164例抗核抗體斑點(diǎn)型陽性者血清抗核抗體譜聚類分析

羅雯斌，王曄愷，于 倩，林奇龍

（舟山醫(yī)院檢驗(yàn)中心，浙江 舟山 316000）

自身抗體是針對(duì)自身組織、器官、細(xì)胞及細(xì)胞成分的抗體，是自身免疫性疾?。╝utoimmune disease，AID）的重要標(biāo)志[1]。臨床上比較常見的自身抗體檢測(cè)項(xiàng)目包括抗核抗體（antinuclear antibody，ANA）、ANA譜和抗雙鏈DNA（double-stranded DNA，ds-DNA）抗體，這3項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)相對(duì)方便，也是AID的重要標(biāo)志物[2]。ANA雖然本身不能單獨(dú)診斷任何疾病，但對(duì)于系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）、混合性結(jié)締組織?。╩ixed connective tissue disease，MCTD）、干燥綜合征（Sj?gren's syndrome，SS）等疾病具有重要的支持診斷和預(yù)后判斷意義[3]。斑點(diǎn)型作為ANA核型中的重要組成部分，在診斷上述疾病中有著非常重要的意義。為了探討ANA斑點(diǎn)型陽性者血清ANA譜的特征，本研究通過聚類分析研究ANA斑點(diǎn)型陽性者不同類型ANA的聚類現(xiàn)象以及不同類別與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性，為臨床診斷AID提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2014年8月—2016年8月舟山醫(yī)院門診和住院患者中ANA斑點(diǎn)型陽性者164例，其中男38例、女126例，年齡（53.6±11.2）歲，經(jīng)臨床明確診斷，符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)風(fēng)濕病學(xué)分會(huì)和美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（American College of Rheumatology，ACR）的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4-5]，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）57例、 SLE 29例、SS 60例、MCTD 18例。采用非抗凝真空管采集所有患者靜脈血4 mL，靜置30 min后，894×g離心10 min，分離血清。

1.2 方法

1.2.1 全血細(xì)胞測(cè)定 采用LH750全自動(dòng)血液分析儀（美國(guó)Beckman-Coulter公司）及配套試劑檢測(cè)白細(xì)胞（white blood cell，WBC）、血紅蛋白（hemoglobin，Hb）和血小板（platelet，PLT）。

1.2.2 抗環(huán)瓜氨酸肽（cyclic citrullinated peptide，CCP）抗體測(cè)定 抗CCP抗體采用金標(biāo)法測(cè)定，試劑盒購自上?？菩律锛夹g(shù)有限公司，嚴(yán)格按試劑說明書操作。

1.2.3 生化及免疫指標(biāo)測(cè)定 采用AU640全自動(dòng)生化分析儀（日本Olympus公司）及配套試劑檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、總膽紅素（total bilirubin，TB）、球蛋白（globulin，GLB）、肌酐（creatinine，Cr）、尿素水平。采用IMMAGE 800全自動(dòng)特定蛋白分析儀（美國(guó)Beckman-Coulter公司）及配套試劑檢測(cè)抗鏈球菌溶血素O（anti-streptococcal hemolysin O，ASO）、類風(fēng)濕因子（rheumatoid factor，RF）、C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）、免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）、免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）、免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）、補(bǔ)體（complement，C） 3、C4。

1.2.4 ANA測(cè)定 分別采用間接免疫熒光法（indirect immunofluorescence，IIF）和免疫印跡法平行檢測(cè)ANA和ANA譜。在IIF測(cè)定中，抗體效價(jià)≥1∶100即視為ANA陽性。在免疫印跡法測(cè)定ANA譜中，篩查抗nRNP/Sm、抗Sm、抗SS-A、抗Ro-52、抗SS-B、抗Scl-70、抗PM-Scl、抗Jo-1、抗CENP B、抗PCNA、抗ds-DNA、抗核小體、抗組蛋白、抗核糖體P蛋白和抗AMA-M2抗體。試劑盒均購自德國(guó)歐蒙公司，嚴(yán)格按照試劑說明書操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。首先將ANA抗體譜中定性指標(biāo)轉(zhuǎn)化為數(shù)值，陽性為1，陰性為0，然后采用聚類法進(jìn)行分類，Mean法驗(yàn)證冰柱圖分類的顯著性。呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用±s表示，多組間比較采用方差分析和LSD檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ANA譜陽性率分析

164例ANA斑點(diǎn)型陽性者經(jīng)聚類法分類并檢驗(yàn)后最終分為3類：A類（120例）以抗SS-A、抗Ro-52、抗SS-B的高陽性率為特征，B類（21例）以抗U1-RNP的高陽性率為特征，C類（23例）以抗Sm、抗核糖體P蛋白、抗ds-DNA、抗核小體、抗組蛋白的高陽性率為特征。見表1。

