丹參酮ⅡA對髓母細(xì)胞瘤的增殖 凋亡及自噬的影響*

項 榮,鄒 劍

(成都市第五人民醫(yī)院藥劑科 611130)

髓母細(xì)胞瘤是兒童最為常見的顱內(nèi)腫瘤，占兒童顱內(nèi)腫瘤總數(shù)的12%～25%，一般認(rèn)為髓母細(xì)胞瘤起源自原始神經(jīng)胚胎殘余上皮細(xì)胞，惡性程度非常高，為WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)Ⅳ級腫瘤[1-2]。髓母細(xì)胞瘤侵襲、轉(zhuǎn)移性很強(qiáng)，易通過腦脊液侵襲至軟腦膜，手術(shù)切除后易復(fù)發(fā)，且對放化療不敏感，預(yù)后極差，因此尋找治療髓母細(xì)胞瘤的新藥物尤為重要[3]。丹參酮ⅡA為中藥丹參的重要活性成分，是由乙醇或乙醚從丹參根中提取出的櫻紅色針狀結(jié)晶，臨床主要用于心血管疾病的治療[4]。近年研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA還具有抗腫瘤的功效，其對肺癌、肝癌、白血病、乳腺癌等各類腫瘤細(xì)胞均具有毒性作用，能夠抑制癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)癌細(xì)胞分化、凋亡，抑制癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移，其作用機(jī)制可能與DNA合成被抑制、原癌和凋亡基因表達(dá)異常等有關(guān)[5-6]。丹參酮ⅡA對髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和凋亡的作用還少見報道。本研究旨在探究丹參酮ⅡA對人髓母細(xì)胞瘤D341細(xì)胞增殖、凋亡及自噬的影響，并檢測凋亡與自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，探討丹參酮ⅡA治療髓母細(xì)胞瘤的潛在價值，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株、試劑與儀器 人D341細(xì)胞株購自北京協(xié)和醫(yī)院細(xì)胞庫；丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液(規(guī)格：2 mL∶10 mg，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H31022558)購自上海第一生化藥業(yè)有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶及胎牛血清均購自美國Gibco公司；Annexin V-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自成都艾特姆生物科技有限公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)試劑盒購自上海歌凡生物科技有限公司；一抗兔抗人雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、磷酸化mTOR(p-mTOR)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)多克隆抗體均購自Bioworld生物科技公司；一抗兔抗人微管蛋白1輕鏈3-Ⅰ/Ⅱ(microtubule associated protein 1 light chain 3-Ⅰ/Ⅱ，LC3-Ⅰ/Ⅱ)、Beclin1多克隆抗體及二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG均購自美國Santa Cruz公司；透射電子顯微鏡購自日本JEM-1011公司；EPICSXL流式細(xì)胞儀購自美國Beckman Couhe公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將適量D341細(xì)胞置入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(含100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素)中，并在37 ℃、5% CO2、濕度飽和的恒溫箱中培養(yǎng)。

1.2.2MTT法檢測細(xì)胞增殖 將D341細(xì)胞用培養(yǎng)基調(diào)整為5×107/L，按每孔200 μL細(xì)胞懸液接種至96孔板中，培養(yǎng)24 h后加入丹參酮ⅡA，終濃度依次為0、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/L，設(shè)置6個復(fù)孔，以不加丹參酮ⅡA的孔作為空白對照；分別在培養(yǎng)24、48、72 h后，向每孔加入20 μL MTT液[5 mg/mL，用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解]，在37 ℃、5% CO2恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，小心棄去上清液，向每孔加入150 μL 二甲基亞砜(DMSO)，搖床振蕩10 min充分溶解結(jié)晶；用酶標(biāo)分析儀測定450 nm波長處各孔的吸光度(A)值，每組重復(fù)測定3次，求取均值。細(xì)胞增殖抑制率=(空白對照組A450 nm-給藥組A450 nm)/空白對照組A450 nm×100%。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 將D341細(xì)胞調(diào)整為5×107/L，按每孔200 μL懸液接種至96孔板，培養(yǎng)24 h后加入丹參酮ⅡA，終濃度依次為0、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/L，設(shè)置6個復(fù)孔；在培養(yǎng)72 h后，用0.01 mol/L PBS洗滌2遍后，收集細(xì)胞；用500 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，接著加入5 μL Annexin V-FITC，混勻后避光孵育15 min；用EPICSXL流式細(xì)胞儀采集數(shù)據(jù)，并用Cell Quest軟件分析凋亡細(xì)胞百分率。

1.2.4透射電鏡觀察細(xì)胞自噬 將培養(yǎng)的D341細(xì)胞分為空白對照組和5.0 mg/L丹參酮ⅡA；在培養(yǎng)72 h后，收集細(xì)胞；固定于含2.5%戊二醛、2%多聚甲醛的PBS中2 h以上；0.1 mol/L PBS洗滌；梯度乙醇脫水；丙酮包埋液包埋；先后置于37、45、60 ℃烘箱中固化；以50～60 nm厚度超薄切片；最后在透射電鏡下觀察并拍照。

