滇重樓種子檢驗規(guī)程研究△

2018-07-31 11:01:24李瑪蘇鈦李云陳明瑋邱斌段麗

中國現(xiàn)代中藥 2018年7期

李瑪，蘇鈦，李云，陳明瑋，邱斌，段麗*

(1.云南省藥物研究所，云南昆明 650111；2.云南白藥集團創(chuàng)新研發(fā)中心，云南昆明 650111；3.云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點實驗室，云南昆明 650111)

種子是最基本的生產(chǎn)資料，是育苗生產(chǎn)的物質(zhì)基礎，開展中藥材種子檢驗規(guī)程和質(zhì)量研究，制定種子檢驗規(guī)程和種子質(zhì)量標準，能夠從源頭上保證中藥材質(zhì)量的穩(wěn)定可控[1]，是國家推進中藥標準化的一項重要任務。與農(nóng)作物種子標準化的進程相比，中藥材的種子質(zhì)量控制還非常落后，目前關于中藥材種子質(zhì)量標準控制的工作已逐步展開，諸如三七[2]、射干[3]、青蒿[4]、遠志[5]等藥材的種子質(zhì)量檢驗方法已見報道。

滇重樓ParispolyphyllaSmith var.yunnanensisHand-Mazz.是百合科重樓屬多年生宿根性草本植物[6]，以干燥根及根莖入藥，藥材名重樓，它以重樓皂苷作為有效成分，具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚之功效，用于癰腫、咽喉腫痛、毒蛇咬傷、跌打傷痛、驚風抽搐等癥[7]。隨著市場對滇重樓藥材需求的不斷增加，野生資源已不能滿足市場對滇重樓藥材的需求，人工馴化種植工作正在逐步開展。滇重樓的主要繁殖方式有切塊繁殖和種子繁殖，對比兩種繁殖方式，切塊繁殖大量消耗藥材，且繁殖率低，而種子繁殖率高，可大規(guī)模提供種苗，能夠滿足當下滇重樓種植產(chǎn)業(yè)對種苗的需求。近年來對滇重樓的研究主要集中于化學成分的分析與測定、藥理作用、栽培繁育[8]方面，但對關乎種子質(zhì)量的種子檢驗方法尚未見報道。因此，本研究對滇重樓種子的凈度、千粒重、真實性鑒定、含水量、生活力的檢測方法以及發(fā)芽條件進行系統(tǒng)的研究，以期為制定滇重樓種子檢驗規(guī)程和質(zhì)量分級標準提供依據(jù)。

1 材料

滇重樓種子收集于云南省紅河州和文山州各滇重樓栽培區(qū)，經(jīng)中科院昆明植物研究所李恒研究員鑒定為百合科重樓屬植物滇重樓ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.的種子。

2 方法

2.1 扦樣

2.1.1 種子批根據(jù)滇重樓種子的市場流通情況和送驗要求，確定滇重樓種子批的最大質(zhì)量和送驗樣品的最小質(zhì)量。

2.1.2 扦取送驗樣品和試驗樣品按GB/T 3543.2-1995《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程扦樣》的規(guī)定執(zhí)行。樣品扦取后，干凈紙袋包裝，在室內(nèi)陰涼干燥處保存。

2.2 凈度分析

按GB/T 3543.3-1995《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程凈度分析》的規(guī)定執(zhí)行。四分法從送驗樣品中扦取試驗樣品，并將其分成凈種子、其他植物種子和雜質(zhì)3種成分，測定各成分的重量百分比，重復4次。

