OSAHS患者缺氧誘導(dǎo)因子1α與血清肺表面活性蛋白水平的變化及意義*

趙 丹，趙遠(yuǎn)琴，邵松軍，劉維佳，張 程，張湘燕△

(1.貴州省人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科/貴州大學(xué)醫(yī)學(xué)院,貴陽 550000；2.貴州醫(yī)科大學(xué)在讀研究生，貴陽 550000)

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征 (OSAHS) 是常見的睡眠相關(guān)呼吸障礙疾病，男性患病率22%，女性17%[1]。其特點(diǎn)是睡眠過程中反復(fù)發(fā)生的間歇性低氧[2]，由于氧化應(yīng)激反應(yīng)激活炎癥通路，可導(dǎo)致心、腦血管等多系統(tǒng)損害[3-4]。缺氧條件下缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)激活可導(dǎo)致肝纖維化、心臟炎癥細(xì)胞凋亡和纖維化[5-6]。此外,OSAHS患者亦存在亞臨床肺損傷[7]。在本課題組既往的研究中發(fā)現(xiàn)，OSAHS患者肺泡表面蛋白高于正常對照人群，但具體機(jī)制仍不甚清楚。本研究擬闡明OSAHS患者HIF-1α信號傳導(dǎo)通路上調(diào)，啟動炎性反應(yīng)，導(dǎo)致下游的炎癥因子釋放，引起肺泡上皮細(xì)胞損傷，以期揭示OSAHS患者亞臨床肺損傷的機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2016年8月至2017年2月貴州省人民醫(yī)院門診及住院就診的睡眠監(jiān)測患者83例，其中男38例、女25例，年齡22～76歲，平均(47.52±14.43)歲；依據(jù)OSAHS診治指南(2011年修訂版)[8]的診斷標(biāo)準(zhǔn)，分為對照組20例、輕度OSAHS組20例、中度OSAHS組23例、重度OSAHS組20例。均排除慢性阻塞性肺疾病、哮喘、肺間質(zhì)纖維化、惡性腫瘤、結(jié)締組織病、結(jié)核病、嚴(yán)重心力衰竭、代謝性疾病及肝、腎功能不全。該研究獲貴州省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1日間愛波沃斯嗜睡評分(ESS)評分 正式進(jìn)行多導(dǎo)睡眠監(jiān)測(PSG)前，在安靜環(huán)境中，運(yùn)用ESS評估患者白天嗜睡程度。

1.2.2PSG 采用美國飛利浦Alice 5 PSG系統(tǒng)，監(jiān)測內(nèi)容包括：腦電圖、眼電圖、下頜肌電圖、心電圖、口鼻氣流、胸腹部呼吸運(yùn)動、血氧飽和度(SPO2)、體位、鼾聲、脛前肌電圖等。監(jiān)測時(shí)間自21:00至次日06:00共9 h。

1.2.3RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄 PSG后的次日06:00，空腹抽取外周靜脈血4 mL，注入肝素抗凝管，F(xiàn)icoll密度梯度法分離單個(gè)核細(xì)胞，Trizol一步法提取RNA。測定RNA濃度，按dNTP Mix．2.5 nmol/L Each 4 μL，Primer Mix 2 μL，RNA Template 2 μL，5×RT Buffer 4 μL，DTT 2 μL，HiFScript,200 U/μL 1 μL，RNase-Free Water up to 20 μL，總反應(yīng)體系20 μL逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.2.4熒光定量PCR檢測 檢索GenBank，上海生工設(shè)計(jì)合成引物:NF-κB上游5′-GCG AGA GGA GCA CAG ATA CC-3′，下游5′-CTG ATA GCC TGC TCC AGG TC-3′。HIF-1α上游5′-GAA AGC GCA AGT CCT CAA AG-3′，下游5′-TGG GTA GGA GAT GGA GAT GC-3′。內(nèi)參GAPDH上游5′-CAG GAG GCA TTG CTG ATG AT-3′，下游5′-GAA GGC TGG GGC TCA TTT-3′。PCR反應(yīng)體系：cDNA模板2 μL，25 μL 2×UltraSYBR Mixture(High Rox)上游、下游引物各1 μL，ddH2O 21 μL，總反應(yīng)體系50 μL。在PCR基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行熱循環(huán)。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以DL-2000為標(biāo)準(zhǔn)分子量對照鑒定PCR產(chǎn)物。

1.2.5Western blot法檢測 PSG后的次日06:00時(shí)，空腹抽取外周靜脈血4 mL，注入肝素抗凝管，F(xiàn)icoll密度梯度法分離單個(gè)核細(xì)胞，裂解液30 μL裂解樣品，超聲波裂解3～5次，4 ℃，12 000 r/min離心20 min，取上清液加入Buffer：DTT，煮沸10 min。5 μL上樣，聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳后轉(zhuǎn)膜，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，經(jīng)牛奶封閉后，用一抗(PBS 1∶1 000稀釋)，在4℃孵育過夜，TBST洗膜后用HRP標(biāo)記的羊抗鼠/兔IgG二抗(PBS 1∶5 000稀釋)室溫下孵育1 h。Milliore公司的顯影液顯影并拍照分析。

