白頭翁總皂苷及其主要成分抗腫瘤藥效及其構(gòu)效關(guān)系的研究△

羅穎穎，嚴(yán)新，謝欣序，王木蘭，馮育林，楊世林，李俊**

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué) 國家工程研究中心，江西 南昌 330006；2.江西本草天工科技有限責(zé)任公司，江西 南昌 330006；3.江西中醫(yī)藥大學(xué) 第二附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006)

白頭翁Pulsatillachinensis(Bge.)Regel以干燥根入藥，是臨床常用中藥，具有清熱解毒、涼血止痢的作用，主要用于腸炎、熱毒痢等[1]。以白頭翁為主要的白頭翁湯則在臨床上廣泛用于腸道感染及其結(jié)腸炎等病癥[2-3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，白頭翁具有較好的抗炎、抗腫瘤、降血糖、抗補(bǔ)體等多種作用[4-13]。我們前期的工作表明，白頭翁總皂苷對(duì)癌有一定的抑制作用[14-15]，值得進(jìn)一步深入研究。我們?cè)谔崛》蛛x得到可測成分含量90%以上的白頭翁總皂苷的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)總皂苷中主要成分進(jìn)行了分離鑒定，得到白頭翁皂苷B3、B7、B9、B11 4個(gè)單體成分，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取白頭翁皂苷抑制效果較好的人肝癌細(xì)胞SMMC-7721及人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29進(jìn)行體外抗腫瘤活性觀察，并采用小鼠H22肝癌模型進(jìn)行4個(gè)單體皂苷成分體內(nèi)抗腫瘤活性觀察及其構(gòu)效關(guān)系探討，以期尋找白頭翁皂苷中抗腫瘤作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料

人肝癌細(xì)胞SMMC-7721(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)；人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29和小鼠H22肝癌瘤株(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心)。

白頭翁藥材，購于河北安國，產(chǎn)地為遼寧綏中市,經(jīng)蘇州大學(xué)藥學(xué)院中藥教研室李笑然教授鑒定為毛茛科白頭翁屬植物白頭翁Pulsatillachinensis(Bge.)Regel的干燥根。白頭翁總皂苷(批號(hào)：20110701)制備方法[16]：取干燥的白頭翁藥材，10倍量70%乙醇回流提取3次，每次1 h，得白頭翁總皂苷。將白頭翁總皂苷用1.0% NaOH水溶液堿水解反應(yīng)6 h后放冷過夜，用鹽酸調(diào)節(jié)pH 7.0，上D-101大孔樹脂柱，依次用水，40%、75%、95%乙醇洗脫；收集75%乙醇洗脫液，減壓濃縮，真空干燥即得棕褐色粉末狀白頭翁總皂苷。以白頭翁皂苷B3為對(duì)照品，紫外測的總皂苷含量達(dá)90%。其中含白頭翁皂苷B3 14.67%，白頭翁皂苷BD 3.09%，白頭翁皂苷B7 16.96%，白頭翁皂苷B9 7.79%，白頭翁皂苷B10 2.14%，白頭翁皂苷B11 10.15%(HPLC)。

本實(shí)驗(yàn)中考察的白頭翁總皂苷中有效成分有：白頭翁皂苷B3(anemoside B3，化學(xué)名：3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)[β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃阿拉伯糖-常春藤皂苷，B3)、白頭翁皂苷B7(anemoside B7，化學(xué)名：3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)[β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃阿拉伯糖-齊墩果酸皂苷，B7)、白頭翁皂苷B9(anemoside B9，化學(xué)名：3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖-齊墩果酸皂苷，B9)、白頭翁皂苷B11(anemoside B11，化學(xué)名：3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖-齊墩果酸皂苷，B11)，由江西本草天工科技有限責(zé)任公司提供，其中各單體成分的純度大于98%；環(huán)磷酰胺(CTX，江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：101001)。

RPMI 1640培養(yǎng)基(批號(hào)：20110509)、DMEM-H培養(yǎng)基(批號(hào)：20110329)均購自北京Solaris公司。Ham’s F12培養(yǎng)基(美國GIBCO公司，批號(hào)：030M8309)。D/F12培養(yǎng)基：先將Ham’s F12培養(yǎng)基配制后，與DMEM-H以1∶1混勻，4 ℃?zhèn)溆?；MTT(Sigma)工作液：使用時(shí)用PBS配制成5 mg·mL-1溶液，0.22 μm過濾，分裝，-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器

超凈工作臺(tái)(日本SANYO)；CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO)，倒置顯微鏡(德國OLYMPUS)，低速離心機(jī)(上海飛鴿)，酶標(biāo)儀(ThermoMultiskan MK3)。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)KM小鼠，雄性，18～22 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SCXK(湘)2009-0004。