2.3 種子真實性鑒定

采用種子形態(tài)鑒定法。隨機數(shù)取種子100粒，重復3次，逐粒對大小、形狀、顏色和表面構造進行觀察并記錄。

2.4 千粒重測定

按GB/T 3543.7-1995《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程其他項目檢驗》規(guī)定執(zhí)行。分別采用百粒法、五百粒法、和千粒法進行測定。①百粒法：隨機從凈種子中數(shù)取100粒，重復8次，分別稱重，計算平均值、標準差和變異系數(shù)，變異系數(shù)(CV)<4.0%，測定值有效；②五百粒法：隨機從凈種子中數(shù)取500粒，重復4次，分別稱重，計算平均值、標準差和變異系數(shù)，變異系數(shù)(CV)<4.0%，測定值有效；③隨機從凈種子中數(shù)取1000粒，重復2次，分別稱重，計算平均值和重復間差數(shù)與平均數(shù)之比，重復間差數(shù)與平均數(shù)之比小于5.0%，測定值有效。

2.5 含水量測定

采用烘干減重法測定滇重樓種子含水量。按GB/T 3543.6-1995《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程水分測定》規(guī)定執(zhí)行。將用于盛裝樣品的小鋁盒預先烘干1 h(130～133 ℃)并置于硅膠干燥器中冷卻備用。分別采用高恒溫法和低恒溫法對種子含水量進行測定。①低恒溫法：分別在(103±2 ℃)低恒溫條件下，設置1、2、3、4、5、6、7、8、17 h計算種子水分損失量；②高恒溫法：分別在(131±2 ℃)高恒溫條件下，設置1、2、3、4、5、6、7、8、9 h計算種子水分損失量。每個處理3次重復，每次重復(5±0.001)g。

2.6 生活力測定

采用紅四氮唑(TTC)法測定種子生活力。

2.6.1 種子預處理室溫條件下，蒸餾水浸種12 h后，沿種臍縱切種子，取半粒備用。

2.6.2 染色條件的確定取上述備好的種子進行試驗：分別設置TTC溶液濃度為0.01%、0.05%、0.1%，染色時間為1、2、3、4、5、6、7、8 h，于30、35、40 ℃條件下對種子進行染色，每個處理3次重復，每個重復100粒種子。染色結(jié)束后，瀝去溶液，沖洗3～5次，觀察并計數(shù)。

2.6.3 滇重樓種子有無生活力標準建立參照種子的發(fā)芽試驗結(jié)果，建立滇重樓種子TTC染色的鑒定標準。

2.7 發(fā)芽率測定

2.7.1 發(fā)芽前處理自來水(ck)、無菌水、0.1%高錳酸鉀、1%次氯酸鈉各浸種10 min后，ck和無菌水浸種處理組直接置床，其余2處理組無菌水沖洗3次后置床，采用紙上法，置于20 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，觀察種子污染率，每個處理50粒種子，3次重復。

2.7.2 適宜發(fā)芽床的確定發(fā)芽床設3個處理：(1)紙上：培養(yǎng)皿中鋪2層充分吸濕的濾紙，將預處理的種子均勻置床；(2)砂上：將拌好的含水量為20%的濕砂在培養(yǎng)皿內(nèi)鋪10 mm厚，種子均勻置床，(3)蛭石：將拌好的含水量為20%的蛭石在培養(yǎng)皿內(nèi)鋪10 mm厚，種子均勻置床，培養(yǎng)條件為20 ℃黑暗培養(yǎng)，每個處理50粒種子，3次重復，觀察統(tǒng)計種子發(fā)芽情況。

2.7.3 適宜發(fā)芽溫度的確定發(fā)芽床為紙上，發(fā)芽溫度設定為恒溫15、20、25 ℃，黑暗下培養(yǎng)，每個處理50粒種子，3次重復，觀察種子發(fā)芽情況。

2.7.4 光照對種子發(fā)芽的影響以紙上為發(fā)芽床，于20 ℃恒溫條件下進行光照(12 h光照，12 h黑暗)和24 h全黑暗處理，每個處理50粒種子，3次重復，觀察種子發(fā)芽情況。

2.7.5 發(fā)芽計數(shù)時間確定根據(jù)種子發(fā)芽表現(xiàn)，確定初次計數(shù)時間和末次計數(shù)時間。以胚根伸出種皮2 mm時的天數(shù)為初次計數(shù)時間，以種子發(fā)芽數(shù)達到最高時，以后再無發(fā)芽種子出現(xiàn)時的天數(shù)為末次計數(shù)時間。