1.2.5Western blot檢測細(xì)胞mTOR、p-mTOR、VEGF、LC3-Ⅰ/Ⅱ和Beclin1蛋白表達(dá) 將D341細(xì)胞調(diào)整為5×107/L，向96孔板每孔接種200 μL懸液，待細(xì)胞貼壁生長后加入丹參酮ⅡA，終濃度依次為0、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/L，設(shè)置6個復(fù)孔；在培養(yǎng)72 h后，向?qū)?yīng)孔加入適量PMSF裂解液，常規(guī)提取細(xì)胞蛋白，用BCA法定量蛋白并調(diào)好濃度。每組取50 μg蛋白樣品與上樣緩沖液混合，沸水浴使蛋白變性；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳；轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，置于含5%脫脂奶粉TBST溶液避光封閉1 h；TBST漂洗后，將膜置于一抗稀釋液(mTOR、p-mTOR、VEGF均為1∶100，LC3-Ⅰ/Ⅱ?yàn)?∶150，Beclin1為1∶1 000)中，4 ℃孵育過夜；次日早晨TBST漂洗后，置于二抗稀釋液(1∶5 000)中，搖床室溫孵育1 h；TBST漂洗后，發(fā)光液均勻加于膜上，5 min后吸去多余溶液，置于暗盒中曝光、顯影、定影。使用GIS-2020系統(tǒng)掃描并分析蛋白雜交條帶。以β-actin為內(nèi)參蛋白。

2 結(jié) 果

2.1丹參酮ⅡA對D341細(xì)胞增殖的影響 MTT結(jié)果顯示，隨著給藥濃度的增加，丹參酮ⅡA對D341存活的抑制作用不斷增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；同一丹參酮ⅡA濃度下，隨著作用時間延長，D341細(xì)胞增殖抑制率亦逐漸降低，見表1。

2.2丹參酮ⅡA對D341細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，丹參酮ⅡA可顯著誘導(dǎo)D341細(xì)胞凋亡(P<0.05)，隨著給藥濃度的增加，D341細(xì)胞凋亡率不斷增加(P<0.05)，見圖1。

A:0 mg/L丹參酮ⅡA;B:0.5 mg/L丹參酮ⅡA;C:1.0 mg/L丹參酮ⅡA;D:2.0 mg/L丹參酮ⅡA;E:5.0 mg/L丹參酮ⅡA

圖1丹參酮ⅡA處理D341細(xì)胞72 h時流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

表1 不同濃度丹參酮ⅡA對D341細(xì)胞存活率的影響

a：P<0.05，與丹參酮ⅡA 0 mg/L比較

2.3丹參酮ⅡA對D341細(xì)胞自噬的影響 透射電鏡結(jié)果顯示，對照組D341細(xì)胞膜完整，染色質(zhì)呈均勻分布；5.0 mg/L丹參酮ⅡA處理72 h時發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮、邊緣化，一些細(xì)胞明顯裂解，細(xì)胞質(zhì)中可見空泡結(jié)構(gòu)，見圖2。

A:0 mg/L丹參酮ⅡA;B:5.0 mg/L丹參酮ⅡA

圖2丹參酮ⅡA處理D341細(xì)胞72 h時透射電鏡檢測結(jié)果

2.4丹參酮ⅡA對D341細(xì)胞mTOR、p-mTOR、VEGF表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，隨著丹參酮ⅡA濃度的增加，D341細(xì)胞中mTOR蛋白表達(dá)水平變化不明顯(P>0.05)，p-mTOR和VEGF蛋白表達(dá)水平逐漸降低(P<0.05)，見圖3、表2。

圖3 丹參酮ⅡA對D341細(xì)胞中mTOR、p-mTOR、VEGF表達(dá)的影響

表2 D341細(xì)胞中mTOR、p-mTOR、VEGF蛋白相對表達(dá)灰度值

a：P<0.05，與丹參酮ⅡA 0 mg/L比較；以β-actin作為內(nèi)參基因

圖4 丹參酮ⅡA對D341細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3-Ⅰ/Ⅱ表達(dá)的影響

2.5丹參酮ⅡA對D341細(xì)胞LC3-Ⅰ/Ⅱ、Beclin1表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，隨著丹參酮ⅡA濃度的增加，D341細(xì)胞中LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)水平逐漸降低(P<0.05)，LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平逐漸升高(P<0.05)，Beclin1蛋白表達(dá)水平逐漸升高(P<0.05)。見圖4、表3。

