5個產地菘藍種子萌發(fā)及幼苗生長對鹽脅迫的響應

王雨,周睿穎,馬立敏,白鈺,關佳莉,唐曉清

(南京農業(yè)大學，中藥研究所，江蘇 南京 210095)

鹽漬化土壤已成為制約農業(yè)生產及發(fā)展的全球性問題[1]。我國鹽堿地面積大、分布范圍廣，不當?shù)墓喔确绞郊盎实倪^度施用則進一步加劇了土壤的次生鹽漬化[2]。植物不同生長時期的耐鹽性有所差異，而種子萌發(fā)期是植物生長初期比較脆弱的階段，也是鹽脅迫的敏感期，并決定著植物后期的生長、產量和品質[3]。鹽脅迫會對種子萌發(fā)產生滲透脅迫和離子毒害，從而導致植物種子萌發(fā)受阻，生長發(fā)育遲緩，產量下降[4]。種子萌發(fā)過程中對這兩種效應的綜合適應則決定了種子耐鹽性，而溫度及鹽分種類等因素通過協(xié)調滲透脅迫及離子效應，最終影響種子的耐鹽能力[5]。鹽脅迫下，滲透脅迫使得棉籽種子吸水困難，發(fā)芽率下降[6]。在對鹽生植物鹽爪爪(Kalidiumfoliatum)和鹽穗木(Halostachyscaspica)的鹽分及水分脅迫研究中發(fā)現(xiàn)，滲透脅迫是抑制鹽生植物種子萌發(fā)的主要原因[7]。張萬鈞等[8]研究了等滲PEG和NaCl對鹽生植物及非鹽生植物種子萌發(fā)的影響，發(fā)現(xiàn)種子萌發(fā)可能與滲透脅迫、內部的鹽離子及相關酶活性的變化均相關。此外，植物不同種源間的遺傳差異也是影響其耐鹽性的重要因素之一。

植物在遭受脅迫時，其形態(tài)、生長、生理等方面會發(fā)生一系列變化以應對環(huán)境的改變。菘藍(Isatisindigotica)為十字花科(Cruciferae)二年生草本植物，其干燥葉入藥為中藥大青葉，具有涼血消斑、瀉火定驚等功效；其干燥根入藥為板藍根，在抗流感病毒方面具有顯著功效[9-10]。王竹承等[11]研究發(fā)現(xiàn)，土壤干旱明顯抑制菘藍生長，長時間的干旱脅迫會導致菘藍體內可溶性蛋白質、類胡蘿卜素含量的升高。而淹水條件下，菘藍根系內的乙醇脫氫酶活性增強，從而有效緩解淹水脅迫造成的傷害[12]。潘曉紅等[13]的研究表明，鹽脅迫下，外源褪黑素能夠顯著降低鹽菘藍種子的膜質過氧化水平，提高抗氧化活性。作為常用大宗藥材大青葉及板藍根的基原植物，菘藍在全國種植范圍廣、面積大，其中不乏鹽堿地，土壤鹽漬化威脅著菘藍的種植和生產。目前對于菘藍的研究多集中于藥理及藥化方面[14-15]，關于逆境脅迫對其生理生化方面的研究較少，而針對其耐鹽機理的研究則是鮮見報道。因此，本研究以來自河北保定、內蒙古包頭、遼寧鐵嶺、安徽亳州、山東濱州5個產地的菘藍為對象，探究鹽脅迫下菘藍種子萌發(fā)及幼苗生長、生理特性的變化規(guī)律，綜合評價其耐鹽性，以為菘藍抗鹽材料的篩選及耐鹽性生理研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2015年6月開始，試驗材料為分別來自河北保定(Baoding,Hebei,HB)、山東濱州(Binzhou,Shandong,SB)、安徽亳州(Bozhou,Anhui,AH)、內蒙古包頭(Baotou,Inner Mongolia,NB)、遼寧鐵嶺(Tieling,Liaoning,LT)5個產地的菘藍種子(角果，生產中稱種子)，由河北安國鑫城種業(yè)于原產區(qū)菘藍生產基地收集，經(jīng)南京農業(yè)大學園藝學院王康才教授鑒定為十字花科菘藍(I.indigotica)。