2 方法

2.1 白頭翁總皂苷及其化學(xué)成分體外抗腫瘤活性觀察

細(xì)胞購進(jìn)后，用含10%胎牛血清的相應(yīng)培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，其中人肝癌細(xì)胞SMMC-7721培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基；人結(jié)腸癌HT29培養(yǎng)于D/F12培養(yǎng)基。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整密度為8×104個(gè)·mL-1，接種于96孔板中，每孔100 μL，24 h后加入不同濃度含藥培養(yǎng)基100 μL，使藥物終質(zhì)量濃度為3.125、6.25、12.5、25、50 μg·mL-1，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行孔，對(duì)照組每孔只加培養(yǎng)基100 μL，另設(shè)空白對(duì)照組，不加細(xì)胞只加培養(yǎng)基的作為對(duì)照凋零組。將96孔板置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，每孔加入5 g·L-1MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清液，加入DMSO 150 μL，振蕩溶解10 min，酶標(biāo)儀于490 nm處測定吸光度(A)值。棄上清液，每孔加DMSO 150 μL，振蕩混勻后用酶標(biāo)儀在檢測波長為490 nm條件下測A值，按公式(1)計(jì)算細(xì)胞抑制率，采用改良的寇氏法計(jì)算半數(shù)有效抑制濃度(IC50)[17]。

(1)

2.2 白頭翁總皂苷及其化學(xué)成分體內(nèi)抗腫瘤活性觀察

取傳代H22瘤株且生長良好的小鼠腹水，用0.9%氯化鈉溶液將腹水瘤細(xì)胞稀釋成2.5×106個(gè)·mL-1，每鼠0.2 mL接種于小鼠右側(cè)腋窩皮下，建立荷瘤小鼠模型。接種24 h后，將成功接種的KM小鼠隨機(jī)分為模型組，白頭翁總皂苷高、低劑量組(300、150 mg·kg-1)，B3、B7、B9、B11高、低劑量組(200、100 mg·kg-1)，環(huán)磷酰胺組(40 mg·kg-1)，共12組，模型組16只，其余每組12只，白頭翁總皂苷及其有效成分組每日按體質(zhì)量灌胃給藥，給藥體積0.2 mL·(10 g)-1，模型組每日給予等量0.9%氯化鈉溶液，環(huán)磷酰胺隔日腹腔注射0.1 mL·(10 g)-1，連續(xù)14 d。末次給藥24 h后，將小鼠引頸處死，剝離腫瘤，分析天平稱質(zhì)量，記錄瘤質(zhì)量，按公式(2)計(jì)算抑瘤率(%)。取胸腺、脾臟，分析天平稱質(zhì)量，記錄臟器質(zhì)量，按公式(3)計(jì)算臟器指數(shù)。

(2)

臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(10 g)

(3)

2.3 數(shù)據(jù)分析

3 結(jié)果

3.1 白頭翁總皂苷及其化學(xué)成分體外抗腫瘤作用研究

本研究主要觀察比較了白頭翁總皂苷及其主要活性成分B3、B7、B9、B11。這些主要成分都是由齊墩果酸皂苷為母核加上不同的糖組成(見圖1)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，白頭翁總皂苷、B3、B7、B9、B11均能較強(qiáng)地抑制體外人腫瘤細(xì)胞增殖，抑制率可高達(dá)100%，見表1、2。從半數(shù)有效抑制濃度(IC50)值來看，白頭翁總皂苷、B3、B7、B9、B11對(duì)SMMC-7721的IC50依次為(4.08±0.12)、(4.52±0.19)、(2.64±0.04)、(4.05±0.12)、(7.30±0.52)μg·mL-1，對(duì)HT-29的IC50依次為(3.22±0.06)、(4.28±0.16)、(2.57±0.10)、(3.29±0.11)、(5.39±0.26)μg·mL-1，均具有較好的體外抗腫瘤作用(見表3)，其中以B7對(duì)兩種細(xì)胞系均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用(2.64、2.57 μg·mL-1)(F15，4=147.6，P<0.05)。比較B3和B7可見，23位的羥基化并不能提高相應(yīng)的抑瘤活性。

3.2 白頭翁總皂苷及其化學(xué)成分體內(nèi)抗腫瘤作用研究

為了進(jìn)一步確證白頭翁總皂苷主要活性成分的抑瘤效應(yīng)，我們又進(jìn)行了小鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，白頭翁總皂苷的高、低劑量組，以及其他各活性成分的高劑量組瘤質(zhì)量均明顯減小，與模型組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，P<0.01)。各活性成分中，B7(62.1%)抑瘤活性仍然最強(qiáng)。其次為B3(57.7%)、B9(55.9%)和B11(49.2%)。白頭翁總皂苷表現(xiàn)出較好的抑瘤效應(yīng)，高、低劑量組的抑瘤率分別為71.3%和61.8%。各組動(dòng)物給藥后，體質(zhì)量、胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)都有所下降，但各組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見表4、5)。

