東達山高寒草甸8種植物氣孔特征沿土壤水分梯度的變化

張大才，朱玉懷，李雙智

(西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南 昆明 650224)

植物氣孔特征對外界環(huán)境因子變化的可塑性強，隨環(huán)境因子的變化而變化，以適應(yīng)環(huán)境[1-3]，甚至同一植株不同冠層間葉片氣孔密度都存在顯著差異[4]，氣孔特征與葉片功能性狀之間也存在一定的聯(lián)系[5]。但是，不同氣孔特征(如氣孔密度、長度與寬度)對外界因子變化的響應(yīng)不同，如氣孔密度與大小在外界脅迫下呈相反的變化趨勢[6-7]。同時，不同環(huán)境因子對氣孔特征的影響也不同，如高光處理下氣孔密度和大小增大[8-9]，干旱脅迫下植物葉片氣孔密度增大[10-11]，或者減小[12-13]。干旱是自然界中植物受到的最常見的外界脅迫因子，在干旱脅迫下植物氣孔特征呈多種變化格局，其機制還需進一步研究。目前，更多的研究集中于在實驗條件下干旱脅迫植物，分析其氣孔特征的變化，而很少在自然狀態(tài)下，沿生境干旱化梯度取樣，分析氣孔特征沿土壤水分梯度的變化。

根據(jù)植物對水分的依賴程度可分為沼生、濕生、旱生等類型，每種類型的植物都要求有一個相對適宜的土壤水分范圍。相同土壤水分條件下，不同類型植物受到的影響或脅迫可能不同，如濕潤生境中，對濕生植物而言為適宜的土壤含水率，而對旱生植物而言就存在水分脅迫。因此，按植物對水分的依賴類型分別分析氣孔特征與土壤含水率之間的關(guān)系，才能更客觀反映植物葉片氣孔特征隨土壤水分梯度的變化規(guī)律。

高寒草甸是青藏高原分布面積最大的植被類型之一，受全球變化和放牧干擾的雙重影響，高寒草甸分布面積正在快速減小[14]。而且，青藏高原冬季溫度升高，積雪量下降，生境干旱化現(xiàn)象嚴重[15]。在生境干旱化過程中，高寒草甸退化演替，嵩草屬(Kobresia)植物在群落中的重要值逐步下降，而“雜草”類植物的重要值增加[16]。這表明不同植物對土壤水分的依賴程度不同，生態(tài)適應(yīng)機制不同，葉表皮氣孔特征與土壤含水率之間的關(guān)系不同。本研究選擇藏東南高寒草甸的8種優(yōu)勢或常見植物，沿生境干旱化梯度采樣，分析氣孔特征沿土壤水分梯度的變化規(guī)律。因此，本研究目的有：1)分析植物葉片氣孔密度沿土壤水分梯度的變化規(guī)律。2)氣孔大小與土壤含水率之間的關(guān)系。3)根據(jù)植物氣孔特征與土壤水分梯度之間的關(guān)系劃分植物對水分的依賴類型。

1 材料與方法

1.1 研究地概況與植物葉片的采集

研究地點位于藏東南左貢縣東達山，該山山體高大，埡口海拔5008 m，地理位置、地形地貌等信息在已發(fā)表文獻中均有詳細介紹[17-18]。研究地點地形呈凹形，溝谷地形平坦，溪流縱貫其間，生境濕潤；兩側(cè)斜升，生境干旱。采用典型取樣方法，從分布于溝谷溪邊的高寒草甸開始設(shè)置樣方，然后沿坡面每間隔一定的距離設(shè)置樣方，直至高寒草甸邊緣，共設(shè)置10個樣方(表1)。選擇植物群落內(nèi)優(yōu)勢度高、分布范圍廣的物種作為研究對象，包括4種嵩草屬植物，即矮生嵩草(Kobresiahumilis)、線葉嵩草(K.capillifolia)、大花嵩草(K.macrantha)、高山嵩草(K.pygmaea)，以及4種雙子葉植物，即小大黃(Rheumpumilum)、圓穗蓼(Polygonummacrophyllum)、珠芽蓼(Polygonumviviparum)和鴨跖草(Commelinacommunis)，采集健康植株葉片，置于FAA固定液(50%酒精∶乙酸∶福爾馬林溶液=90∶5∶5)中保存[19]，并采集憑證標本。所有實驗材料采集于2016年8月。