1.2 試驗方法

1.2.1種子耐鹽性試驗 挑選飽滿、大小一致的菘藍種子，用10.0% NaClO對菘藍種子消毒10 min，后用蒸餾水沖洗3～5次，用濾紙吸干種子表面水分，置于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。培養(yǎng)皿中平鋪2層濾紙，分別以0、50、100、150 mmol·L-1的NaCl溶液澆透培養(yǎng)皿底部，每皿加入相應濃度的鹽溶液15 mL，再覆蓋浸透處理液的濾紙。每個處理共設4個重復，每個重復50粒種子。將培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，第4天統(tǒng)計發(fā)芽勢，7 d后發(fā)芽結束。培養(yǎng)條件為：光照時間18 h/6 h(光/暗)，光照度10000 lx，溫度25 ℃/15 ℃(晝/夜)。培養(yǎng)過程中每2 d換一次濾紙及相應的處理液，以維持鹽溶液濃度的恒定。

1.2.2幼苗耐鹽性試驗 菘藍種子經(jīng)10% NaClO消毒后，播種于塑料盆(盆高20 cm，口徑26 cm，底徑18 cm)中，栽培基質為蛭石∶有機質=1∶1，自然采光避雨栽培。用1/2氮濃度的Hoagland營養(yǎng)液澆灌培養(yǎng)幼苗至四葉期，每盆定苗10株并開始處理，分別澆施0、50、100、150 mmol·L-1NaCl處理液，并以0 mmol·L-1NaCl處理為對照(CK)，每個處理3次重復，每個重復3盆苗，處理液均用1/2 Hoagland營養(yǎng)液配制[16]。鹽濃度每天遞增50 mmol·L-1，以避免鹽的沖擊效應，直至達到預定濃度，而后每天以預定鹽濃度的處理液澆灌一次，處理液的澆灌量為基質持水量的2倍，以保證之前積余的鹽能夠被全部沖出，從而維持各處理鹽濃度的恒定。于處理30 d后幼苗七葉期測定各項相關指標。

1.3 相關指標的記錄與測定

1.3.1種子萌發(fā)指標測定 每天觀察種子的萌發(fā)情況，并記錄發(fā)芽數(shù)(以胚軸長到約種子本身長度為發(fā)芽標準)。發(fā)芽率(GR)=∑Gt/T×100%(T為供試種子數(shù))；發(fā)芽勢(GP)=(n4/N)×100%(n4為種子發(fā)芽第4天的正常發(fā)芽粒數(shù)，N為供試種子數(shù))；發(fā)芽指數(shù)(GI) =∑(Gt/Tt)(Gt為t天內的發(fā)芽數(shù)，Tt為對應Gt的發(fā)芽天數(shù))；活力指數(shù)(VI)=GI×S(S為第7天每株平均鮮重)。相對鹽害率=(對照發(fā)芽率-鹽處理發(fā)芽率)/對照發(fā)芽率×100%[17]。待種子發(fā)芽至第7天時，從每個重復隨機抽取10株菘藍幼苗，分別測定其下胚軸長、胚根長、生長量，并稱定每10株幼苗的全株鮮重。用硫代巴比妥酸法測定丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量[18]。

1.3.2幼苗相關指標測定 幼苗處理30 d后，各處理隨機選取10株菘藍幼苗分別測定其葉片和根的鮮重，而后置于烘箱中于105 ℃的殺青15 min，于60 ℃下烘干至恒重后稱量葉片和根的干重。采用氮藍四唑(nitro-blue tetrazolium,NBT)法測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性[19]，采用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶(peroxidase, POD)的活性，試驗重復3次[19]。采用磺基水楊酸法測定菘藍葉片中的脯氨酸(proline)含量[20]。