表3 D341細(xì)胞中LC3-Ⅰ/Ⅱ、Beclin1蛋白相對表達(dá)灰度值

a：P<0.05，與丹參酮ⅡA 0 mg/L比較；以β-actin作為內(nèi)參基因

3 討 論

丹參酮ⅡA是從中藥丹參中提取出的脂溶性物質(zhì)，可抵抗多類腫瘤細(xì)胞，近年該藥物的抗癌機(jī)制研究成為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。丹參酮ⅡA能夠從多方面發(fā)揮抑瘤作用：阻滯腫瘤細(xì)胞周期，抑制腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、凋亡，降低腫瘤細(xì)胞黏性，以及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬，但其具體調(diào)控機(jī)制還需深入研究[7-9]。

本研究結(jié)果顯示，隨著給藥濃度的增加，丹參酮ⅡA對D341細(xì)胞增殖、凋亡的抑制作用不斷增強(qiáng)，而且同一濃度下，隨著時間延長，D341細(xì)胞增殖、凋亡抑制率亦逐漸增加，說明丹參酮ⅡA可抑制D341細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)D341細(xì)胞凋亡。mTOR是最初從酵母中發(fā)現(xiàn)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，隨后發(fā)現(xiàn)其在哺乳動物中也廣泛存在，有助于細(xì)胞檢測周圍營養(yǎng)物質(zhì)而調(diào)控細(xì)胞的增殖、生長和代謝。在人體內(nèi)，mTOR作為分子傳感器，使細(xì)胞對正常或極端的內(nèi)環(huán)境做出正確應(yīng)答[10-12]。有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，mTOR信號通路主要調(diào)控細(xì)胞周期G1期相關(guān)蛋白的合成，與多類惡性腫瘤的生長、增殖、分化、凋亡等關(guān)系密切，起著重要的調(diào)控作用，mTOR被過度磷酸化激活后可導(dǎo)致癌癥發(fā)生，故抑制mTOR通路能阻滯細(xì)胞周期進(jìn)展，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13-14]。本研究Western blot結(jié)果顯示，隨著丹參酮ⅡA濃度的增加，D341細(xì)胞中mTOR蛋白表達(dá)水平變化不明顯，mTOR蛋白的磷酸化水平逐漸降低，說明丹參酮ⅡA對mTOR蛋白表達(dá)無明顯作用，但可抑制mTOR蛋白的磷酸化。腫瘤血管不斷新生是腫瘤生長、遷移的關(guān)鍵，VEGF為很常見的血管生長促進(jìn)因子[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著丹參酮ⅡA濃度的增加，D341細(xì)胞中VEGF蛋白表達(dá)水平逐漸降低，說明丹參酮ⅡA可能通過抑制VEGF相關(guān)通路而促進(jìn)D341細(xì)胞凋亡。

自噬能消化構(gòu)型異常的蛋白質(zhì)、多余或受損的細(xì)胞器為細(xì)胞提供養(yǎng)分與能量，是真核細(xì)胞特有的保護(hù)機(jī)制[17]。大量研究表明，自噬與腫瘤、感染、神經(jīng)退化、炎癥等疾病的發(fā)生、發(fā)展過程有關(guān)[18]。本研究透射電鏡結(jié)果顯示，對照組D341細(xì)胞膜完整，染色質(zhì)呈均勻分布；5.0 mg/L丹參酮ⅡA處理72 h時發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮、邊緣化，一些細(xì)胞明顯裂解，說明丹參酮ⅡA可促進(jìn)D341細(xì)胞自噬。自噬相關(guān)蛋白LC3在進(jìn)化過程中高度保守，為自噬體產(chǎn)生的標(biāo)志，可特定地反映出胞內(nèi)自噬體的多少。LC3包括Ⅰ型與Ⅱ型，LC3-Ⅰ定位在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，其可與磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ定位在自噬體膜的表面，參與自噬體的形成，常被用于衡量細(xì)胞自噬的程度[19]。Beclin1是首先被發(fā)現(xiàn)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞自噬的因子，在各類惡性腫瘤中Beclin1蛋白表達(dá)較正常組織下調(diào)，其雜合子的異常缺失也可能為腫瘤惡化的一個重要原因[20-21]。Western blot結(jié)果顯示，隨著丹參酮ⅡA濃度的增加，D341細(xì)胞中LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)水平逐漸降低，LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平逐漸升高，Beclin1蛋白表達(dá)水平逐漸升高，說明丹參酮ⅡA可能通過上調(diào)LC3-Ⅱ、Beclin1表達(dá)和下調(diào)LC3-Ⅰ表達(dá)來促進(jìn)D341細(xì)胞自噬。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA可抑制髓母細(xì)胞瘤D341細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)D341細(xì)胞凋亡，促進(jìn)D341細(xì)胞自噬，且可能與p-mTOR、VEGF、LC3-Ⅰ表達(dá)下調(diào)及LC3-Ⅱ、Beclin1表達(dá)上調(diào)有關(guān)。然而腫瘤發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)影響因素很多，機(jī)制復(fù)雜，丹參酮ⅡA對D341細(xì)胞的抑制作用還需繼續(xù)深入地探究。