60Co-γ射線輻射對苜蓿幼苗生長和兩種抗氧化酶活性的影響

李 紅， 李 波， 楊 曌， 徐婉玉

(1.黑龍江省畜牧研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161005； 2.齊齊哈爾大學生命科學與農(nóng)林學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

誘變育種是人為地利用物理、化學因素誘發(fā)作物產(chǎn)生遺傳性變異，依據(jù)育種目標，經(jīng)過人工選擇、鑒定、選育新品種，獲得有價值新類型的一種育種方法，現(xiàn)已成為常規(guī)育種與現(xiàn)代技術有機結合的現(xiàn)代育種技術。在牧草育種上常用的電離輻射和非電離輻射，由于各種射線電離密度和生物效應不同，所引起的突變率有所差異，其中最常用的為γ射線和X射線[1]。60Co-γ射線輻照是最為有效的人工誘變育種方法之一，已經(jīng)在農(nóng)作物育種中得到廣泛應用。在牧草方面，輻射誘變育種工作起步較晚，研究尚少。

紫花苜蓿(Medicagosativa)是世界上栽培利用最廣泛的優(yōu)良豆科牧草, 具有營養(yǎng)價值高、適口性好等特點, 在世界各地的畜牧業(yè)中發(fā)揮著非常重要的作用。同時，紫花苜蓿對改善鹽堿化土壤理化性質,恢復退化草地植被,牧草質量和產(chǎn)量的提高等,均有著重要作用[2]。但目前利用60Co-γ射線輻照人工誘變育種紫花苜蓿的研究相對較少。本研究探討不同60Co-γ射線輻照劑量對紫花苜蓿種子的幼苗生長狀況、葉片和根抗氧化酶活性代謝的影響，為紫花苜蓿的人工誘變育種提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及輻射處理

以黑龍江畜牧研究所提供龍牧806苜蓿干種子為材料。60Co-γ輻射源由中國農(nóng)業(yè)科學研究院原子能利用研究所提供，輻射劑量依次為600 Gy，900 Gy，1 200 Gy，1 500 Gy，1 800 Gy六個劑量，劑量率15 Gy·min-1，每份處理50 g種子，以同一批次相同數(shù)量未經(jīng)處理的種子作為對照(CK)。

1.2 方法

1.2.1幼苗的培養(yǎng) 取5種劑量的60Co-γ(600，900，1 200，1 500和1 800 Gy)射線輻射處理和未輻射的苜蓿種子，采用土培的方法將其種植在營養(yǎng)缽中(針葉土、營養(yǎng)土和珍珠巖按1∶2∶0.5比例進行混合)，定期澆水，待幼苗長至三葉一心期后，將苜蓿幼苗取出備用。

1.2.2形態(tài)指標測定 出苗率和成苗率：每個處理播種5個花盆，每盆播種15粒種子(輻射和未輻射種子)待15 d后統(tǒng)計每盆中種子的出苗數(shù)，待實生苗長出5～6 片真葉(約30 d左右)后，統(tǒng)計幼苗數(shù)，計算種子幼苗的成苗率。

出苗率=(出苗數(shù)/播種種子總數(shù))×100%

成苗率=(成苗數(shù)/播種種子總數(shù))×100%

幼苗鮮重、干重和含水量：對培養(yǎng)至45 d幼苗，小心取出幼苗，用水沖洗凈根部的泥土，濾紙吸干其水分，每個輻射劑量和對照隨機選取10株幼苗，用電子天平稱取幼苗的鮮重即為幼苗的鮮重，自然風干后測定其干重即為幼苗的干重，并計算其含水量。

幼苗長度：隨機選取培養(yǎng)45 d每個輻射劑量和對照10株具代表性的苜蓿幼苗，利用米尺分別測量地上莖長度、主根長度和幼苗總長度，計算其平均值。

1.2.3抗氧化酶活性測定 對不同60Co-γ射線輻射劑量苜蓿種子的幼苗葉片和根進行過氧化物酶(peroxidase，POD)和過氧化氫酶(catalase，CAT)活性的測定，過氧化物酶活性采用愈創(chuàng)木酚比色法，過氧化氫酶活性采用紫外吸收法，重復三次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel軟件進行作圖，用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理及相關分析。