采用模糊數(shù)學隸屬函數(shù)法對5個產地菘藍進行耐鹽性綜合評價, 利用公式：X(μ)=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)，計算各測定指標的耐鹽性隸屬函數(shù)值，式中X為某一耐鹽性指標的測定值，Xmax和Xmin分別為該指標的測定最大值及最小值，與菘藍耐鹽性呈負相關的指標用X(μ)=1-[(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)]計算。先求出不同鹽濃度下各指標的隸屬值，并將各隸屬值累加求平均值。最后將計算所得各指標的隸屬值再相加求平均值即得不同產地菘藍的耐鹽性指數(shù)[21]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 19.0及Excel 2010進行數(shù)據(jù)的處理與分析，處理間差異性比較采用LSD法。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫對不同產地菘藍種子萌發(fā)率的影響

鹽脅迫下，各產地的菘藍種子萌發(fā)率均受到不同程度的抑制(圖1)。HB、SB的菘藍種子在50 mmol·L-1NaCl處理下的發(fā)芽率與對照(CK)無顯著差異(P>0.05)；150 mmol·L-1NaCl處理下，HB發(fā)芽率與CK相比顯著降低(P<0.05)，但仍然達到79.50%，維持在較高水平上，而SB發(fā)芽率急劇下降，比CK降低了39.00%，說明HB的菘藍種子耐鹽性較強，SB對高濃度鹽耐受性較差。LT、AH、NB的菘藍種子在CK的發(fā)芽率分別為57.50%、64.50%、59.00%，在100 mmol·L-1NaCl處理分別降低至38.00%、42.50%、29.00%，而在150 mmol·L-1NaCl處理下發(fā)芽率分別低至14.00%、30.00%、6.50%，說明LT、AH、NB的菘藍種子自身活力較低，萌發(fā)過程受鹽脅迫抑制明顯，耐鹽性較差。

2.2 鹽脅迫對不同產地菘藍種子發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)的影響

由表1可以看出，隨鹽濃度升高，不同產地間菘藍的發(fā)芽勢總體上均呈逐漸降低的趨勢，且不同產地間菘藍的發(fā)芽勢存在差異。HB菘藍各鹽處理間的發(fā)芽勢無顯著差異(P>0.05)，150 mmol·L-1NaCl處理時發(fā)芽勢仍達到77.00%，與CK相比下降了21.03%；NB產地在50 mmol·L-1NaCl處理時發(fā)芽勢無顯著變化(P>0.05)，而在150 mmol·L-1NaCl處理時下降了70.75%。AH、LT菘藍的發(fā)芽勢在50 mmol·L-1NaCl時顯著降低，高濃度的鹽脅迫對其種子萌發(fā)的抑制作用明顯。鹽脅迫條件下，菘藍種子發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)的變化規(guī)律與發(fā)芽率基本一致，其中HB、SB菘藍種子各處理組的發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)均高于其他產地，其耐鹽性相對較強。隨著鹽濃度的增加，菘藍種子的發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均逐漸降低，說明此時種子活力也逐漸降低，鹽脅迫對種子萌發(fā)的抑制作用加強。100 mmol·L-1NaCl處理下各產地的菘藍種子發(fā)芽指數(shù)與CK差異性均達到顯著水平(P<0.05)，說明100 mmol·L-1NaCl對菘藍種子而言已經(jīng)為較高的耐受鹽度。

圖1 鹽脅迫對不同產地菘藍種子萌發(fā)率的影響Fig.1 Effect of salt stress on seed germination of I. indigotica from different areas HB：河北保定Baoding, Hebei；SB：山東濱州Binzhou, Shandong；NB：內蒙古包頭Baotou, Inner Mongolia；LT：遼寧鐵嶺Tieling, Liaoning；AH：安徽亳州Bozhou, Anhui. 下同 The same below.

