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    單味中藥水提物對雞源耐藥性E.coli地方株的體外抑菌活性研究

    2018-08-01 02:03:12李蘊玉李佩國張召興閆艷娟賈青輝常超越張香齋
    中國獸醫(yī)雜志 2018年4期
    關(guān)鍵詞:雞源單味訶子

    李蘊玉, 李佩國, 張召興, 閆艷娟, 賈青輝, 常超越, 張香齋

    (河北科技師范學院 河北省預防獸醫(yī)學重點實驗室, 河北 秦皇島 066604)

    雞大腸桿菌病是由禽致病性大腸桿菌(APEC)引起不同日齡的雞發(fā)生氣囊炎、肝周炎、心包炎、急性敗血癥等多種癥狀的總稱。大腸桿菌是重要的條件致病菌,具有較多的血清型,不同的地區(qū)流行的血清型也不一樣。由于抗生素在養(yǎng)雞生產(chǎn)中的不合理使用,導致了大腸桿菌產(chǎn)生了很強的耐藥性,同時也造成了藥物殘留,嚴重危害著人類的健康。

    中藥不僅對雞致病性大腸桿菌具有直接或者間接的殺滅作用,清除致病性大腸桿菌在雞體內(nèi)產(chǎn)生的內(nèi)毒素,還可以消除致病性大腸桿菌耐藥質(zhì)粒,降低耐藥性[1],并通過多個途徑調(diào)整機體的免疫機能,從而增強機體的抵抗力,具有不易產(chǎn)生耐藥性、低殘留等優(yōu)點[2]。有關(guān)中藥防治雞大腸桿菌病的相關(guān)報道較多,但中藥對耐藥性大腸桿菌的抑菌活性以及防治效果的報道較少。為此,本試驗采用24種中藥水提物對河北地區(qū)分離的雞源耐藥性E.coli地方流行株進行體外抑菌活性試驗,篩選出敏感的中藥,為進一步研究抗耐藥性E.coli復方中藥制劑提供科學依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 菌株 大腸桿菌標準質(zhì)控菌株ATCC25922、河北地區(qū)雞源耐藥性E.coli地方流行株QH15 (O2)、QH16(O38)、QH17(O89),由河北省預防獸醫(yī)學重點實驗室保存。

    1.2 試劑及儀器 五味子、黃連、金銀花、訶子等24種中藥(購自秦皇島民樂醫(yī)藥有限公司);普通營養(yǎng)培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯均(購自北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司);1%紅四氮唑、96孔細菌培養(yǎng)板(購自美國Corning公司);隔水式恒溫培養(yǎng)箱(由上海一恒科技儀器有限公司生產(chǎn));高速中藥粉碎機(由青州市精誠醫(yī)藥裝備制造有限公司生產(chǎn));常規(guī)的試劑與儀器由本實驗提供。

    1.3 菌液的計數(shù) 參考文獻報道的方法[6],取出-80 ℃保存大腸桿菌標準質(zhì)控菌ATCC25922、河北地區(qū)雞源耐藥性E.coli地方流行株QH15 (O2)、QH16(O38)、QH17(O89)菌種進行復蘇,將復蘇的菌種培養(yǎng)至對數(shù)生長期,利用平板菌落計數(shù)法進行菌落計數(shù)。

    1.4 中藥水提物的制備 用水提法制備中藥水提物,取各單味中藥100 g,粉碎后稱重,加入8~10倍蒸餾水浸泡1 h,煮開后慢火煮20 min左右,12層紗布過濾,用同樣方法再煮1次,過濾,合并2次煮的藥液進行濃縮,使其濃度為1 g/mL,離心后調(diào)整pH值為7.2~7.4,121 ℃高壓滅菌,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.5 單味中藥水提物體外抑菌圈直徑的測定 采用平板瓊脂打孔法方法,進行檢測單味中藥水提物體外抑菌圈直徑的大小,判定標準:15 mm≤抑菌直徑<20 mm為高敏;10 mm≤抑菌直徑<15 mm為中敏;10 mm以下為低敏[3-4]。

