,14]。測試質(zhì)控措施：菌種復(fù)蘇后，應(yīng)用ATP模式測試實驗用菌液初始發(fā)光值，實驗用菌液初始光子計數(shù)值要大于107。每批次樣品測定時，同步測試菌種稀釋液(空白)、相同濃度標(biāo)準(zhǔn)毒性參照物溶液(質(zhì)控樣)的發(fā)光抑制率，以控制菌液質(zhì)量；同步測試溶液配制用水的發(fā)光抑制率作為背景參考值，每個濃度溶液平行測定2～3次，結(jié)果取各次測試的平均值。全部實驗過程中共測試菌種稀釋液空白14個，發(fā)光抑制率平均值為-3.14%±1.78%，配制用水空白8個，發(fā)光抑制率平均值為-1.71%±2.62%，標(biāo)準(zhǔn)毒性參照溶液(10 mg·L-1硫酸鋅)14個，發(fā)光抑制率平均值為87.0%±1.46%。

1.2.4 聯(lián)合影響效應(yīng)測試混合溶液的配制及聯(lián)合影響效應(yīng)判定方法

混合物的配比不同對聯(lián)合影響效應(yīng)判定的實驗結(jié)果有影響[20]，因此混合硫酸氨、硫酸氫氨、硝酸氨的溶液中，各組分濃度比例參照2014—2015年各組分在日均值6級顆粒物樣品中的平均濃度進(jìn)行估算，混合硫酸鋅、硝酸鉛的比例參照2014—2015年6級顆粒物樣品中Pb、Zn的平均濃度比例估算。

參考硫酸氨、硫酸氫氨、硝酸氨混合溶液的EC50值和硫酸鋅、硝酸鉛混合溶液的EC50值，配制等毒性比硫酸氨、硫酸氫氨、硝酸氨與硫酸鋅、硝酸鉛的多元混合溶液。

多種污染物與生物體的聯(lián)合毒性作用，可以分為獨立、相加、協(xié)同和拮抗4種作用類型，采用毒性單位法(TU)、相加指數(shù)法(AI)、混合毒性指數(shù)法(MTI)等方法可對這些類型進(jìn)行定量判別和分析[20-23]。

毒性單位法中規(guī)定混合物中第i組分的毒性單位為:

式中Ci為混合物在半數(shù)抑制效應(yīng)時第i組分的濃度，EC50i為化合物單獨作用時的半數(shù)抑制效應(yīng)濃度?；旌衔锏亩拘詥挝坏扔诟鹘M分的毒性單位之和：

M=TUmix=∑TUi

若令M0=M÷max(TUi)，依據(jù)M0結(jié)果可以評價混合物的聯(lián)合作用類型，表1為聯(lián)合毒性作用類型量化評價依據(jù)。

相加指數(shù)法是在毒性單位法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，定義如下：

當(dāng)M>1時，AI=M(-1)+1.0

混合毒性指數(shù)法定義為：

M0=M÷max(TUi)

2 結(jié)果與分析 (Results and analysis)

2.1 硫酸氨、硝酸氨、硫酸氫氨等模擬溶液濃度的確定

2014—2015年分別測試3～6級PM2.5樣品提取液129、69、57、39份，統(tǒng)計各級別PM2.5樣本組分濃度(表2)，估算3～6級PM2.5樣本提取液中各組分平均濃度，轉(zhuǎn)換成當(dāng)量濃度后估算3～6級各模擬溶液濃度分別為：硫酸氨溶液(7.17、10.7、12.0、13.5 μg·mL-1)，硝酸氨溶液(10.6、14.6、25.6、36.1 μg·mL-1)，硫酸氫氨溶液(3.88、2.47、6.28、13.2 μg·mL-1)，七水硫酸鋅溶液(0.539、0.718、0.951、1.28 μg·mL-1)，硝酸鉛溶液(0.088、0.123、0.157、0.219 μg·mL-1)，此外還選擇2014—2015年Zn、Pb的最高濃度估算配制了樣品最高濃度的七水硫酸鋅模擬溶液(2.83 μg·mL-1)，硝酸鉛模擬溶液(0.457 μg·mL-1)。

表1 不同評價指數(shù)的聯(lián)合作用類型判斷標(biāo)準(zhǔn)Table 1 The joint toxicity types and standards of different evaluating methods

表2 不同濃度級別顆粒物樣品中硫酸根、硝酸根、氨離子、鋅、鉛平均濃度(μg·m-3)Table 2 The average concentration of major compositions of PM2.5(μg·m-3)

注：PM2.5濃度分級參考標(biāo)準(zhǔn)HJ633—2012。Note: The classification of daily average level of PM2.5refer to Standard HJ633-2012.