2.3 鹽脅迫對5個產地菘藍幼苗鮮重、下胚軸及胚根長度的影響

在150 mmol·L-1NaCl處理下，各產地菘藍幼苗均出現(xiàn)了嚴重萎蔫甚至死亡、腐爛現(xiàn)象，故在幼苗生長指標的測定中除去該處理。隨著鹽濃度的升高，HB和SB菘藍的幼苗鮮重、下胚軸及胚根長度呈先上升后下降的趨勢(圖2)。50 mmol·L-1NaCl下，HB幼苗鮮重、下胚軸及胚根長度與CK相比分別增加了27.06%、15.74%和4.34%，SB幼苗鮮重與下胚軸長度分別比CK分別增加了19.05%和9.97%，胚根長度與CK間無顯著差異(P>0.05)。100 mmol·L-1NaCl下，HB和SB的幼苗鮮重、下胚軸及胚根長度較CK均顯著降低(P<0.05)。其余3個產地(NB、LT、AH)菘藍的幼苗鮮重、下胚軸及胚根長度則隨著鹽濃度的升高逐漸降低，各鹽濃度處理間的差異顯著(P<0.05)。說明，低濃度鹽脅迫(50 mmol·L-1NaCl)促進了HB和SB菘藍胚根的伸長及幼苗的生長，100 mmol·L-1NaCl明顯抑制菘藍幼苗的生長，更高濃度的鹽脅迫則會造成幼苗的萎蔫甚至死亡。HB和SB菘藍幼苗具有一定耐鹽性，而其余3個產地菘藍幼苗的耐鹽性較差。

2.4 鹽脅迫對5個產地菘藍幼苗丙二醛含量的影響

鹽脅迫下，植物膜質過氧化作用的加劇使得體內丙二醛積累。鹽脅迫下，菘藍幼苗的MDA含量隨鹽濃度的升高而增加(圖3)。50 mmol·L-1NaCl下，HB、SB、NB菘藍幼苗的MDA含量與對照間無顯著差異(P>0.05)，在100 mmol·L-1NaCl處理下，HB、SB、NB、LT、AH 5個產地的幼苗MDA含量顯著增加，分別為CK的1.51、1.87、2.16、2.70、1.98倍，說明100 mmol·L-1NaCl濃度處理對菘藍幼苗明顯構成了傷害，且這種傷害在LT菘藍中最顯著，而HB菘藍幼苗對NaCl相對不敏感，造成的傷害較小，體現(xiàn)出較高的耐鹽性。

表1 鹽脅迫對不同產地菘藍種子萌發(fā)的影響Table 1 Effects of salt stress on seed germination of I. indigotica from different areas (n=4)

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note：Different small letters in the same column show significant difference at 0.05 level. The same below.

圖2 鹽脅迫對5個產地菘藍幼苗鮮重(A)、下胚軸(B)及胚根長度(C)的影響Fig.2 Effect of salt stress on the fresh weight (A), hypocotyl (B) and radicle length (C) of I. indigotica seedlings from five areas 不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。Different small letters show significant difference at 0.05 level. The same below.

2.5 鹽脅迫對菘藍幼苗生長的影響

圖3 鹽脅迫對5個產地菘藍幼苗丙二醛含量的影響Fig.3 Effects of salt stress on MDA content of I. indigotica seedling from five areas

從表2可知，5個產地菘藍幼苗葉片及根的鮮重和干重隨著鹽脅迫濃度的升高，總體上均呈下降的趨勢。150 mmol·L-1NaCl脅迫后，5個產地菘藍幼苗葉片及根的鮮重及干重均降至最低值，其中LT及AH的下降幅度顯著高于其他3個產地。與各自對照相比，LT菘藍幼苗葉片的鮮重、干重在150 mmol·L-1NaCl脅迫后分別下降了34.68%和38.10%，根的鮮重及干重分別下降了52.87%和46.15%；AH菘藍葉片的鮮重和干重分別下降了48.62%和45.24%，根的鮮重及干重分別下降了58.16%和56.25%。說明鹽脅迫對LT及AH菘藍幼苗的生長抑制作用大于其他產地。

表 2 鹽脅迫對菘藍葉片和根鮮重及干重的影響Table 2 Effects of salt stress on fresh and dry weights of leaf blade and root of I. indigotica seedlings

