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    納米銀和PVP包被納米銀對HepG2細(xì)胞遺傳毒性的比較研究

    2018-08-01 01:24:58王秀娟李婷竹陸強蘇雪榮薛玉英唐萌
    生態(tài)毒理學(xué)報 2018年3期
    關(guān)鍵詞:微核包被納米銀

    王秀娟,李婷竹,陸強,蘇雪榮,薛玉英,*,唐萌

    1. 環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點實驗室,南京 210009 2. 東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 & 蘇州納米科技協(xié)同創(chuàng)新中心,南京 210009 3. 江蘇省生物材料與器件重點實驗室,南京 210009

    隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展,納米產(chǎn)品層出不窮。在眾多的納米材料中,納米銀因其優(yōu)良的抗菌殺菌性能被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療衛(wèi)生、食品加工、化妝品、陶瓷、紡織、半導(dǎo)體材料,水質(zhì)凈化等領(lǐng)域[1]。廣泛的應(yīng)用使人體暴露納米銀的機會大大增加,有研究表明,納米銀可能與體內(nèi)不同組織、細(xì)胞或生物分子產(chǎn)生相互作用[2-5],帶來潛在的安全隱患,評估其生物安全性至關(guān)重要。

    遺傳毒性在安全性評價中不可或缺,有研究者用粒徑為55 nm的納米銀對SD大鼠在其懷孕的第7~20天,每天分別以 0、0.2、2、20 mg·kg-1的劑量進(jìn)行灌胃,結(jié)果發(fā)現(xiàn)納米銀可穿越胎盤屏障,到達(dá)胎鼠體內(nèi),并引起孕鼠及子鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的改變[6]。Wen等[7]用納米銀(6.3~629 nm)對大鼠以5 mg·kg-1的劑量進(jìn)行靜脈染毒,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與空白對照組相比實驗組大鼠染色體斷裂和多倍體細(xì)胞率顯著增加,表明納米銀具有潛在的遺傳毒性。Tavares等[8]用納米銀(5~45 nm)染毒人外周血細(xì)胞,彗星實驗結(jié)果表明在各染毒劑量下(10、25、50 μg·mL-1)納米銀均會對細(xì)胞產(chǎn)生基因毒性作用,但隨著時間的推移納米銀對DNA的損傷逐漸減少,說明在低劑量染毒細(xì)胞時,隨著時間的增加,納米銀對細(xì)胞造成的遺傳毒性會因為細(xì)胞修復(fù)系統(tǒng)而降低。目前,關(guān)于納米銀的體外遺傳毒性研究還不是很充分,有待進(jìn)一步探索。

    本研究選擇人肝癌(HepG2)細(xì)胞株為研究對象,以無包被納米銀和PVP包被納米銀為材料,通過彗星實驗和胞質(zhì)分裂阻滯微核細(xì)胞組學(xué)試驗研究納米銀對DNA、染色體的影響,從多遺傳終點和遺傳毒作用機制角度出發(fā),通過分析、比較2種納米銀的遺傳作用特征,較全面地分析納米銀遺傳毒性的劑量-效應(yīng)關(guān)系,為納米材料體外遺傳毒性評估提供實驗依據(jù)。此外,本研究確定了由彗星實驗與胞質(zhì)分裂阻滯微核細(xì)胞組學(xué)試驗結(jié)合的方法,利用HepG2細(xì)胞作為體外評價模型,能方便快速檢測納米銀材料的遺傳毒性效應(yīng),進(jìn)而可以利用該組合實驗篩檢市場中納米材料的遺傳毒性效應(yīng)。

    1 材料與方法(Materials and methods)

    1.1 材料與細(xì)胞

    20 nm PVP包被納米銀粉體(上海滬正納米科技有限公司),20 nm 無包被納米銀粉體(上海允復(fù)納米科技有限公司),重鉻酸鉀(K2Cr2O7,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),陽性對照絲裂霉素C(Mitomycin C, MMC, Sigma-Aldrich公司),HepG2細(xì)胞株(Human hepatoma cell line,人肝癌細(xì)胞,中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所)。

    1.2 試劑

    DMEM高糖培養(yǎng)液(美國GE公司),胰蛋白酶(美國Gibco公司),胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司),磷酸鹽緩沖液(PBS,博士德生物工程有限公司),細(xì)胞凋亡-Hoechst染色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),Oxiselect彗星實驗試劑盒(Oxiselect comet assay kit,美國Cell Biolabs公司),TE緩沖液(北京天恩澤生物技術(shù)有限公司),氯化鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),氫氧化鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),75%酒精(永華化學(xué)科技(江蘇)有限公司),細(xì)胞松弛素-B(Cytochalasin B,Cyt-B,CAS:14930-96-2,美國Sigma -Aldrich 公司),吉姆薩粉末(Giemsa,中國Biosharp公司)。

