響應(yīng)面法優(yōu)化白刺花中總氨基酸的提取工藝研究

紅河衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，云南 蒙自 661199

白刺花又名苦豆花、狼牙刺，在南方各地均有大量分布[1]，其花為漢族民間及少數(shù)民族習(xí)用，在民間有廣泛的用藥基礎(chǔ)和豐富的藥物資源[2]，同時(shí)也是藥食兩用之品[3]。白刺花有清熱利咽、涼血消腫等作用，主治咽喉腫痛、便血、肺熱咳嗽、痢疾、淋證、水腫、衄血、尿血等；花有清熱解暑作用,用于暑熱煩渴作用[4]。此外白刺花還含有大量的營(yíng)養(yǎng)成分，如多種氨基酸等[5]。基于白刺花良好的藥食兩用用價(jià)值，筆者欲將野生白刺花開(kāi)發(fā)成為保健速溶茶，現(xiàn)通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究，優(yōu)化出白刺花中總氨基酸的最佳提取方法，為白刺花保健速溶茶的開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 A580型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(翱藝儀器有限公司)；ML204分析天平(上海亞榮儀器有限公司)；FA2004電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；HH-4 型恒溫水浴鍋(常州潤(rùn)華電器有限公司)；DLF-18型流水式中藥粉碎機(jī)(溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司)；RE-3000A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮儀器有限公司)。

1.2 材料 甘氨酸對(duì)照品(分析純，批號(hào):130518，中國(guó)新型化工試劑研究所)；苯駢戊三酮(茚三酮，分析純，批號(hào)：20110414)；磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.8，實(shí)驗(yàn)室配制)；白刺花采自紅河州豆科小灌木植物白刺花的花；所用到的其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定方法

2.1.1 茚三酮溶液的制備 精密稱取茚三酮約0.5g 置于25 mL 量瓶中，加適量無(wú)水乙醇溶解后定容成2%的茚三酮溶液，冰箱冷藏備用。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備[6-7]精密稱取干燥至恒重的甘氨酸對(duì)照品5.000 mg置于50 mL容量瓶中，加適量蒸餾水溶解后，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，即得(每毫升標(biāo)準(zhǔn)品溶液含甘氨酸0.1 mg)。

2.1.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇[8]精密量取對(duì)照品溶液2 mL，置10 mL 量瓶中，加入茚三酮溶液1 mL，再加入磷酸鹽緩沖液(pH=6.8)2 mL，搖勻，水浴鍋上加熱15 min，冷卻，用蒸餾水稀釋至刻度，以空白試劑作參照，于波長(zhǎng)400～600 nm范圍內(nèi)掃描，569 nm波長(zhǎng)處有一最大吸收峰，故選擇569 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密移取對(duì)照品溶液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mL 于 10 mL 量瓶中，按“2.1.3”項(xiàng)下方法顯色后，選擇569 nm波長(zhǎng)，用空白試劑做參照，測(cè)定6種溶液的吸光度值。以濃度(X)為橫坐標(biāo)，吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，得線性回歸方程Y=76.243X-0.0041，R2=0.9998，對(duì)照品溶液濃度與吸光度在0.002～0.012 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 甘氨酸對(duì)照品線性關(guān)系考察表

2.1.5 供試品溶液的制備 將白刺花原料粉碎，過(guò)60目篩，取粗粉過(guò)的白刺花5 g，按實(shí)驗(yàn)設(shè)定的條件進(jìn)行提取，提取液減壓抽濾，濾液定容至100 ml，即得供試品溶液。

2.1.6 樣品中總氨基酸的含量測(cè)定 精密量取2 ml供試品溶液置于10 ml容量瓶中，按“2.1.3”項(xiàng)方法測(cè)定吸光度，計(jì)算總氨基酸提取率。

式中:C 為提取總氨基酸的質(zhì)量濃度，mg/mL;V1為測(cè)量液定容體積，10 mL;V2為測(cè)量時(shí)量取的體積，2 mL;V3為提取液定容體積，100mL;m為稱取樣品的質(zhì)量，5000 mg。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 精密度試驗(yàn) 分別精密移取對(duì)照品溶液2mL和供試品溶液2 mL，分別于569 nm波長(zhǎng)處以空白溶劑為對(duì)照，按2.1.3項(xiàng)方法測(cè)定吸光度(n=6)，結(jié)果對(duì)照品溶液吸光度的RSD=0.16% ，供試品溶液的RSD=0.23%，表明該試驗(yàn)方法精密度良好 。