1.2 土壤含水率的測度

在樣方內(nèi)選取3個點取土樣，土鉆內(nèi)徑為2.5 cm。取出土樣后去除石礫、根與莖，然后裝入鋁盒，用精度為0.01 g電子秤稱重。在實驗室內(nèi)將裝土樣的鋁盒放入烘箱在(105±2) ℃條件下烘烤12 h。烘烤結(jié)束后取出鋁盒，冷卻至室溫后(約需30 min)立即稱重。以質(zhì)量含水量測定土壤含水率，即土壤中水分的質(zhì)量與干土質(zhì)量的百分比，又稱為重量含水量。

表1 樣地信息Table 1 Information of sample plots

1.3 葉表皮的制片

葉表皮臨時制片過程為：1)軟化：植物葉片在FAA固定液中容易變脆、變硬而直接影響葉表皮的獲取，在實驗開始前把植物葉片置于軟化劑(50%酒精∶甘油=1∶1)中軟化2～3 d。2)離析：將軟化后的植物葉片用蒸餾水沖洗干凈后放于10%的次氯酸鈉(NaClO)溶液中進行離析，離析時間大約為30～40 min。3)取樣和剝離：植物葉片氣孔密度、大小受葉片的著生部位[20-21]、發(fā)育程度[22-24]，以及同一葉片的不同部位的影響[25]。本研究葉表皮材料從葉片長度2/3處(從葉基至葉尖方向)獲取，截取小段葉片進行離析，待葉片顏色變白時取出，經(jīng)蒸餾水沖洗后剝離表皮。4)染色：采用滴染法，用番紅-固綠進行染色，染色時間為1 min。5)制片：染色后樣品用蒸餾水反復(fù)沖洗干凈后蓋上蓋玻片，制成臨時裝片。

1.4 顯微觀察與測量

將制成的臨時裝片在顯微鏡下進行鏡檢，使用顯微圖像分析系統(tǒng)(ZEISS Axiovert 200M)計數(shù)氣孔數(shù)，測量氣孔長度與保衛(wèi)細胞寬度，并拍照。1)氣孔密度的計算：每個樣方中，每個物種選取50張臨時制片，計數(shù)視野中氣孔的數(shù)量，每張計數(shù)10個視野的氣孔數(shù)量，并求算平均值(N)。用鏡臺測微尺測得顯微鏡視野的直徑，計算半徑r(mm)、視野面積S=πr2(mm2)，氣孔密度D=N/S(個·mm-2)。2)氣孔長度與保衛(wèi)細胞寬度測量：每個樣方中，每個物種選取10張臨時制片，每張制片隨機選取1個視野，每個視野隨機選取5個氣孔，測量氣孔長度(μm)和保衛(wèi)細胞寬度(μm)，并以此衡量氣孔大小，其值越大表明氣孔越大。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件分析氣孔密度、長度和保衛(wèi)細胞寬度與土壤含水率之間的回歸關(guān)系，遵循階數(shù)越低越好的原則。使用Canoco 4.5軟件分析氣孔特征沿水分梯度的變化，由于4種雙子葉植物和4種嵩草屬植物最長梯度值分別為0.133和0.231，因此選擇RDA排序分析氣孔特征與土壤水分梯度之間的關(guān)系。4種雙子葉植物葉片上、下表皮均有氣孔分布，以上、下表皮氣孔密度之和分析氣孔密度，但分別分析上、下表皮氣孔長度和保衛(wèi)細胞寬度與土壤含水率之間的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