2.7.6 結(jié)果統(tǒng)計試驗結(jié)果以發(fā)芽率表示：

(1)

3 結(jié)果與分析

3.1 扦樣

滇重樓種子批的最大質(zhì)量為2000 kg，凈度分析試樣是按至少含有2500粒種子推算而來，根據(jù)3.4結(jié)果，滇重樓種子千粒重為62.42 g，2500粒種子重量為187.26 g，所以確定滇重樓凈度分析試樣的最小重量為200 g，送驗樣品為凈度分析的10倍以上，最少為2000 g。

3.2 凈度分析

試驗中滇重樓種子均由所收集的果實洗去果皮并陰干表面水分所得，試樣均沒有其他植物種子，亦無雜質(zhì)，凈度為100%。

3.3 真實性鑒定

滇重樓果實蒴果室背開裂，棕黃色；種子多數(shù)，種皮肉質(zhì)多汁，櫻紅色，長：6.64～7.42 mm，寬：5.09～5.52 mm，厚：5.47～6.10 mm；除去假種皮后種子呈卵球形，種子堅硬，光滑，呈白色，長：4.85～5.97 mm，寬：3.75～4.65 mm，厚：3.53～4.65 mm；種子一側(cè)有黃白色圓形種臍。

3.4 千粒重測定

隨機選取經(jīng)凈度分析后的滇重樓種子試樣進行測定，結(jié)果見表1。采用百粒法測定結(jié)果顯示變異系數(shù)(CV)大于4.0%，所以百粒法不適用于滇重樓種子千粒重的測定；根據(jù)結(jié)果顯示采用五百粒法及千粒法兩種方法測定時，測定值均有效，鑒于500粒法所用種子數(shù)量較少，因此，滇重樓種子適宜的千粒重測定方法為五百粒法。

表1 滇重樓種子千粒重測定

3.5 含水量測定

滇重樓種子含水量測定結(jié)果見表2。高恒溫烘干法中，1～6 h滇重樓種子水分不斷失去，是快速失水期，失去自由水；6～7 h水分散失減慢，是緩慢失水的時期，7～9 h水分散失顯著減慢，是較慢的失水期，失去分解水，失水量趨于穩(wěn)定，烘干8 h與9 h之間無顯著差異；低恒溫烘干中，1～4 h滇重樓種子水分不斷失去，是快速失水期，失去自由水；之后水分散失減慢，是緩慢失水的時期；烘干17 h后種子含水量與高恒溫烘干8 h無顯著差異。因此，使用高恒溫烘干法烘干8 h測定滇重樓種子含水量。

表2 滇重樓種子水分測定

注：處理間多重比較采用LSD法，差異顯著性分析取P= 0.05水平，同一列中含有不同字母表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3.6 生活力測定

3.6.1 染色條件的確定滇重樓種子染色情況受染色的時間、溫度和染色液濃度的影響，生活力測定結(jié)果見表3。綜合染色時間、濃度及染色效果，在30 ℃、0.01%TTC溶液染色效果最好；并且染色7 h與染色8 h無顯著差異。因此30 ℃、0.01%TTC溶液中染色7h宜作為滇重樓種子生活力檢測的染色條件。

3.6.2 有無生活力鑒定標準的確定滇重樓種子脫落時，胚極不發(fā)育，而是一個很小、未完全分化的多細胞橢圓體，肉眼很難觀察到滇重樓種子的胚，根據(jù)TTC染色法的原理，結(jié)合滇重樓種子的實際情況，有活力的滇重樓種子整個縱切面被TTC染為鮮紅色，染色均勻。滇重樓種子有無生活力鑒定標準如下，有活力的滇重樓種子：胚乳被TTC溶液染為鮮紅色或淺紅色，種子切面全部著色或大部分著色，染色均勻；無生活力的滇重樓種子：胚乳完全不著色或著淺色，染色不均勻；或局部著色，著色較淺。