2.2 不同濃度級別硫酸氨、硝酸氨、硫酸氫氨等模擬溶液對發(fā)光細(xì)菌的光抑制測試結(jié)果

圖1為不同濃度硫酸氨、硝酸氨及其混合溶液對發(fā)光細(xì)菌發(fā)光抑制的測試結(jié)果，圖2為不同濃度硫酸氫氨及其與硫酸氨、硝酸氨混合溶液對發(fā)光細(xì)菌的光抑制的測試結(jié)果。3～6級硫酸氨、硝酸氨、硫酸氫氨溶液及它們的混合溶液均未對發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光產(chǎn)生抑制，當(dāng)硫酸氨和硝酸氨濃度為6級濃度的1 000倍時，對發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光抑制率平均值分別為69.2%和37.0%。配制硫酸氨、硝酸氨濃溶液，選擇5個合適的稀釋濃度，測試各濃度溶液發(fā)光抑制率，繪制曲線，計算得到硫酸氨、硝酸氨EC50值分別為2.31×104μg·mL-1、2.75×104μg·mL-1。

圖1 不同濃度硫酸氨、硝酸氨及其混合模擬溶液對發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光抑制率Fig. 1 Luminous inhibition rate of different concentrations of ammonium sulfate, ammonium nitrate and their mixed solution

圖2 不同濃度硫酸氫氨及其混合模擬溶液對發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光抑制率Fig. 2 Luminous inhibition rate of different concentrations of ammonium hydrogen sulfate and ammonium hydrogen sulfate mixed with ammonium sulfate, ammonium nitrate solution

在估算硫酸鹽和硝酸鹽濃度時，發(fā)現(xiàn)隨著PM2.5濃度增加，氨離子和硫酸根及硝酸根之間的當(dāng)量濃度差距加大(圖3)，模擬各級溶液時選擇H+平衡陰陽離子之間的差異，硫酸氫氨溶液偏酸性，硫酸氫氨濃度為6級估算濃度的10倍(132 μg·mL-1)時，pH值為3.23，對發(fā)光細(xì)菌發(fā)光顯著抑制(發(fā)光抑制率為99.9%)。將10倍的6級硫酸氫氨模擬溶液逐級稀釋，測試稀釋溶液的發(fā)光抑制率，繪制的曲線見圖4。由曲線可以觀察到，當(dāng)H+濃度增加到6級細(xì)顆粒物(PM2.5)提取液中硫酸氫氨濃度的5倍時，模擬混合溶液即開始對發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光產(chǎn)生明顯抑制(圖2)，發(fā)光抑制率與硫酸氫氨的稀釋濃度指數(shù)相關(guān)(圖4), 硫酸氫氨EC50值為79.8 μg·mL-1。同時將10倍的6級硫酸氫氨與硫酸氨、硝酸氨各模擬混合溶液逐級稀釋，測試發(fā)光抑制率，混合溶液發(fā)光抑制率均與稀釋濃度指數(shù)相關(guān)(圖2，圖4)，計算硫酸氫氨及混合溶液的EC50值，采用毒性單位法(TU)、相加指數(shù)法(AI)、混合毒性指數(shù)法(MTI)等聯(lián)合影響效應(yīng)評價方法，計算各混合溶液的TU、M、M0、AI、MTI等參數(shù)(表3)，其中M≈1≈M0，AI=0，MTI=0，各混合溶液對發(fā)光細(xì)菌的光抑制均為硫酸氫氨的獨立作用，說明硫酸氫氨與硫酸氨、硝酸氨混合鹽溶液中對發(fā)光細(xì)菌光抑制的主要影響因素是H+。

圖3 不同濃度級別PM2.5中氨離子當(dāng)量濃度與硫酸根和硝酸根當(dāng)量濃度比較Fig. 3 The equivalent concentration of ammonia ion compared to the equivalent concentration of sulfate ion and nitrate ion in PM2.5 samples

圖4 10倍6級硫酸氫氨模擬溶液對發(fā)光細(xì)菌的光抑制的稀釋濃度曲線Fig. 4 The correlation curve of luminous inhibition rate and diluted concentration of ammonium hydrogen sulfate