同種植物氣孔形狀特征在不同水分梯度之間的變化較小，但密度與大小差異較大(圖1)。矮生嵩草氣孔的平均密度最大，其次為圓穗蓼與大花嵩草，而珠芽蓼上表皮氣孔的平均密度最?。桓呱结圆輾饪组L度最大，其次為線葉嵩草和鴨跖草下表皮，圓穗蓼下表皮的氣孔長度最?。桓呱结圆荼Ｐl(wèi)細胞寬度最大，其次是大花嵩草和線葉嵩草，而圓穗蓼下表皮保衛(wèi)細胞寬度最??；相對于4種雙子葉植物，4種嵩草屬植物氣孔長度與保衛(wèi)細胞寬度較大(表2)。

表2 氣孔密度、長度和保衛(wèi)細胞寬度平均值及與土壤含水率之間的復(fù)相關(guān)關(guān)系Table 2 The mean values of stomatal density and length, and guard cell width for 8 species, and the multi-correlation between stomatal characteristics and soil moisture

*P<0.05, **P<0.01.分別指：1)方差分析表明4種雙子葉植物氣孔特征在上、下表皮間差異顯著；2)復(fù)相關(guān)關(guān)系中，氣孔特征與土壤含水率之間的相關(guān)性顯著。Indicating seperately: 1) ANOVA showing the difference of stomatal features between adaxial and abxial epidermises is significant for 4 species of dicotyledon, and 2) the relationship between stomatal features and soil moisture is significant in the complex correlation.

2.1 氣孔密度沿土壤水分梯度的變化

氣孔密度與土壤含水率之間的關(guān)系呈現(xiàn)出4種不同的變化趨勢(圖2)。線葉嵩草、圓穗蓼氣孔密度與土壤含水率顯著線性正相關(guān)(P<0.01；圖2a, b)；珠芽蓼、矮生嵩草氣孔密度與土壤含水率顯著線性負相關(guān)(P<0.01；圖2c, d)；大花嵩草、高山嵩草氣孔密度與土壤含水率之間的相關(guān)性不顯著(P>0.05；圖2e, f)；小大黃、鴨跖草氣孔密度隨土壤含水率的變化呈現(xiàn)單峰曲線分布格局(P<0.01；圖2g, h)。

圖1 植物葉片氣孔分布特征Fig.1 The stomatal distribution of leaf for four plants of genus Kobresia and abaxial epidermis of dicotyledon 最濕潤與最干旱生境分別指該物種分布的土壤水分梯度范圍內(nèi)土壤含水率最高和最低的生境。The wettest and driest habitat of one species is respectively the one with the highest and lowest soil moisture within its gradients of soil moisture.

2.2 氣孔長度沿土壤水分梯度的變化

線葉嵩草、大花嵩草氣孔長度與土壤含水率顯著線性正相關(guān)(P<0.01；圖3a, b)；圓穗蓼氣孔長度與土壤含水率顯著線性負相關(guān)(P<0.01；圖3c, d)；高山嵩草、珠芽蓼上表皮氣孔長度與土壤含水率之間的相關(guān)性不顯著(P>0.05；圖3e, f)；珠芽蓼下表皮氣孔長度與土壤含水率相關(guān)性低(圖3g)；矮生嵩草、小大黃、鴨跖草氣孔長度隨土壤含水率的增加而呈現(xiàn)單峰曲線格局(P<0.01；圖3h～l)。4種雙子葉植物中，上、下表皮氣孔長度沿土壤水分梯度的變化格局一致(圖3c～d, f～g, i～l)。鴨跖草葉片下表皮氣孔長度顯著大于上表皮(P<0.01)，而珠芽蓼和圓穗蓼葉片下表皮氣孔長度顯著小于上表皮(P<0.01)，小大黃葉片上、下表皮氣孔長度的差異不顯著(P>0.05；表2)。