2 結果與分析

2.1 不同劑量60Co-γ射線輻射對幼苗生長的影響

2.1.1種子出苗率和成苗率的影響60Co-γ輻射處理后苜蓿干種子的出苗率和成苗率的變化見圖1，經(jīng)過60Co-γ輻射處理后，苜蓿干種子的出苗率和成苗率呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢。輻射后種子的出苗率在低劑量(600 Gy)促進其出苗，出苗率最高為77.33%，比對照組增加6.42%，1 800 Gy高輻射劑量種子的出苗率最低，為48.67%。經(jīng)過輻射后600 Gy輻射劑量以上種子的出苗率均小于對照組。輻射劑量為900、1 200、1 500和1 800 Gy種子的出苗率分別比對照組降低了15.60%、21.01%、28.44%和33.03%。低劑量600 Gy對成苗率影響不大，900 Gy以上輻射劑量對出苗率影響極大，與對照比較差異達到了極顯著的水平(P<0.01)，而1 200～1 800 Gy輻射劑量間比較差異不顯著。

輻射后種子的成苗率在低劑量(600 Gy)促進其成苗率最高為77.33%，比對照組增加了6.42%，1 800 Gy高輻射劑量種子的幼苗不能成苗。經(jīng)過輻射后600 Gy輻射劑量以上種子的出苗率均小于對照組。輻射劑量在900、1 200、1 500和1 800 Gy種子的成苗率分別比對照組降低了12.13%、37.47%、51.89和100%，900 Gy輻射劑量以上與對照比較差異極顯著(P<0.01)，說明600 Gy低劑量輻射對苜蓿干種子的成苗率的影響不大，而高劑量輻射對苜蓿干種子的成苗率的影響比較大，甚至導致種子出苗后死亡。

圖1 60Co-γ輻射苜蓿種子的出苗率和成苗率的變化Fig.1 The changes of germination rate and survival rate of alfalfa seeds by 60Co-γ radiation.注：不同字母代表同一列不同劑量輻射間比較，小寫字母代表0.05水平，大寫字母代表0.01水平，下同Note: Different letters in the same column represent the comparison of different dose of radiation , lowercase letters indicate the difference at the level of 0.05, and capital letters indicate the difference at the level of 0.01. The same as below

2.1.2幼苗鮮重、干重和含水量的影響60Co-γ輻射處理后苜蓿種子的幼苗的鮮重、干重和含水量的影響見圖2，隨著輻射劑量的增加，各處理組的幼苗的鮮重、干重和含水量均呈現(xiàn)下降的變化趨勢。

輻射劑量越高幼苗的鮮重、干重和含水量越低，在5組輻射處理組中，輻射劑量為600 Gy的幼苗的鮮重量、干重和含水量最大，分別為14.92 g，3.74 g和13.00 g，1500 Gy輻射劑量的幼苗的鮮重、干重和含水量最小，分別為6.64 g，1.16 g和5.49 g。在600、900、1200和1500 Gy輻射劑量下，幼苗的鮮重分別比對照降低10.87%、33.71%、53.60%和60.32%，干重分別比對照降低19.07%、34.14%、65.21%和69.07%，含水量分別比對照降低8.51%、33.59%、50.18%和57.80%。輻射處理后苜蓿種子的幼苗的鮮重、干重和含水量與對照比較差異極顯著(P<0.01)，說明輻射處理對其幼苗的鮮重、干重和含水量影響極大(P<0.01)。

圖2 60Co-γ射線輻射苜蓿種子的幼苗鮮重、干重和含水量的變化Fig.2 The change of fresh weight, dry weight and moisture content of seedling of alfalfa by 60Co-γ radiation

2.1.3幼苗長度的影響 苜蓿種子經(jīng)60Co-γ輻射不同劑量處理后，其幼苗的總長度、地上莖長度和主根長度的影響見圖3，隨著輻射劑量的增加，各處理組的幼苗總長度、地上莖長度均呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢，主根長度出現(xiàn)降低的變化趨勢。幼苗的生長對輻射反應比較敏感，主要通過幼苗的地上莖長度和地下主根長度指標的變化反應出來，經(jīng)60Co-γ射線輻射處理后種子的生長幼苗，表現(xiàn)為低劑量輻射促進地上莖的生長，高輻射劑量抑制其地上莖和地下主根部分的生長，且隨著誘變劑量的增高，地下主根逐漸變得短粗。

幼苗的地下主根長度表現(xiàn)為隨著輻射劑量的增加抑制作用增加，1 500 Gy輻射劑量下主根長度僅為2.20 cm，在600、900、1 200和1 500 Gy輻射劑量下，幼苗的主根長度分別比對照降低21.93%、38.26%、60.19%和65.79%，1 200和1 500 Gy輻射劑量下對主根的長度抑制作用比較強，輻射與對照比較差異極顯著(P<0.01)，低劑量與高劑量比較差異顯著(P<0.05)。