圖1 白頭翁4種齊墩果酸皂苷成分結(jié)構(gòu)

表1 白頭翁總皂苷及其化學(xué)成分對(duì)不同人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖影響

表2 白頭翁總皂苷及其化學(xué)成分對(duì)不同人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的增殖的影響

表3 白頭翁總皂苷及各成分對(duì)SMMC-7721、HT-29細(xì)胞的

表4 白頭翁總皂苷及其化學(xué)成分對(duì)肝癌H22荷瘤小鼠瘤質(zhì)量的影響及各組抑瘤率

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；下同。

表5 白頭翁總皂苷及其化學(xué)成分對(duì)肝癌H22荷瘤小鼠瘤質(zhì)量的影響及各組抑瘤率

4 討論

本研究對(duì)白頭翁總皂苷及其4種主要成分進(jìn)行了體內(nèi)外抑瘤實(shí)驗(yàn)觀察，結(jié)果表明，白頭翁總皂苷及其化學(xué)成分B3、B7、B9、B11對(duì)體內(nèi)外瘤細(xì)胞均具有一定的抑制作用。體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)中，對(duì)人肝癌SMMC-7721及人結(jié)腸癌HT-29的IC50值在5 μg·mL-1左右，4種單體成分與白頭翁總皂苷作用相當(dāng)。體內(nèi)對(duì)小鼠H22肝癌移植瘤模型的藥效實(shí)驗(yàn)表明，B3、B7、B9、B11大劑量組(200 mg·kg-1)對(duì)小鼠H22肝癌均表現(xiàn)出明確的抑制作用，白頭翁總皂苷高(300 mg·kg-1)低(150 mg·kg-1)劑量均表現(xiàn)出明確的抑瘤作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致[18-20]，因此，白頭翁皂苷的抗腫瘤作用是肯定的。

有研究表明，白頭翁皂苷中齊墩果酸皂苷對(duì)瘤細(xì)胞抑制作用強(qiáng)于羅烷型皂苷[21]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明了齊墩果酸皂苷對(duì)瘤細(xì)胞的抑制作用。白頭翁的4個(gè)主要成分均是以齊墩果酸皂苷為母核的衍生物。其中B3和B7所連接的糖一致，只是在碳23位有羥甲基的不同，B7在碳23位是甲基，B3在碳23位是羥甲基。B9和B11的母核基本同B7，只是在所連接的糖的排列順序及其數(shù)量不同。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，B7在體內(nèi)外抑瘤實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑瘤活性，提示這種抑瘤活性與所連接的糖的順序和數(shù)量有關(guān)，與碳23位的羥基化無明顯關(guān)系。B9由4個(gè)糖連接，比B11多2個(gè)糖，但是B9的抑瘤活性強(qiáng)于B11和B3，提示糖的數(shù)量對(duì)其抑瘤活性有一定的影響。體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果與體外趨勢(shì)基本一致，最強(qiáng)的是B7，最弱的是B11。

值得注意的是，總皂苷的活性在整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑瘤作用，其藥效強(qiáng)于各單一成分，但是在體外抑瘤實(shí)驗(yàn)中，總皂苷并未表現(xiàn)出最強(qiáng)的活性。提示除了此4個(gè)成分外，總皂苷中可能還有其他的協(xié)同效應(yīng)成分。同時(shí)也表明荷瘤小鼠的內(nèi)環(huán)境對(duì)于藥物藥效的總體產(chǎn)生起到一定的促進(jìn)作用，一些體外未表現(xiàn)出明顯活性的成分在體內(nèi)微環(huán)境下可能會(huì)產(chǎn)生協(xié)同的效應(yīng)[22-23]，如此尚有待于進(jìn)一步研究。另外，本研究也提示白頭翁總皂苷作為一個(gè)復(fù)合物，其有效物質(zhì)并不是某一成分，而是不同成分作用于不同靶點(diǎn)，產(chǎn)生協(xié)同或相加作用，體現(xiàn)了中藥多成分、多途徑、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)[24]。中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究是中藥現(xiàn)代化的主要內(nèi)容之一，只有在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)明確的基礎(chǔ)上，才能有效地進(jìn)行相關(guān)中藥有效部位的研究開發(fā)以及有效單體成分的研究開發(fā)，才能為研究高效低毒、成分明確、質(zhì)量穩(wěn)定的高水平中藥新藥奠定良好的基礎(chǔ)。本工作對(duì)于進(jìn)一步深入認(rèn)識(shí)白頭翁皂苷及其相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

致謝：感謝清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院杜力軍教授對(duì)本文提出的寶貴建議。