2.6 鹽脅迫對菘藍幼苗保護酶活性的影響

鹽脅迫下，5個產地菘藍幼苗SOD與POD活性均隨鹽濃度的升高呈先上升后下降趨勢(圖 4)。其中，不同鹽濃度下，HB、 SB和NB菘藍幼苗的SOD活性無顯著變化(P>0.05)。 LT和AH菘藍幼苗的SOD活性均在100 mmol·L-1NaCl脅迫下達到最大值，分別為各自對照的1.19和2.61倍。當鹽脅迫濃度升至150 mmol·L-1NaCl，LT和AH的SOD活性均開始下降。除AH外，其余產地菘藍幼苗的POD活性均在100 mmol·L-1NaCl處理時達到最大值。

圖4 鹽脅迫對菘藍保護酶活性的影響Fig.4 Effects of salt stress on protective enzyme activities of I. indigotica seedlings

圖 5 鹽脅迫對菘藍脯氨酸含量的影響Fig.5 Effects of salt stress on proline content of I. indigotica seedlings

2.7 鹽脅迫對幼苗脯氨酸含量的影響

隨著鹽脅迫程度的逐漸增加，5個產地菘藍體內脯氨酸的含量均呈先升高后下降趨勢，并均在100 mmol·L-1NaCl處理時達到最大值(圖 5)。NB、LT和AH菘藍幼苗的脯氨酸含量在100 mmol·L-1NaCl脅迫分別為各自對照的1.77、2.03和1.65倍。

表3 5個產地菘藍種子及幼苗耐鹽能力評價Table 3 Comprehensive appraisal of salt resistance of I. indigotica seed and seedling from five areas

2.8 5個產地菘藍種子萌發(fā)期的耐鹽性評價

通過隸屬函數(shù)法，綜合發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、相對鹽害率、苗鮮重、下胚軸長、胚根長度、MDA含量、單株苗鮮重、單株苗干重、SOD活性、POD活性和脯氨酸含量13個指標對5個不同產地菘藍種子萌發(fā)期的耐鹽性進行評價(表 3)。5個材料種子萌發(fā)期的耐鹽順序由強到弱依次為：HB>SB>LT>NB>AH。HB的菘藍種子顯示出較強的耐鹽能力，明顯優(yōu)于其他產地的菘藍種子，這與上述的分析結果一致。

3 討論

在對菘藍種子耐鹽性的研究中發(fā)現(xiàn)，隨著鹽濃度的不斷增加，不同產地菘藍的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)均逐漸降低，相對鹽害率逐漸升高，低濃度鹽脅迫對菘藍種子發(fā)芽的影響較小，高濃度表現(xiàn)出強烈的抑制效應，這與孟紅梅等[22]的研究一致。同一鹽濃度對不同產地菘藍種子萌發(fā)的抑制程度不同，說明不同產地菘藍種子耐鹽能力具有差異，這可能與不同產地菘藍居群自身的遺傳差異性有關。本研究中，SB、HB產地菘藍的發(fā)芽率、發(fā)芽勢均顯著高于其他產地的菘藍種子，表現(xiàn)出了較強的耐鹽性。不同產地菘藍在100 mmol·L-1NaCl濃度處理時，發(fā)芽率、發(fā)芽勢、活力指數(shù)均顯著降低，150 mmol·L-1NaCl下則大量萎蔫腐爛，甚至死亡，這表明，對菘藍而言,100 mmol·L-1NaCl為菘藍種子的極限耐受鹽濃度，該鹽脅迫濃度下種子吸水困難，胚乳難以動用所儲藏物質，呼吸作用受阻，從而種子整體的活力受到明顯限制，發(fā)芽的能力顯著降低，甚至不能正常萌發(fā)[23]。