幼苗的地上莖長度的影響表現(xiàn)為隨著輻射劑量的增加抑制作用增加，600和900 Gy低劑量輻射促進苜蓿幼苗地上莖的生長，分別比對照增加25.13%和15.41%，1 200和1 500 Gy中度劑量輻射劑量抑制苜蓿幼苗地上莖的生長，分別比對照降低19.14%和29.84%，說明1 200 Gy輻射劑量以上抑制苜蓿幼苗的地上莖生長，與對照和低輻射劑量比較差異極顯著(P<0.01)。

隨著輻射劑量增加幼苗總長度降低，輻射劑量為600 Gy的幼苗總長度最高為33.21 cm，比對照增加了25.13%，1 500 Gy輻射劑量的幼苗總長度最低為16.31 cm。在600和900低劑量輻射下，幼苗的總長度分別比對照增加了25.13%和15.41%，1 200和1 500 Gy中度劑量輻射處理幼苗總長度與對照比較差異極顯著(P<0.01)，低劑量輻射與高劑量之間對幼苗總長度產(chǎn)生極顯著差異(P<0.01)。輻射對苜蓿幼苗主根的影響最大，進而影響苜蓿幼苗的總長度。

圖3 60Co-γ射線輻射苜蓿種子的幼苗長度和主根長度的變化Fig.3 The changes of seedling length and root length of alfalfa seeds by 60Co-γ radiation

2.2 不同劑量60Co-γ射線輻射對苜蓿葉片兩種酶活性的影響

2.2.1過氧化物酶活性的影響 不同劑量60Co-γ 射線輻射下的苜蓿種子，其幼苗葉片和根POD活性的變化見圖4，苜蓿葉片和根的POD活性隨著輻射劑量的增加呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢，輻射處理增加苜蓿葉片和根POD的積累，輻射劑量900 Gy時苜蓿葉片和根POD活性達到最大值，分別為3 343.75 U·g-1Fw·min-1和3 060.42 U·g-1Fw·min-1。在600、900、1 200和1 500 Gy60Co-γ輻照劑量的葉片POD活性分別比對照組增加39.00%、53.08%、40.44%和37.58%，根POD活性分別比對照組增加7.78%、58.81%、52.76%、27.85%。苜蓿幼苗葉片和根POD活性方差分析顯示，除600 Gy外，其它輻射組與對照組比較差異極顯著(P<0.01)，60Co-γ輻射對苜蓿葉片和根部過氧化物酶的積累產(chǎn)生顯著的影響。

圖4 60Co-γ輻射苜蓿種子的幼苗的葉片和根過氧化物酶活性的變化Fig.4 Changes of peroxidase activity in leaves and roots of seedling of alfalfa under 60Co-γ radiation

2.2.2過氧化氫酶活性的影響 在不同劑量60Co-γ射線輻射下的苜蓿種子，其幼苗葉片和根的CAT活性的變化見圖4，苜蓿葉片和根的CAT活性隨著輻射劑量的增加呈先上升后下降的趨勢，輻射劑量900 Gy時苜蓿葉片和根CAT活性達到最大值，分別為382.22 U·g-1Fw·min-1和203.33 U·g-1Fw·min-1。在600、900、1 200和1 500 Gy60Co-γ 輻照劑量的葉片CAT活性分別比對照組增加19.13%、174.11%、67.74%和0.20%，根CAT活性分別比對照組增加13.58%、54.18%、20.22%和17.53%。苜蓿葉片CAT活性的方差分析顯示，900和1 200 Gy輻射組與對照組和其他輻射組比較差異達到極顯著水平(P<0.01)；苜蓿根CAT活性的方差分析顯示，900 Gy輻射組與對照組和其他輻射組比較差異達到極顯著水平(P<0.01)，一定的輻射劑量可以提高苜蓿葉片和根的CAT酶活性。

圖4 60Co-γ輻射苜蓿種子的幼苗的葉片和根過氧化氫酶活性的變化Fig.4 Changes of catalase activity in leaves and roots of seedling of alfalfa under 60Co-γ radiation