    1.3 主要儀器

    3423型CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司),TDZ6B-WS水平離心機(上海盧湘儀器廠),5424R型離心機(德國Eppendorf公司),KQ-2200E型超聲波清洗儀(昆山超聲儀器有限公司),F(xiàn)SX100型智能生物圖像導(dǎo)航儀(日本OLYMPUS公司)。

    1.4 實驗方法

    1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)

    HepG2細(xì)胞使用DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素)于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%條件下常規(guī)傳代培養(yǎng)。

    1.4.2 Hoechst-33258染色測細(xì)胞凋亡

    將潔凈蓋玻片置于6孔板內(nèi),取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板,調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×105個·mL,每孔2 mL,培養(yǎng)過夜,使其密度至50%~80%滿。后分別用20 μg·mL-1、40 μg·mL-1、80 μg·mL-1、160 μg·mL-1的納米銀染毒細(xì)胞。24 h后,吸盡培養(yǎng)液,加入0.5 mL固定液,固定10 min,去固定液。用PBS洗2遍,每次3 min,吸盡液體。加入0.5 mL Hoechst 33258染色液,置搖床上染色5 min。去染色液,用PBS洗2遍,吸盡液體。滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上,蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片,讓細(xì)胞接觸封片液,盡量避免氣泡。在生物導(dǎo)航儀上觀察細(xì)胞。

    1.4.3 彗星實驗

    取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于12孔板,調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1×105個·mL,每孔1 mL。培養(yǎng)24 h后吸去原培養(yǎng)液,空白對照組加入細(xì)胞培養(yǎng)液,陽性對照組加入294 μg·mL-1的重鉻酸鉀溶液,實驗組分別加入20、40、80、160 μg·mL-1的納米銀溶液,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,收集細(xì)胞。按照彗星實驗試劑盒操作說明檢測DNA損傷。實驗重復(fù)3次,每次實驗每個劑量隨機選擇50個細(xì)胞用Comet Assay軟件(CASP,http://casplab.com/)分析。3次實驗的Olive尾矩、尾長和尾部DNA百分比的平均值用以表達(dá)DNA損傷。

    1.4.4 胞質(zhì)分裂阻滯微核細(xì)胞組學(xué)試驗

    取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于12孔板,調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1×105個·mL,每孔1 mL。培養(yǎng)24 h后吸去原培養(yǎng)液,實驗組分別加入20、40、80、160 μg·mL-1的納米銀溶液,陽性對照組加入0.1 μg·mL-1的絲裂霉素C,胞質(zhì)阻滯松弛素B在染毒時同時加入,濃度為4 μg·mL-1,染毒24 h后,吸去染毒液將細(xì)胞固定滴片,后用Giemsa 染液進(jìn)行染色,最后用生物導(dǎo)航儀讀片,對2種納米銀每個染毒劑量均觀察3次不同區(qū)域的細(xì)胞,每次觀察1 000個雙核細(xì)胞,統(tǒng)計1 000個細(xì)胞中總微核(Ⅰ型微核+Ⅱ型微核)、Ⅰ型微核、Ⅱ型微核、核芽、核質(zhì)橋的數(shù)量。

    1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

    2 結(jié)果(Results)

    2.1 納米銀表征結(jié)果

    透射電鏡(TEM)檢測結(jié)果如圖1所示,通過TEM觀察到分散于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中的2種納米銀顆粒均為球形,無包被的納米銀有團(tuán)聚現(xiàn)象,PVP包被的納米銀分散均勻,無團(tuán)聚現(xiàn)象。通過Nano Measurer 1.2.5 軟件測量20 nm無包被納米銀平均粒徑為(18.29±5.50) nm,20 nm PVP包被的納米銀平均粒徑為(19.95±4.75) nm。

    2.2 納米銀對HepG2細(xì)胞凋亡的影響

    生物導(dǎo)航儀讀片可見陽性對照組凋亡細(xì)胞比較多,各處理組有少量的細(xì)胞核呈致密濃染,或呈碎塊狀致密濃染,其他都為正常的細(xì)胞核形態(tài),正常細(xì)胞核內(nèi)DNA分布相對均勻,細(xì)胞核無固縮,在視野中呈現(xiàn)體積較大的且染色顏色較淺的核形態(tài),納米銀對HepG2細(xì)胞核形態(tài)的影響見圖2,各實驗處理組HepG2 細(xì)胞凋亡率結(jié)果見表1。

    圖1 納米銀顆粒TEM圖注:A, 20 nm AgNPs的TEM圖; B, 20 nm-PVP AgNPs的TEM圖。Fig. 1 The TEM diagram of nano silver particlesNote: A, the TEM diagram of 20 nm AgNPs; B, the TEM diagram of 20 nm-PVP AgNPs.