模擬溶液中應(yīng)用氫離子平衡陰陽離子濃度，降低了溶液的pH值，但實際PM2.5樣品提取液中鈉、鉀、鈣、鎂等離子同時參與陰陽離子平衡[17,24]，2014年6級PM2.5樣品的提取液pH平均值為5.35，高于6級模擬溶液pH值(4.55)，模擬實驗中H+對發(fā)光細(xì)菌的影響會比實際PM2.5樣品提取液高。楊懂艷等[25]測試了2012年8月—2013年7月一年的PM2.5水溶性離子濃度，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)陰陽離子年均比值為1.12，水溶性離子總體偏酸性，實際PM2.5樣品提取液中，H+對生物的影響效應(yīng)仍需重視，應(yīng)加大力度控制硫酸根、硝酸根、氨離子等前體物的排放量，重視對PM2.5中水溶性離子陰陽平衡的分析。

2.3 不同濃度級別鋅、鉛等模擬溶液對發(fā)光細(xì)菌的光抑制測試結(jié)果

由圖5，6可見，5級以下硫酸鋅、硝酸鉛溶液及其混合溶液均未顯著抑制發(fā)光細(xì)菌發(fā)光，模擬硫酸鋅溶液對發(fā)光細(xì)菌發(fā)光抑制的影響要高于硝酸鉛，鋅離子對發(fā)光抑制的無效應(yīng)濃度為0.19 μg·mL-1、鉛離子對發(fā)光抑制的無效應(yīng)濃度為0.44 μg·mL-1。3～6級模擬硝酸鉛溶液中，鉛離子的濃度均低于其無效應(yīng)濃度(0.44 μg·mL-1)，而5級以上模擬硫酸鋅溶液中，鋅離子濃度則高于其無效應(yīng)濃度(0.19 μg·mL-1)。

圖5 不同濃度硫酸鋅溶液對發(fā)光細(xì)菌的光抑制測試結(jié)果Fig. 5 Luminous inhibition rate of different concentrations of zinc sulfate solution

表3 混合體系的 EC50值和聯(lián)合毒性評價參數(shù)及作用類型Table 3 Joint toxicity evaluating parameters and types for different multi-mixture systems

圖6 不同濃度硝酸鉛溶液對發(fā)光細(xì)菌的光抑制測試結(jié)果Fig. 6 Luminous inhibition rate of different concentration of lead nitrate solution

由硫酸鋅、硝酸鉛的EC50曲線估算，硫酸鋅、硝酸鉛EC50值分別為4.45 μg·mL-1、1.80 μg·mL-1。參照2014—2015年6級顆粒物樣品中Pb、Zn的平均濃度比例配制硫酸鋅與硝酸鉛混合溶液，選擇5個合適的稀釋濃度，測試發(fā)光抑制率，計算得到混合溶液的EC50值為2.87 μg·mL-1，采用毒性單位法(TU)、相加指數(shù)法(AI)、混合毒性指數(shù)法(MTI)等聯(lián)合影響效應(yīng)評價方法，計算各混合溶液的TU、M、M0、AI、MTI等參數(shù)(表3)，其中M<1，AI>0，MTI >1，硫酸鋅和硝酸鉛混合溶液中，鋅和鉛對發(fā)光細(xì)菌的聯(lián)合影響效應(yīng)表現(xiàn)為協(xié)同。王瑩等[26]測試了Zn2+、Pb2+對水螅的聯(lián)合毒性作用，王銀秋等[27]測試了Zn2+、Pb2+對鯽魚和泥鰍的聯(lián)合毒性作用，發(fā)現(xiàn)Zn2+、Pb2+對這些水生生物的聯(lián)合毒性多表現(xiàn)為拮抗作用，這種差異可能緣于不同實驗物種對不同金屬的敏感性不一致。高繼軍等[28]在應(yīng)用淡水發(fā)光菌研究二元重金屬混合物的聯(lián)合毒性時注意到：應(yīng)用不同的測試生物對相同的重金屬混合物進(jìn)行測試，會出現(xiàn)不同的作用方式。。孟慶俊等[20]在研究苯胺與甲基苯胺對大型溞的聯(lián)合毒性時發(fā)現(xiàn):混合物的配比不同得到的聯(lián)合毒性作用結(jié)果不同，本次實驗Zn2+、Pb2+的混合溶液配制比例按照實際PM2.5中Zn2+與Pb2+的濃度比例配制，而王瑩等[26]的試驗中Zn2+、Pb2+的混合溶液按等毒性比例配制。