2.2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密移取供試品溶液2 mL，按“2.1.3”項(xiàng)方法，分別于 0、30、60、90、120、150、180測(cè)定吸光度，結(jié)果樣品溶液顯色后180min內(nèi)吸光度的RSD=1.37% ，表明供試品溶液顯色穩(wěn)定。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次藥材，按“2.1.5”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密移取該供試品溶液2 mL，按2.1.3項(xiàng)下方法測(cè)定各供試品溶液的吸光度(n=6)，并計(jì)算出各供試品溶液中總氨基酸的含量，其RSD=0.19%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的白刺花藥材粗粉5 g，精密稱定，平行 6份，按2.1.5項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密量取各供試品溶液2 mL置于10 mL容量瓶中，在各容量瓶中分別加入1、2、3、4、5、6 mL的甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液(甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶度為0.1 mg/mL)，按2.1.3項(xiàng)下方法測(cè)定各供試品溶液的吸光度，計(jì)算各供試品溶液中總氨基酸的含量，并計(jì)算各供試品溶液中總氨基酸的回收率，結(jié)果平均回收率為99.91%，RSD=0.72%，表明該試驗(yàn)方法回收率良好。

2.3 單因素考察

2.3.1 加液量對(duì)白刺花中總氨基酸提取率的影響 固定白刺花中總氨基酸提取時(shí)的乙醇濃度為60% ，時(shí)間為1.5h(90min)，溫度為80℃ 等試驗(yàn)因素，考察加液量為5倍、10倍、15倍、20倍、25倍情況下所提取的總氨基酸的變化。由圖2得知，白刺花中總氨基酸的提取率隨加液量倍數(shù)的增大而增高，但加液量為20倍與加液量25倍比較，總氨基酸的提取率雖然有所提高，但提高值不大，從生產(chǎn)角度出發(fā)，加液量到25倍，意義不大。

2.3.2 提取時(shí)間對(duì)白刺花中總氨基酸提取率的影響 固定白刺花中總氨基酸提取時(shí)的加液量為20倍，乙醇濃度為 60% ，溫度為 80 ℃等試驗(yàn)因素，考察時(shí)間分別為1、1.5、2、2.5、3 h情況下所提取的總氨基酸的變化。由圖3得知，白刺花中總氨基酸的提取率在提取時(shí)間為2 h時(shí)最高，此時(shí)提取時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，提取率反而下降，故提取時(shí)間為2h時(shí)對(duì)白刺花中總氨基酸的提取較為理想。圖中也可反應(yīng)出提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，白刺花中氨基酸成分會(huì)被破壞。

2.3.3 乙醇濃度對(duì)白刺花中總氨基酸提取率的影響 固定白刺花中總氨基酸提取時(shí)的加液量為20倍，時(shí)間為2 h，溫度為80 ℃，考察乙醇濃度分別為40%乙醇 、50%乙醇 、60%乙醇 、70%乙醇 、80%乙醇情況下所提取的總氨基酸的變化。從圖4得知，在乙醇濃度為60%以后，總氨基酸的提取率在呈下降趨勢(shì)，即當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，總氨基酸的提取率達(dá)到最高。

2.3.4 提取溫度對(duì)白刺花中總氨基酸提取率的影響 固定白刺花中總氨基酸提取時(shí)加液量為20倍，時(shí)間2 h，乙醇濃度為60%，考查溫度分別為40、50、60、70、80、90℃情況下所提取的總氨基酸的變化。從圖5得知，隨著溫度升高，白刺花中氨基酸提取率在增高，當(dāng)溫度達(dá)到70 ℃ 時(shí)，白刺花中總氨基酸提取率達(dá)到最高。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化白刺花中總氨基酸提取工藝 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇乙醇濃度(A)、加液量(B)、提取溫度(C) 和提取時(shí)間(D)為考察因素，利用 Design-Expert8.0.6軟件中的 Box-Behnken 軟件對(duì)白刺花中總氨基酸提取條件進(jìn)行優(yōu)化。以白刺花總氨基酸提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)[9-10]，以乙醇濃度(A)、加液量(B)、提取溫度 (C) 和提取時(shí)間 (D)為自變量，以總氨基酸提取率為響應(yīng)值(Y) 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，各因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。白刺花Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 白刺花中總氨基酸提取響應(yīng)面設(shè)計(jì)表

采用Design-Expert8.0.6軟件分析試驗(yàn)結(jié)果，以總氨基酸的提取率為響應(yīng)值，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得回歸方程為:Y=0.62-0.011A+0.010B-0.013C+0.033D-4.500E-003AB-6.000E-003AC-0.016AD+0.013BC+0.012BD-5.000E-004CD-0.041A2-0.031B2-0.040C2-0.055D2