    圖2 不同特性納米銀對HepG2細(xì)胞核形態(tài)的影響注:Hoechst 33258染色,×100,箭頭所指為凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核。A,空白對照組;B,陽性對照組;C1~C4,20 nm AgNPs組(劑量分別為20, 40, 80, 160 μg·mL-1);D1~D4,20 nm PVP-AgNPs組(劑量分別為20, 40, 80 160 μg·mL-1。Fig. 2 The influence of different characteristics of nano silver on the nuclear form of HepG2Note: Hoechst 33258 staining, ×100; the arrow refers to the nucleus of apoptotic cells. A, blank control group; B, positive control group; C1-C4, 20 nm AgNPs group (20, 40, 80, 160 μg·mL-1); D1- D4, 20 nm PVP-AgNPs group (20, 40, 80, 160 μg·mL-1).

    表1可知,與正常對照組比較,20 nm AgNPs組在劑量為160 μg·mL-1時凋亡細(xì)胞核相比于空白對照組明顯增多(P<0.05);20 nm PVP-AgNPs的80 μg·mL-1、160 μg·mL-1組凋亡細(xì)胞核相比于空白對照組明顯增多(P<0.05,P<0.01)。2種納米銀使HepG2細(xì)胞呈濃度依賴性的細(xì)胞凋亡(20 nm AgNPs:P<0.05,r=0.997;20 nm PVP-AgNPs:P<0.05,r=0.999)。析因設(shè)計方差分析比較可知,20 nm PVP-AgNPs對HepG2細(xì)胞凋亡的影響大于20 nm AgNPs(P<0.05)。

    圖3 彗星圖像(×42)注:A,空白對照組;B,陽性對照組;C1~C4,20 nm AgNPs組(劑量分別為20, 40, 80,160 μg·mL-1);D1~D4,20 nm PVP-AgNPs組(劑量分別為20, 40, 80,160 μg·mL-1)。Fig. 3 The comet image (×42)Note: A, blank control group; B, positive control group; C1-C4, 20 nm AgNPs group (20, 40, 80, 160 μg·mL-1); D1- D4, 20 nm PVP-AgNPs group (20, 40, 80,160 μg·mL-1).

    表1 不同特性納米銀對HepG2細(xì)胞凋亡率的影響Table 1 The effect of silver nanoparticles with different properties on the apoptosis rate of HepG2 cells

    注:與空白對照組比較,aP<0.05,bP<0.01。Note: Compared with the control group,aP<0.05,bP<0.01.

    2.3 納米銀對DNA損傷的影響

    實驗所得彗星圖像見圖3,空白對照組彗星頭部DNA致密,無尾部;陽性對照組頭部DNA集中,亮度很強,尾部由DNA斷片組成呈掃帚狀,熒光強度不及頭部。2種納米銀處理組中小于等于40 μg·mL-1劑量組均能觀察到頭部DNA致密,無明顯尾部或尾部很短;大于等于80 μg·mL-1的各個劑量組的彗星頭部DNA集中,亮度較強,尾部成呈掃帚狀,熒光強度不及頭部。利用彗星分析軟件(Comet Assay Software Project, CASP)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,2種不同包被納米銀的不同濃度的Olive尾矩、尾長和尾部DNA百分比結(jié)果見表2。

    由單因素方差分析結(jié)果可知,在染毒24 h后,陽性對照組Olive尾矩、尾長和尾部DNA百分比與空白對照組對比有顯著差異(P<0.01)。20 nm AgNPs組中除了20 μg·mL-1的Olive尾矩與尾長,其余均與空白對照組有顯著差異(P<0.05),20 nm PVP-AgNPs組除了20 μg·mL-1的DNA百分比,其余均與空白對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。析因設(shè)計方差分析比較可知,2種納米銀使HepG2細(xì)胞DNA斷裂程度:20 nm AgNPs > 20 nm PVP-AgNPs(P<0.05)。