2.4 硫酸氨、硝酸氨、硫酸氫氨與硫酸鋅、硝酸鉛混合溶液對發(fā)光細(xì)菌的光抑制

參照硫酸氨、硫酸氫氨、硝酸氨混合溶液的EC50值以及硫酸鋅、硝酸鉛混合溶液的EC50值，配制硫酸氨、硫酸氫氨、硝酸氨與硫酸鋅、硝酸鉛等毒性比的混合溶液。選擇5個合適的稀釋濃度，測試發(fā)光抑制率，計算得到混合溶液的EC50值為63.6 μg·mL-1，采用毒性單位法(TU)、相加指數(shù)法(AI)、混合毒性指數(shù)法(MTI)等聯(lián)合毒性評價方法，計算各混合溶液的TU、M、M0、AI、MTI等參數(shù)(表3)，其中M<1，AI>0，MTI >1，多元混合體系對發(fā)光細(xì)菌的影響呈現(xiàn)協(xié)同作用。圖7中5級以上硫酸鋅、硝酸鉛模擬溶液和相同級別硫酸氨、硝酸氨、硫酸氫氨溶液混合后，發(fā)光抑制率值顯著增加，表明硫酸鹽、硝酸鹽與鋅、鉛的混合體系呈現(xiàn)協(xié)同作用。

3 討論與結(jié)論(Discussion and conclusion)

模擬的PM2.5主要組分溶液對發(fā)光細(xì)菌的光抑制測試實驗表明：(1)與3～6級PM2.5可溶性提取液中硫酸氨、硫酸氫氨、硝酸氨、硫酸鋅和硝酸鉛濃度相同的模擬溶液對發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光沒有抑制作用。(2)硫酸氨、硝酸氨、硫酸氫氨混合溶液中，對發(fā)光細(xì)菌的光抑制均為硫酸氫氨的獨立作用，硫酸鋅與硝酸鉛的混合體系，鋅和鉛對發(fā)光細(xì)菌的聯(lián)合影響效應(yīng)表現(xiàn)為協(xié)同，硫酸氨、硝酸氨、硫酸氫氨與硫酸鋅、硝酸鉛的多元混合體系呈現(xiàn)協(xié)同作用。

圖7 3～6級鋅、鉛等模擬溶液對發(fā)光細(xì)菌的光抑制測試結(jié)果Fig. 7 Luminous inhibition rate of different concentrations of lead and zinc salt solution, lead and zinc salt solution mixed with ammonium hydrogen sulfate, ammonium sulfate and ammonium nitrate solution

目前，我國尚沒有開展顆粒物組分與健康效應(yīng)關(guān)聯(lián)的長期流行病學(xué)調(diào)查，顆粒物組分健康效應(yīng)的毒理學(xué)實驗也開展較少，Liu等[29]春季在北京城區(qū)和郊區(qū)開展了PM2.5樣品組分分析和顆粒物提取液DTT氧化損失能力測試，應(yīng)用2種細(xì)胞系開展了體外毒性測試，評估并解析了顆粒物不同來源組分與活性氧產(chǎn)生能力的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)二次來源的顆粒組分、Zn、Al、Pb、Fe和沙塵源顆粒組分是引起細(xì)胞氧化損傷和產(chǎn)生炎性因子重要因素。Wang等[30]研究了北京不同粒徑的顆粒物電位、比表面積以及可溶性有機物、過渡金屬、多環(huán)芳烴、內(nèi)毒素等組分濃度特點，并應(yīng)用DTT氧化損失能力測試方法分析了不同粒徑顆粒物的氧化應(yīng)激能力，采用人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和小鼠單核巨嗜細(xì)胞系，測試了這些顆粒物對細(xì)胞活力的影響以及在顆粒物作用下肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的白細(xì)胞介素-8和巨嗜細(xì)胞腫瘤壞死因子-α的產(chǎn)生情況，分析了粒徑、組分濃度與氧化應(yīng)激和細(xì)胞毒性因子的相關(guān)性。但各組分之間的聯(lián)合影響效應(yīng)研究尚不多見。雖然PM2.5提取液的發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光抑制實驗可以實現(xiàn)測試程序標(biāo)準(zhǔn)化，能夠簡單、快速得出測試結(jié)果，但發(fā)光細(xì)菌細(xì)胞與高等動物及人體細(xì)胞相比，結(jié)構(gòu)簡單，缺少遺傳毒性、免疫毒性等靶標(biāo)，且顆粒物暴露方式與高等動物及人體細(xì)胞相比有一定的差異，發(fā)光抑制測試結(jié)果只能預(yù)警提示PM2.5對健康可能存在危害。本研究僅針對PM2.5金屬組分與硫酸鹽、硝酸鹽組分對生物的聯(lián)合影響開展了初步研究，這些組分與PM2.5中主要有機組分OC(占比27%～30%)之間的聯(lián)合影響效應(yīng)還有待進(jìn)一步探討。為科學(xué)研究顆粒物不同組分對生物及人體影響，評估顆粒物的健康效應(yīng)，應(yīng)建立起不同種群多種模式生物[10,30-33]顆粒物毒性評估監(jiān)測體系，為大氣污染治理提供參考。