2.2 A類、B類和C類患者所患疾病的分布

與A類、B類和C類最相關(guān)的疾病分別是SS、MCTD和SLE。SS患者多表現(xiàn)為A類，即以抗SS-A、抗Ro-52、抗SS-B抗體陽性為主，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=16.38，P＜0.01）；MCTD患者多表現(xiàn)為B類，即以抗U1-RNP抗體陽性為主，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=62.59，P＜0.01）；SLE患者多表現(xiàn)為C類，即以抗Sm、抗核糖體P蛋白、抗ds-DNA、抗核小體、抗組蛋白抗體陽性為主，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=59.11，P＜0.01）。見表2。

2.3 A類、B類和C類患者實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的比較

B類患者抗CCP抗體陽性率顯著高于A類和C類患者（P＜0.01）。C類患者Cr、IgG、GLB高于A類和B類患者，而WBC則低于A類和B類患者（P＜0.01）。其他各項(xiàng)指標(biāo)各組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表1 A類、B類和C類患者ANA譜陽性率的比較 [例（%）]

表3 A類、B類和C類患者實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的比較

3 討論

AID是一種自身免疫細(xì)胞、因子過度活化，自身抗體大量產(chǎn)生造成的多器官廣泛損傷的慢性疾病，近年來其發(fā)病率呈逐步上升趨勢(shì)[6]。作為AID診斷5個(gè)依據(jù)之一的血清ANA也逐漸受到臨床的關(guān)注[7]。聚類分析能通過離差平方和法將同質(zhì)的疾病或患者群進(jìn)行歸類分析，以便于后續(xù)的觀察，特別適合于臨床表現(xiàn)復(fù)雜、自身抗體表現(xiàn)眾多的AID。

斑點(diǎn)型又稱為核顆粒型、核斑塊型。分裂期細(xì)胞核質(zhì)染色呈斑點(diǎn)型、斑塊狀，核仁陰性，分裂期細(xì)胞染色質(zhì)陰性。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，斑點(diǎn)型是ANA眾多熒光模型中陽性率最高的[8]。本研究結(jié)果顯示，對(duì)ANA陽性者進(jìn)行聚類分析后發(fā)現(xiàn)能初步分為高抗SS-A、抗Ro-52、抗SS-B類，高抗U1-RNP類和高抗Sm、抗核糖體P蛋白、抗ds-DNA、抗核小體、抗組蛋白類。這3類人群中的主要代表性疾病分別為SS、MCTD、SLE。這提示檢測(cè)ANA譜組合有助于臨床對(duì)AID的診斷和鑒別診斷。另外，利用自身抗體的出現(xiàn)可能早于（甚至提前10年）臨床癥狀的出現(xiàn)和發(fā)病這一特點(diǎn)，可以有針對(duì)性地預(yù)測(cè)相應(yīng)疾病[9]。RF不能用聚類分析的方法獲得特征性的抗體組合，這可能與RF既能單獨(dú)又能伴隨其他AID發(fā)生有關(guān)[10]。

本研究結(jié)果顯示，B類患者抗CCP抗體陽性率明顯高于A類和C類患者。這可能是由于抗CCP抗體是RA的血清標(biāo)志物，而MCTD是一種同時(shí)或不同時(shí)具有SLE、多發(fā)性肌炎、硬皮病、RA等疾病混和表現(xiàn)的疾病，不少患者存在與RA類似的關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞的癥狀，所以抗CCP抗體在MCTD患者中有較高的陽性率，與文獻(xiàn)報(bào)道[11]一致。同時(shí)還提示抗CCP抗體可能有助于SS、MCTD、SLE的鑒別診斷。本研究結(jié)果還顯示，C類患者存在低水平的WBC和高水平的IgG、Cr，提示這類SLE高發(fā)人群可能存在較高風(fēng)險(xiǎn)的腎和血液系統(tǒng)損傷[17]，需進(jìn)行針對(duì)性治療，防止進(jìn)一步惡化為尿毒癥或造血危象。同時(shí)，C類患者高GLB水平提示體內(nèi)可能存在廣泛的免疫系統(tǒng)紊亂，并通過免疫復(fù)合物等途徑誘導(dǎo)炎癥，造成多器官、多系統(tǒng)損傷[13]。

綜上所述，對(duì)ANA斑點(diǎn)型陽性者進(jìn)行血清ANA的譜聚類分析研究有助于臨床提高AID的檢出率并給予及時(shí)的對(duì)癥治療。