    2.4 納米銀對細(xì)胞核的影響

    如圖4,胞質(zhì)分裂阻滯微核細(xì)胞組學(xué)試驗中,納米銀引起細(xì)胞核出現(xiàn)Ⅰ型微核數(shù)、Ⅱ型微核、核芽、核質(zhì)橋等特征性改變,不同特性納米銀染毒HepG2細(xì)胞微核組學(xué)效應(yīng)見表3。

    如表3所示,與陰性對照組相比,20 nm AgNPs 在80 μg·mL-1、160 μg·mL-1濃度下染毒HepG2細(xì)胞后微核總數(shù)顯著升高 (P<0.01);20 nm PVP-AgNPs在20 μg·mL-1、40 μg·mL-1、80 μg·mL-1、160 μg·mL-1濃度下染毒HepG2細(xì)胞后微核總數(shù)均顯著升高 (P<0.01)。20 nm AgNPs在80 μg·mL-1、160 μg·mL-1濃度下染毒HepG2細(xì)胞后Ⅰ型微核數(shù)顯著升高(P<0.01);20 nm PVP-AgNPs在20 μg·mL-1、40 μg·mL-1、80 μg·mL-1、160 μg·mL-1濃度下染毒HepG2細(xì)胞后Ⅰ型微核數(shù)均顯著升高(P<0.01)。與陰性對照組相比,2種納米銀材料在160 μg·mL-1濃度下染毒HepG2細(xì)胞后Ⅱ型微核數(shù)均顯著升高(20 nm AgNPs,P<0.05;20 nm PVP-AgNPs,P<0.01)。20 nm AgNPs在160 μg·mL-1濃度下染毒HepG2細(xì)胞后核芽數(shù)顯著升高(P<0.05);20 nm PVP-AgNPs在40 μg·mL-1、80 μg·mL-1、160 μg·mL-1濃度下染毒HepG2細(xì)胞后核芽數(shù)均顯著升高(P<0.01);與陰性對照組相比,2種納米銀各濃度劑量下核質(zhì)橋數(shù)均無顯著差異(P>0.05)。各效應(yīng)指標(biāo)的組間比較結(jié)果發(fā)現(xiàn),除核質(zhì)橋外,2種納米銀材料引起的總微核數(shù)、Ⅰ型微核數(shù)、Ⅱ型微核數(shù)、核芽數(shù)均有差異(P<0.05),20 nm PVP-AgNPs對細(xì)胞核的影響大于20nm AgNPs。直線相關(guān)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),20 nm AgNPs組中,除核質(zhì)橋外,各效應(yīng)指標(biāo)均有隨染毒劑量增高而增高的趨勢(P<0.05,r>0.7),20 nm PVP-AgNPs組中,除核質(zhì)橋和核芽外,其他效應(yīng)指標(biāo)均有隨染毒劑量增高而增高的趨勢(P<0.05,r>0.7),表明納米銀對HepG2細(xì)胞的遺傳毒性損傷存在一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

    表2 2種納米銀染毒HepG2細(xì)胞Olive尾矩、尾長、尾部DNA比值結(jié)果Table 2 The results of Olive tail moment, tail length and tail DNA ratio of HepG2 cells exposed to two kinds of nano silver

    注:與空白對照組比較,aP<0.05,bP<0.01。Note:Compared with the control group,aP<0.05,bP<0.01.

    3 討論(Discussion)

    在納米銀的生產(chǎn)和應(yīng)用過程中,常用不同材料對納米銀進(jìn)行表面修飾以改善其分散性和穩(wěn)定性,如PVP、檸檬酸鈉和多聚糖等,不同包被的納米銀可能影響與細(xì)胞的相互作用[9]。Ahamed等[10]用25 nm多聚糖包被的納米銀和未包被的納米銀以50 μg·mL-1對鼠胚胎干細(xì)胞與鼠胚胎纖維母細(xì)胞進(jìn)行染毒,結(jié)果發(fā)現(xiàn)多聚糖包被納米銀比未包被納米銀表現(xiàn)出更強的細(xì)胞毒性和遺傳毒性。Nguyen等[11]的研究則表明,用未包被的納米銀(20 nm、40 nm、60 nm、80 nm)染毒鼠巨噬細(xì)胞和人結(jié)腸上皮細(xì)胞比用PVP包被納米銀(10 nm、50 nm、75 nm)和檸檬酸鹽包被納米銀(10 nm、50 nm、75 nm)對細(xì)胞活性的抑制作用更大。本研究結(jié)果表明,PVP包被的納米銀與無包被的納米銀引起細(xì)胞DNA損傷與染色體畸變的程度不同,這可能與2種材料的銀離子釋放量不同有關(guān),因為納米銀的毒性作用可由粒子表面釋放的銀離子引起[12],而納米銀的表面涂層材料影響Ag+釋放[13]。