使用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)方程及各因子進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，以白刺花的總氨基酸的提取率為響應(yīng)值，回歸方程顯著性檢測(cè)P﹤0.0001，表明所得二次方程模型極顯著，而失擬項(xiàng)的P值為0.2445，不顯著,R2=0.9713,表明回歸方程模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合性比較好，試驗(yàn)誤差較小，說(shuō)明采用響應(yīng)面法優(yōu)化白刺花中總氨基酸提取工藝是可行的，具有參考性[11]，其中各影響因素對(duì)白刺花總氨基酸提取率的影響順序?yàn)?提取時(shí)間>提取溫度>乙醇濃度>加液量。

表4中提取時(shí)間的P值小于0.0001，提取溫度的P值為0.0006，小于0.001，說(shuō)明提取時(shí)間及提取溫度都對(duì)白刺花總氨基酸的提取率有極顯著的影響；乙醇濃度的P值為0.002，加液量的p值為0.0038，均小于0.01，說(shuō)明乙醇濃度加液量都對(duì)白刺花總氨基酸的提取率有高顯著的影響；交互項(xiàng)AD對(duì)白刺花總氨基酸的提取率有高顯著的影響；交互項(xiàng)BC及BD對(duì)白刺花總氨基酸的提取率有顯著的影響；二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2均達(dá)到極顯著水平說(shuō)明各因素對(duì)白刺花中總氨基酸的提取率存在交互影響，而不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系[12]。

表3 白刺花Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

表4 響應(yīng)面法優(yōu)化白刺花總氨基酸提取率的方差分析表

續(xù)表4

表4 響應(yīng)面法優(yōu)化白刺花總氨基酸提取率的方差分析表

將表3中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面的曲面分析，在影響因素中選擇其中兩個(gè)交互的因素對(duì)白刺花中總氨基酸的提取率的影響進(jìn)行分析，把其他因素固定為零。根據(jù)回歸方程，考察各影響因素響應(yīng)曲面的形狀，分析各因素對(duì)白刺花中總氨基酸提取率的影響，結(jié)果如圖6～11所示。

根據(jù)Design-Expert8.0.6軟件響應(yīng)曲面優(yōu)化原理，3D曲面圖的坡度越大，說(shuō)明響應(yīng)值對(duì)于操作條件的改變影響越大；反之曲面圖坡度越小，操作條件改變對(duì)響應(yīng)值的影響也就越小[13-14]。圖 6～圖11反映了乙醇濃度、加液量、提取溫度 和提取時(shí)間四個(gè)因素交互作用對(duì)白刺花中總氨基酸提取率的影響，其中乙醇濃度及提取時(shí)間(圖8)、乙醇溫度及加液量(圖9)、提取時(shí)間及加液量(圖10)交互作用3D曲面圖坡度較大，表明這三組對(duì)白刺花中總氨基酸提取率的交互作用明顯。

通過(guò)響應(yīng)面分析優(yōu)化，用Design-Expert8.0.6軟件對(duì)回歸方程進(jìn)行計(jì)算，得到白刺花中總氨基酸的最佳工藝條件為:乙醇濃度57.89% ，加液量為21.14倍，提取溫度為68.81℃，提取時(shí)間2.18h；在此條件下模型預(yù)測(cè)總氨基酸提取率為0.6316% ?？紤]到在實(shí)際操作中，設(shè)備等各條件有限，對(duì)最佳工藝條件修正為:乙醇濃度58% ，加液量為21倍，提取溫度為69℃，提取時(shí)間為131min。

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)所修正的條件進(jìn)行了3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果白刺花中總氨基酸的平均提取率為0.6322%，與模型相對(duì)誤差為0.42%，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型擬合較好，利用響應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)化所得到的提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

3 小結(jié)

白刺花中氨基酸含量豐富，具有非常好的食用、保健作用價(jià)值和開(kāi)發(fā)利用前景。本研究以干燥的白刺花的花粗粉為原料，以乙醇為提取溶劑，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，用 Design-Expert8.0.6軟件對(duì)白刺花提取工藝參數(shù)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化。結(jié)果表明最佳的提取工藝條件為:乙醇濃度58%，加液量為21倍，提取溫度為69 ℃，提取時(shí)間為131 min。優(yōu)化所得到的最佳提取工藝是提取白刺花中總氨基酸黃酮的有效途徑，可為開(kāi)發(fā)保健速溶茶提供了參考依據(jù)。