    1.6 單味中藥水提物最小抑菌濃度(MIC)的測定 參照文獻報道的改良微量二倍稀釋法測定單味中藥的MIC[5]。在96孔細菌培養(yǎng)板第1~11孔每孔加入100 μL營養(yǎng)肉湯,第1孔加入100 μL中藥水提物藥液(1g/mL),倍比稀釋到第9孔后棄100 μL,第10孔陰性對照孔,第11孔陽性對照孔,除第10孔外,每孔加10 μL菌液(108CFU/mL),37 ℃培養(yǎng)24 h后,接種于普通培養(yǎng)基上,無菌生長的稀釋梯度為該藥的MIC。

    2 結(jié)果

    2.1 單味中藥水提物體外抑菌圈直徑測定結(jié)果 由表1可知,3株雞耐藥性E.coli地方株QH15 (O2)、QH16(O38)、QH17(O89)均對訶子、五味子、五倍子、黃連、黃芩、苦參6種中藥高度敏感;分離株QH15(O2)、QH16(O38)對地丁高度敏感;QH15 (O2)、QH16(O38)、QH17(O89)均對金銀花、夏枯草、連翹3種中藥中度敏感;QH15 (O2)、QH16(O38)對青皮中度敏感;QH17(O89)對女貞子中度敏感;QH15 (O2)、QH16(O38)、QH17(O89)對板藍根、白頭翁低敏;魚腥草、大黃、黃柏等9種中藥均無抑菌作用。

    表1 單味中藥對雞耐藥性E.coli地方株體外抑菌試驗(mm)

    -:無敏感性

    2.2 單味中藥水提物MIC測定結(jié)果 由表2可知,3株雞耐藥性E.coli地方株QH15 (O2)、QH16(O38)、QH17(O89)均對訶子、五味子、五倍子、黃連、黃芩、苦參6種藥物的MIC在7.825~31.25 mg/mL之間;分離株QH15(O2)、QH16(O38)對地丁、青皮的MIC為31.25 mg/mL;3株雞耐藥性E.coli地方株均對蘇木、金銀花、夏枯草、連翹4種藥物的MIC在62.5~125 mg/mL之間;3株雞耐藥性E.coli地方株均對板藍根、白頭翁2種藥物的MIC在125~250 mg/mL之間。魚腥草、大黃、黃柏等9種中藥對標準菌株及3株雞耐藥性E.coli地方株均沒有效果。

    表2 單味中藥對雞耐藥性E.coli地方株的MIC (mg/mL)

    -:無敏感性

    3 討論

    在本試驗中,筆者采用瓊脂擴散法和改良微量二倍稀釋法測定了24種中藥水提物對雞源耐藥性E.coli地方流行株的體外抑菌活性,結(jié)果表明,3株雞耐藥性E.coli地方株對訶子、五味子、五倍子、黃連、黃芩、苦參6種中藥的抑菌圈直徑在15~24 mm之間,MIC在7.825~31.25 mg/mL之間,均高度敏感;而分離株對QH15 (O2)、QH16(O38)對青皮的抑菌圈直徑為13 mm,中度敏感,但MIC為31.25 mg/mL,說明這兩種方法測定中藥抑菌活性具有一定的相關(guān)性,同時也存在一定的差異性,與張賽奇等[5]報道相一致。

    本次試驗選取中藥可以分為清熱藥、攻下藥、收澀藥、解表藥、理氣藥等。24種中藥對河北地區(qū)的3個不同血清型的雞耐藥性大腸桿菌地方流行株體外抑菌試驗結(jié)果表明,訶子、五味子、五倍子、黃連、黃芩、苦參的抑菌效果明顯,其共同點在于都具有清熱燥濕、澀腸止瀉的功用。金銀花、夏枯草、連翹的抑菌效果次之,而魚腥草、大黃、黃柏等則沒有表現(xiàn)出抑菌效果。其結(jié)果與張立永[6]報道的通過對耐藥性大腸桿菌優(yōu)勢血清型O1+O148流行株篩選出的敏感中藥存在一定的差異性,其原因可能與雞耐藥性大腸桿菌流行的血清型、中藥的生長環(huán)境及提取工藝有關(guān)。中藥水提法提取中藥有效成分過程中,由于加熱可能使抑菌的物質(zhì)的活性降低或者破壞,從而影響了抑菌效果。另外中藥水提物還需要高壓蒸汽滅菌,在滅菌的過程中也可能降低抑菌活性,影響抑菌效果。本試驗為進一步研究抗耐藥性E.coli組方中藥制劑提供科學依據(jù)。

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