2.3 保衛(wèi)細胞寬度沿土壤水分梯度的變化

保衛(wèi)細胞寬度沿土壤水分梯度的變化呈現(xiàn)出4種分布格局(圖4)。線葉嵩草保衛(wèi)細胞寬度與土壤含水率顯著線性正相關(guān)，但相關(guān)性較低(P<0.01；圖4a)；圓穗蓼保衛(wèi)細胞寬度與土壤含水率顯著線性負相關(guān)(P<0.01；圖4b, c)；大花嵩草、高山嵩草、珠芽蓼保衛(wèi)細胞寬度與土壤含水率之間的相關(guān)性不顯著(P>0.05；圖4d～g)；矮生嵩草、小大黃、鴨跖草保衛(wèi)細胞寬度隨土壤含水率的增加而呈現(xiàn)單峰曲線分布格局(P<0.01；圖4h～l)。4種雙子葉植物中，上、下表皮保衛(wèi)細胞寬度沿土壤水分梯度的變化一致(圖4b～c, f～g, i～l)，除鴨跖草下表皮保衛(wèi)細胞寬度顯著大于上表皮外，其余3種均為下表皮保衛(wèi)細胞寬度顯著小于上表皮(P<0.01；表2)。

2.4 氣孔特征與土壤含水率之間的復(fù)相關(guān)關(guān)系和RDA排序

除高山嵩草外，其余7種植物葉片氣孔特征與土壤含水率之間的復(fù)相關(guān)系數(shù)高，雙子葉植物下表皮氣孔特征與土壤含水率之間的相關(guān)性高于上表皮(表2)。在氣孔特征與土壤含水率之間的復(fù)相關(guān)關(guān)系中，氣孔密度對線葉嵩草、圓穗蓼、珠芽蓼、小大黃、鴨跖草5種植物的影響最大，氣孔長度對大花嵩草和矮生嵩草2種植物的影響最大，而保衛(wèi)細胞寬度和高山嵩草氣孔特征與土壤含水率之間的相關(guān)性較低(表2)。

根據(jù)氣孔特征沿土壤水分梯度的RDA排序結(jié)果，大花嵩草、鴨跖草、小大黃、線葉嵩草和矮生嵩草氣孔特征與土壤含水率之間的關(guān)系緊密；高山嵩草、珠芽蓼、圓穗蓼的氣孔密度、長度和保衛(wèi)細胞寬度和土壤含水率之間的關(guān)系不同，且不緊密(圖5)。根據(jù)物種氣孔特征與土壤含水率之間關(guān)系，4種嵩草屬植物對土壤水分依賴程度由高到低的順序為：大花嵩草>矮生嵩草>線葉嵩草>高山嵩草；4種雙子葉植物的順序為：鴨跖草>小大黃>珠芽蓼>圓穗蓼。

圖2 氣孔密度沿土壤水分梯度的變化Fig.2 Variation of stomatal density along the gradient of soil moisture

a：線葉嵩草K.capillifolia；b：圓穗蓼P.macrophyllum；c：珠芽蓼P.viviparum；d：矮生嵩草K.humilis；e：大花嵩草K.macrantha；f：高山嵩草K.pygmaea；g：小大黃R.pumilum；h：鴨跖草C.communis.

a:線葉嵩草K.capillifolia；b:大花嵩草K.macrantha；c～d:圓穗蓼上、下表皮The adaxial and abaxial epidermis ofP.macrophyllum；e:高山嵩草K.pygmaea；f～g:珠芽蓼上、下表皮The adaxial and abaxial epidermis ofP.viviparum；h:矮生嵩草K.humilis；i～j:小大黃上、下表皮The adaxial and abaxial epidermis ofR.pumilum；k～l:鴨跖草上、下表皮The adaxial and abaxial epidermis ofC.communis.

a:線葉嵩草K.capillifolia；b～c:圓穗蓼上、下表皮The adaxial and abaxial epidermis ofP.macrophyllum；d:大花嵩草K.macrantha；e:高山嵩草K.pygmaea；f～g:珠芽蓼上、下表皮The adaxial and abaxial epidermis ofP.viviparum；h:矮生嵩草K.humilis；i～j:小大黃上、下表皮The adaxial and abaxial epidermis ofR.pumilum；k～l:鴨跖草上、下表皮The adaxial and abaxial epidermis ofC.communis.