1.2.6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測 行PSG后的次日06:00時(shí),空腹抽取外周靜脈血4 mL，注入非抗凝管中，室溫靜置30 min后，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，留取血清。按ELISA試劑盒說明書，從室溫平衡20 min后的鋁箔袋中取出所需板條，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL，標(biāo)本孔中加入待測標(biāo)本50 μL，空白對照孔不加。除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和標(biāo)本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測抗體[腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，白細(xì)胞介素-6(IL-6)，Ⅱ型肺泡細(xì)胞表面抗原(KL-6)，肺泡表面活性蛋白-A(SP-A)，肺泡表面活性蛋白-D(SP-D)]100 μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃恒溫箱溫育60 min。棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加350 μL洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次。每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min，每孔加入50 μL終止液，在酶標(biāo)儀上測定450 nm處的吸光度值A(chǔ)450。

2 結(jié) 果

2.1基線比較 各組性別、年齡、頸圍、胸圍、腰圍、BMI、ESS指標(biāo)比較，隨著OSAHS嚴(yán)重程度的增加，輕、中、重度OSAHS組頸圍逐漸增大，高于對照組；重度OSAHS組胸圍、腰圍、BMI高于對照組(P<0．05)。年齡、性別、ESS評分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.2各組NF-κB、HIF-1αmRNA表達(dá)水平 采用熒光定量PCR檢測，中、重度OSAHS組NF-κB表達(dá)水平明顯高于對照組，重度OSAHS組HIF-1α mRNA表達(dá)水平明顯高于對照組(P<0.05)，見圖1、2。

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與輕度OSAHS組比較；c：P<0.05，與中度OSAHS組比較

表2 各組TNF-α、IL-6、SP-A、SP-D水平比較

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與輕度OSAHS組比較；c：P<0.05,與中度OSAHS組比較

a：P<0.05，與對照組比較

圖1各組血清中NF-κB mRNA表達(dá)水平

a：P<0.05，與對照組比較

圖2各組血清中HIF-1α mRNA表達(dá)水平

1～3泳道：對照組；4～6泳道：輕度OSAHS組；7～9泳道：中度OSAHS組；10～12泳道：重度OSAHS組

圖3 Western blot檢測NF-κB、HIF-1α蛋白表達(dá)水平

2.3NF-κB、HIF-1α蛋白表達(dá)水平 采用Western blot法檢測，與對照組比較，重度OSAHS組NF-κB、HIF-1α蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，見圖3。

2.4TNF-α、IL-6、SP-A、SP-D水平比較 采用ELISA檢測，與對照組比較，中、重度OSAHS組TNF-α升高，重度OSAHS組IL-6升高(P<0.05)。與對照組比較，輕、中、重度OSAHS組SP-A升高，中、重度OSAHS組SP-D升高(P<0.05)。與輕度OSAHS組比較，中、重度OSAHS組SP-A、SP-D升高(P<0.05)。與中度OSAHS組比較，重度OSAHS組SP-D升高(P<0.05)，見表2。

2.5相關(guān)性分析 血清SP-A水平與HIF-1α mRNA相對表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.197，P<0.05)。其余TNF-α、IL-6、SP-D水平與HIF-1α mRNA及NF-κB mRNA相對表達(dá)水平的相關(guān)性分析差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

圖4 血清SP-A水平與HIF-1α mRNA表達(dá)水平相關(guān)性

3 討 論

OSAHS被認(rèn)為是一個(gè)復(fù)雜的、多因素和基因疾病,主要的病理生理機(jī)制是睡眠時(shí)反復(fù)發(fā)生的上呼吸道塌陷阻塞，導(dǎo)致慢性間斷性低氧。重復(fù)性缺氧和再氧化引起線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙，過度活化的NADPH氧化酶、黃嘌呤氧化酶和解偶聯(lián)一氧化氮合酶，誘導(dǎo)前氧化物與抗氧化劑之間的不平衡，引起氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)增強(qiáng)，導(dǎo)致局部和全身炎癥[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，重度OSAHS患者血清HIF-1α mRNA、NF-κB mRNA水平及蛋白質(zhì)水平均高于對照組，血清TNF-α、IL-6水平也隨之增加。考慮與OSAHS患者體內(nèi)間斷低氧，激活HIF-1α及NF-κB等相關(guān)的炎癥通路，導(dǎo)致下游炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子表達(dá)增加有關(guān)[11-13]。

血清肺表面活性蛋白SP-A、SP-D的水平可作為多種疾病潛在生物標(biāo)志物，包括間質(zhì)性肺纖維化(IPF)、慢性阻塞性肺疾病、肺氣腫和睡眠呼吸暫停，能有效反映肺損傷程度[14-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，重度OSAHS患者血清中SP-A、SP-D水平均升高。其機(jī)制可能與OSAHS患者夜間間斷缺氧及再氧合損傷肺泡屏障、致肺泡部位內(nèi)皮細(xì)胞、Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞損傷，局部血管內(nèi)皮通透性升高，從而使肺組織SP-A、SP-D滲出到血液中，引起血清中SP-A、SP-D水平增加。同時(shí)血清SP-A、SP-D水平與OSAHS嚴(yán)重程度相關(guān)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)血清SP-A水平與HIF-1α mRNA相對表達(dá)水平呈正相關(guān)?？紤]血清中SP-A的表達(dá)水平升高，可能與HIF-1α通路激活后，大量炎癥因子釋放，導(dǎo)致肺泡內(nèi)皮細(xì)胞、Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞等損傷有關(guān)。

綜上所述，OSAHS患者在間歇性低氧下，可能通過激活HIF-1α信號通路，釋放NF-κB、TNF-α、IL-6等炎癥因子，導(dǎo)致OSAHS患者血清肺表面活性蛋白水平升高，可能參與亞臨床肺損傷的發(fā)生。