植物在遭遇鹽脅迫時生長受到抑制，葉面積減小，同時減緩了莖的伸長生長[24]。隨著鹽脅迫程度的增加，5個產地菘藍幼苗的下胚軸長、胚根長及鮮重均呈整體下降趨勢，而在150 mmol·L-1NaCl處理時由于鹽濃度過高導致菘藍幼苗出現(xiàn)嚴重失水萎蔫甚至死亡、腐爛的現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)10～20 mmol·L-1NaCl處理能促進菘藍幼苗生長，40～100 mmol·L-1NaCl處理時幼苗生長顯著受抑制[25]。對種子耐鹽性的研究結果表明，HB、SB產地菘藍幼苗在低鹽濃度(50 mmol·L-1NaCl)處理時下胚軸長和鮮重比對照組有所增加，說明低濃度的鹽脅迫促進了這2個產地菘藍幼苗生長發(fā)育，而其余3個不同產地菘藍幼苗的下胚軸長、胚根長及鮮重則隨鹽脅迫濃度的增加呈逐漸降低趨勢。

高鹽脅迫會導致植物體內的保護酶系統(tǒng)急劇下降，活性氧大量積累，致使細胞的膜質過氧化作用加劇，丙二醛大量積累[26]。作為膜脂過氧化作用的產物，丙二醛(MDA)含量在一定程度上可以反映植物受傷害的程度。本研究結果表明：菘藍幼苗體內MDA含量隨鹽脅迫濃度的升高而增加。在高鹽濃度(100 mmol·L-1NaCl)處理時，5個產地菘藍幼苗體內MDA含量顯著上升，與對照間差異達到極顯著水平(P<0.01)。表明高鹽濃度的脅迫已經(jīng)超出了菘藍幼苗自身的調節(jié)能力，導致膜的損傷加重，丙二醛含量大量積累。不同產地菘藍在抵御鹽害時具有差異，鹽脅迫下HB的菘藍體內丙二醛(MDA)積累較少，受鹽脅迫傷害程度較??；而NB、LT、AH菘藍幼苗對鹽的耐受能力較差，在100 mmol·L-1NaCl脅迫下菘藍體內的膜質過氧化程度急劇增加，MDA含量顯著上升。

在對菘藍幼苗耐鹽性研究中發(fā)現(xiàn)，5個產地菘藍葉鮮重及干重，根鮮重及干重總體上均呈明顯下降趨勢，且生物量均在150 mmol·L-1NaCl脅迫時降至最低，這說明高濃度的鹽脅迫會顯著抑制菘藍幼苗的生長。

50 mmol·L-1NaCl輕度鹽脅迫能夠促進菘藍幼苗SOD和POD活性的增加，這說明輕度的鹽脅迫能夠誘導菘藍體內保護酶活性的增強，從而提高鹽漬環(huán)境下菘藍幼苗的適應能力。而過高濃度的鹽脅迫(150 mmol·L-1NaCl)，超出了菘藍幼苗自我調節(jié)能力極限，導致體內活性氧的大量積累與保護酶結構的損壞，致使清除活性氧的能力下降，保護酶活性顯著降低[27]。

鹽脅迫下，脯氨酸作為植物體內重要的滲透調節(jié)物質，能夠維持膜結構穩(wěn)定，清除植物體內的活性氧，其含量與植物的抗逆能力緊密相關[28]。5個產地菘藍幼苗的脯氨酸含量均隨著鹽濃度的升高呈先升高后降低的趨勢，并在100 mmol·L-1NaCl脅迫時達到峰值。這說明，鹽脅迫下菘藍通過體內大量積累脯氨酸來抵抗鹽漬環(huán)境，從而維持其生長及生理代謝過程的正常進行。高于100 mmol·L-1NaCl的脅迫則超出了菘藍幼苗的滲透調節(jié)能力，導致體內脯氨酸合成受阻，含量顯著降低。

綜合5個不同產地菘藍幼苗發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、相對鹽害率、苗鮮重、下胚軸長、胚根長、MDA含量、單株苗鮮重、單株苗干重、SOD活性、POD活性和脯氨酸含量13個指標的耐鹽性分析結果，各產地菘藍種子萌發(fā)期的耐鹽性強弱依次為：HB>SB>LT>NB>AH，HB產地菘藍種子較其他產地顯示出更強的耐鹽性。