圖5 氣孔特征的RDA排序Fig. 5 The RDA ordination of stomatal characteristics

D：氣孔密度Stomatal density；L：氣孔長度Stomatal length；W：保衛(wèi)細胞寬度Guard cell width。a： 4種嵩草屬植物4 species ofKobresiagenus，1：大花嵩草K.macrantha；2：線葉嵩草K.capillifolia；3：矮生嵩草K.humilis；4：高山嵩草K.pygmaea；b： 4種雙子葉植物4 species of dicotyledon，1：鴨跖草C.communis；2：小大黃R.pumilum；3：珠芽蓼P.viviparum；4：圓穗蓼P.macrophyllum；ad: 上表皮Adaxial epidermis；ab: 下表皮Abaxial epidermis.

3 討論

3.1 氣孔密度沿土壤水分梯度的變化

8種植物氣孔密度與土壤含水率之間呈現(xiàn)為4種關(guān)系(圖2)，充分表明不同植物葉片氣孔密度對土壤水分條件變化的適應(yīng)性不同，氣孔密度對土壤水分條件的響應(yīng)復(fù)雜。隨著生境干旱程度的增加，植物葉片氣孔密度降低，以降低蒸騰，是植物適應(yīng)干旱生境的特征[13,26]，本研究中線葉嵩草、圓穗蓼氣孔密度與土壤含水率之間的關(guān)系符合這一規(guī)律(圖2a, b)。但是，更多研究結(jié)果都表明在干旱脅迫下植物葉片的氣孔密度增加，如本研究中珠芽蓼、矮生嵩草氣孔密度與土壤含水率之間的關(guān)系(圖2c, d)，認為耐旱性強的植物氣孔密度大[27-30]，氣孔密度的增加有利于提高水分利用效率[7,31]。小大黃和鴨跖草氣孔密度與土壤含水率之間呈現(xiàn)非線性關(guān)系(圖2g, h)，與胡楊(Populuseuphratic)[32-33]、棗樹(Ziziphusjujuba)[34]葉片氣孔密度隨土壤含水率的變化一致，是干旱脅迫下氣孔密度最常見的變化趨勢[35]。說明同種植物氣孔密度對水分脅迫不同強度的響應(yīng)不同，輕度、中度干旱脅迫抑制葉片表皮細胞伸長，葉片面積減小而導(dǎo)致氣孔密度升高[36]；而重度干旱脅迫抑制了氣孔的發(fā)生，使氣孔密度降低[37]。

本研究中8種植物氣孔密度與土壤含水率之間的關(guān)系，還可以說明：1)同屬植物之間氣孔密度存在差異，其耐旱性也不同。本研究中嵩草屬的4種植物，以及蓼屬的2種植物氣孔密度均存在差異。很多研究成果都推薦將植物氣孔密度作為評價植物抗旱性的重要指標[38-40]，因此研究結(jié)果可為高寒草甸恢復(fù)草種選擇提供依據(jù)。2)除氣孔密度外，氣孔分布也影響植物的耐旱性。一般認為雙子葉植物中氣孔主要分布于下表皮而上表皮氣孔分布少或沒有分布的特征是耐旱的解剖構(gòu)造[41-42]。本研究涉及的4種雙子葉植物中，鴨跖草在水分梯度上的分布范圍窄，而耐旱性最差，除氣孔密度低的原因外，氣孔分布特征對其耐旱性差也有較大的影響，氣孔在上、下表皮均有分布，且上表皮平均密度高于下表皮(表2)。

3.2 氣孔大小與土壤水分之間的關(guān)系

大花嵩草和線葉嵩草葉片氣孔大小隨土壤干旱程度的增加而減小(圖3a, b和圖4a)，與玉米(Zeamays)[6]、水稻[43]、矮嵩草、高山唐松草(Thalictrumaplinum)、垂穗披堿草(Elymusnutans)、麻花艽(Gentianastraminea)[11]、刺槐(Robiniapseudoacacia)[44]、大豆(Glycinemax)[36]等植物葉片在干旱脅迫下氣孔大小的變化一致。一般認為植物氣孔大小與其運動敏捷性相關(guān)，氣孔越小運動越敏捷，對外界水分變化反應(yīng)越及時，水分脅迫條件下植物葉片氣孔變小更有利于調(diào)節(jié)氣孔的關(guān)閉與開張[45]。