3 討論

60Co-γ射線可對植物的生長發(fā)育產(chǎn)生一定的抑制或促進作用，不同輻照劑量對不同植物的影響不同[3]。幼苗的生長發(fā)育上的變化是輻射誘變效應的重要參考指標，直接反映在M1代植株的存活率與生長對輻射的敏感性上。試驗通過測定不同劑量60Co-γ輻射下，苜蓿干種子幼苗的出苗率、成苗率、鮮重、干重、主根長、苗長等指標變化，綜合分析不同劑量的60Co-γ射線對植株生長發(fā)育的影響。苜蓿幼苗的出苗率、成苗率、幼苗的長度和地上莖長度均呈先上升后下降的趨勢，主根長度、鮮重和干重呈現(xiàn)下降的趨勢，且隨著誘變劑量的增高，根逐漸變得短粗。由于高劑量的苜蓿干種子出苗后真葉未能長出，植株未能正常生長而死亡，這可能是因為種子經(jīng)60Co-γ射線輻射后，能量在種子中沉積，導致種子受到不同程度的損傷，使胚中分生組織的分裂過程受到抑制，但對生長過程影響不大，所以種子能正常發(fā)芽，但在生長過程中會逐漸顯現(xiàn)，最后導致幼苗死亡。試驗中高輻射劑量1 800 Gy下的種子雖然出苗率達到49%，但是成苗率為0，與耿興敏[4]研究60Co-γ輻射對桂花種子幼苗生長的影響，高劑量種子的幼苗的成苗率為0的結果一致。幼苗的長度在低劑量輻射下可以促進幼苗的生長，800～1 500 Gy高劑量的輻射抑制幼苗的生長，與袁蒲英[5]研究60Co-γ射線輻射對蠟梅種子幼苗生長的影響和林仙淋[6]研究60Co-γ輻射對多花野牡丹幼苗生長發(fā)育的影響結果一致。60Co-γ輻射不同劑量處理苜蓿種子的幼苗的鮮質量和干質量均呈下降的趨勢，即輻射劑量越高幼苗的鮮質量和干質量越低，與李勝洪[7]研究60Co-γ輻射處理對紫花苜蓿部分生長的影響研究結果一致。

植物為適應輻照過后帶來的損害，而產(chǎn)生適應機制使植物免受逆境的傷害，也即是植物體內存在的抗氧化酶系統(tǒng)包括過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)等緩解因逆境帶來的傷害[8]。不同的酶對輻照誘導存在各自不同的調節(jié)機制。本研究在供試劑量范圍內，所檢測的2種酶活性表達水平較對照整體呈先上升后下降趨勢，但各種酶活性的變化情況又不完全相同。POD是細胞的呼吸代謝過程中一個重要的末端氧化酶，參與清除植物體內的 H2O2。隨著輻射劑量的增加，苜蓿的葉片和主根部分的過氧化物酶活性均呈先上升后下降的趨勢，均在輻射劑量為900 Gy時達到最大值，苜蓿的葉片與主根相比較，其葉片POD的酶活性積累大于主根。CAT酶是生物體內的主要抗氧化酶，它能促進細胞中過氧化氫的分解，減輕過氧化氫對細胞的損害。輻照后的苜蓿的葉片和主根中 CAT活性隨劑量加大表現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢，900 Gy時存在峰值，這與王月華[9]利用5種不同劑量的60Co-γ射線輻射處理草地早熟禾，對其體內酶活性的影響表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢一致。也和張玉[10]研究不同劑量60Co-γ射線輻射處理菊苣，其酶活性表現(xiàn)為隨著輻射劑量的升高表現(xiàn)出先升高后降低趨勢的結果一致。苜蓿葉片和主根比較，其葉片的CAT活性高于主根。CAT活性比POD活性的波動大，在消除過量的 H2O2方面起著主要的作用。不同輻射劑量對苜蓿產(chǎn)生的誘變效應不一致，其中的機制較為復雜，有待進一步研究。

4 結論

經(jīng)過600，900，1 200，1 500和1 800 Gy輻射劑量處理的苜蓿種子，在種子的出苗率、成苗率、幼苗長度和地上莖長度均隨著輻射劑量的增加呈下降的趨勢，幼苗的主根長度、鮮重、干重和含水量均隨著輻射劑量的增加呈下降的趨勢；幼苗的葉片和根的POD、CAT活性均隨隨著輻射劑量的增加呈先上升后下降的趨勢。60Co-γ射線輻射不同劑量對苜蓿幼苗生長表現(xiàn)為低劑量影響比較小，高劑量對幼苗的生長抑制作用比較大，對POD、CAT兩種抗氧化酶活性積累產(chǎn)生不同的影響。