    圖4 胞質(zhì)分裂阻滯微核細(xì)胞組學(xué)試驗細(xì)胞分類注:A,雙核正常細(xì)胞;B,含有Ⅰ型微核的雙核細(xì)胞;C,含有Ⅱ型微核的雙核細(xì)胞;D,含有核芽的雙核細(xì)胞;E,含有核質(zhì)橋的雙核細(xì)胞。Fig. 4 The cell classification of cytokinesis micronuclear test cellsNote: A, double nucleus normal cell; B, cells containingⅠmicrokernel dual-core; C, cells containingⅡmicrokernel dual-core; D, binuclear cells containing nuclear sprouts; E, a dual-core cell containing a nuclear bridge.

    表3 不同特性納米銀染毒HepG2細(xì)胞微核組學(xué)效應(yīng)Table 3 Micronucleus effect of HepG2 cells exposed to nano silver with different properties

    注:與空白對照組比較,aP<0.05,bP<0.01。Note:Compared with the blank control group,aP<0.05,bP<0.01.

    本研究采用凋亡實驗、彗星實驗和胞質(zhì)分裂阻滯微核細(xì)胞組學(xué)試驗結(jié)合,從多遺傳終點和遺傳毒作用機制角度出發(fā),通過分析、比較2種不同納米銀的遺傳作用特征,從體外角度較全面地分析納米銀遺傳毒性的劑量-效應(yīng)關(guān)系。在進(jìn)行彗星實驗之前,對細(xì)胞樣本進(jìn)行“活力檢查”是很常見的,最常見的試驗是臺盼藍(lán)排斥試驗。而彗星實驗針對細(xì)胞核,而非細(xì)胞,細(xì)胞被檢測方法判定死亡不一定核就不完整(例如離心造成的細(xì)胞膜破裂,而臺盼藍(lán)染料能進(jìn)入膜破裂的細(xì)胞,使細(xì)胞染色),在這種情況下細(xì)胞活力不是一個有意義的概念,且Hoechst 33258對細(xì)胞核染色清晰,不僅能測定凋亡率,而且可以清楚地觀察到核形態(tài),所以,在評價遺傳毒性前,先用Hoechst 33258熒光染色法評價納米銀對HepG2細(xì)胞核形態(tài)與凋亡率的影響。

    彗星實驗結(jié)果表明,2種納米銀均會引起DNA損傷,這與很多研究結(jié)果類似[14-15],如用PVP包被納米銀處理宮頸癌(Hela)、乳腺癌(MDA-MB-231和MCF-7)細(xì)胞12或24 h,彗星實驗結(jié)果均顯示出嚴(yán)重的DNA損傷[16]。同樣,在本研究的胞質(zhì)分裂阻滯微核細(xì)胞組學(xué)試驗中,除核質(zhì)橋及核芽外,2種納米銀引起的染色體畸變各效應(yīng)指標(biāo)均呈隨染毒濃度增高而增高的趨勢,表明納米銀對HepG2細(xì)胞染色體丟失、染色體斷裂、基因擴(kuò)增與基因量改變等遺傳毒性效應(yīng)呈濃度相關(guān)性。Sahu等[17]在肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞和Caco細(xì)胞中,在0.5至15 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)納米銀誘導(dǎo)具有微核的雙核細(xì)胞頻率以濃度和時間依賴性的方式增加。Papageorgiou等[18]的研究表明,隨著納米銀濃度的增加,MCF-7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的有絲分裂指數(shù)隨之下降,濃度越大有絲分裂指數(shù)越小,并觀察到不同類型的染色體畸變。

    綜上所述,納米銀對HepG2細(xì)胞可產(chǎn)生DNA損傷、染色體畸變等遺傳毒性效應(yīng),無包被納米銀比PVP包被納米銀更容易引起DNA損傷,PVP包被納米銀比無包被納米銀更容易引起細(xì)胞染色體畸變相關(guān)效應(yīng),且損傷程度與濃度相關(guān),濃度越高遺傳損傷越嚴(yán)重。本研究通過彗星實驗與胞質(zhì)分裂阻滯微核細(xì)胞組學(xué)試驗相結(jié)合探討不同包被納米銀的體外遺傳毒性差異,為納米銀的體外遺傳毒性評估提供參考依據(jù)。

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