但是，圓穗蓼上、下表皮氣孔大小隨土壤干旱程度的增加而增加(圖3c～d和圖4b～c)。圓穗蓼的耐旱性最強(表2)，是典型的旱生型植物，土壤含水率越高對其脅迫越大，因此其氣孔特征的變化與所受外界脅迫一致。小大黃、鴨跖草、矮生嵩草、珠芽蓼氣孔長度與保衛(wèi)細胞寬度隨土壤含水率的增加基本呈現(xiàn)先增加后減小的單峰曲線格局(圖3f～l和圖4h～l)，與紫花苜蓿(Medicagosativa)在干熱脅迫下氣孔大小的變化一致[46]。這些物種分布的生境濕潤，土壤含水率過高或過低對其生長都將造成脅迫，因此其氣孔大小與土壤含水率之間的關(guān)系呈現(xiàn)單峰曲線格局。植物葉片氣孔大小沿土壤水分梯度的變化格局應(yīng)該從植物受土壤水分脅迫的角度去理解，當植物受到土壤水分脅迫時氣孔都變小，運動更敏捷，對環(huán)境變化響應(yīng)更及時。

3.3 不同生境類型植物的劃分

根據(jù)氣孔密度、保衛(wèi)細胞長度和寬度與土壤含水率之間的關(guān)系，隨著土壤干旱化程度的增加，不同植物氣孔特征的變化不同，根據(jù)植物對土壤水分的依賴程度，可以劃分為4種類型。1)沼生型，僅大花嵩草一種，隨土壤干旱程度的增加氣孔密度呈增加趨勢、氣孔大小顯著減小。該類植物對土壤水分依賴程度高，在水分梯度上的分布范圍窄，干旱是其生長的脅迫因素，以增加氣孔密度和減小氣孔大小適應(yīng)干旱脅迫。2)濕生型，包括鴨跖草、小大黃、珠芽蓼和矮生嵩草，氣孔特征與土壤含水率之間的關(guān)系多呈現(xiàn)為單峰曲線格局，濕潤土壤是最適宜的分布生境，土壤含水率過高或過低都是其生長的脅迫因子。鴨跖草和小大黃是典型的濕生型植物，氣孔特征與沿土壤水分梯度的變化均呈現(xiàn)為單峰曲線格局；矮生嵩草氣孔特征與土壤含水率的復(fù)相關(guān)關(guān)系中，氣孔大小和保衛(wèi)細胞寬度的復(fù)相關(guān)系數(shù)高，對土壤水分條件變化響應(yīng)明顯；珠芽蓼是非典型的濕生型植物，氣孔密度與土壤含水率之間的關(guān)系表現(xiàn)為沼生型植物的特征，而氣孔大小表現(xiàn)出濕生型植物的特征，是沼生型向濕生型的過渡類型。3)旱生型，包括圓穗蓼和線葉嵩草，它們的適宜生境偏干旱，土壤含水率過高是其生長的脅迫因子，氣孔特征隨土壤干旱程度增加的變化趨勢與沼生型植物相反，隨土壤干旱程度的增加氣孔密度減小，氣孔大小增大(其中線葉嵩草氣孔大小減小，但氣孔密度起主要作用，所以歸為該類)。4)廣布型，僅高山嵩草一種，氣孔特征與土壤含水率之間的相關(guān)性不顯著，氣孔特征對土壤含水率的變化不敏感。

4 結(jié)論

在植物氣孔特征對土壤含水率變化的響應(yīng)中，多數(shù)情況下氣孔密度起主要作用，其數(shù)量和在上、下表皮的分布都影響植物對水分的依賴程度，其次是氣孔大小，影響植物氣孔開張與關(guān)閉的靈敏度。沼生、濕生和旱生型植物在相同的土壤水分梯度上受到的水分脅迫程度不同，氣孔特征與土壤水分梯度之間呈現(xiàn)多種變化格局。因此，分析植物氣孔特征沿土壤水分梯度的變化時應(yīng)結(jié)合植物受水分脅迫的程度。在水分脅迫條件下植物葉片氣孔密度增大，大小減小是其普遍變化規(guī)律，或起主要作用的氣孔特征符合這一變化規(guī)律。