Ca對(duì)Cd脅迫下旱柳無性系抗氧化酶活性影響的研究

李崇豪　尚曉碩　歐陽潔　李斌彬　翟婭禎　劉祥君　鄒金華

【摘 要】以生長(zhǎng)快、易繁殖的旱柳 （Salix matsudana Koidz）為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行水培，分別設(shè)置對(duì)照組、5mmol/L Ca組、50μmol/L Cd組、5mmol/L Ca+50μmol/L Cd組，培養(yǎng)28天后測(cè)定各組旱柳葉片和根系的抗氧化酶活性，以了解Cd脅迫下外源Ca對(duì)旱柳無性系植株抗氧化酶活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：（1）處理28天后，旱柳葉中SOD活性為50μmol/L Cd組>5mmol/L Ca+50μmol/L Cd組>5mmol/L Ca組>對(duì)照組，根中為對(duì)照組>5mmol/L Ca組>5mmol/L Ca+50μmol/L Cd組>50μmol/L Cd組；旱柳根和葉POD的活性均表現(xiàn)為：50μmol/L Cd組>5mmol/L Ca+50μmol/L Cd組>5mmol/L Ca組>對(duì)照組；旱柳根和葉CAT 的活性均為對(duì)照組>5mmol/L Ca組>5mmol/L Ca+50μmol/L Cd組>50μmol/L Cd組。（2）5mmol/L Ca+50μmol/L Cd組由于Ca的添加，與50μmol/L Cd組相比，旱柳SOD和POD的活性降低，CAT的活性升高，證明外源Ca能緩解Cd對(duì)旱柳的脅迫作用。

【關(guān)鍵詞】旱柳；Cd；Ca；抗氧化酶

中圖分類號(hào)： Q945 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 2095-2457（2018）12-0085-004

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2018.12.037

Effects of Ca on Antioxidant Enzyme Activities of Salix matsudana Koidz Clones Under Cd Stress

LI Chong-hao SHANG Xiao-shuo OUYANG Jie LI Bin-bin ZHAI Ya-zhen LIU Xiang-jun ZOU Jin-hua*

（College of Life Sciences，Tianjin Normal University，Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance， Tianjin 300387，China）

【Abstract】Fast-growing and easily-breeding Salix matsudana Koidz was used as the experimental material. Four groups of S. matsudana by hydroponic cultivation were set： the control group， 5mmol/L Ca treatment group， 50μmol/L Cd treatment group， and 5mmol/L Ca +50μmol/L Cd treatment group. After28days of cultivated， the antioxidant enzyme activities of leaves and roots of S. matsudana in each group were determined， and the effects of exogenous Ca on antioxidant enzyme activities of S. matsudana clones under Cd stress were studied. The results showed that： （1） 28 days later， the order of SOD activities in leaves was： 50μmol/L Cd treatment group>5mmol/L Ca+50μmol/L treatment group>5mmol/L Ca treatment group>control group， and the order of SOD activities in root was： control group>5mmol/L Ca group>5mmol/L Ca+50μmol/L treatment group>50μmol/L Cd treatment group； the order of POD activity in both roots and leaves was： 50μmol/L Cd treatment group>5mmol/L Ca+50μmol/L Cd treatment group>5mmol/L Ca treatment group>control group and the activity of CAT was： control group>5mmol/LCa treatment group>5mmol/L Ca+50μmol/L Cd treatment group>50μmol/L Cd treatment group. （2） Compared with 50μmol/L Cd treatment group， the activity of SOD and POD were decreased， however， the activity of CAT increased in the 5mmol/L Ca+50μmol/L Cd treatment group. Therefore， it was proved that exogenous Ca can relieve the stress of Cd on S. matsudana.

【Key words】Salix matsudana Koidz； Cd； Ca； Antioxidant enzymes

隨著工農(nóng)業(yè)的迅速發(fā)展，大量含有重金屬的工業(yè)廢水、生活垃圾造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，重金屬還可通過食物鏈進(jìn)入人體，危害健康。重金屬鎘（Cd）因其毒性高和移動(dòng)性大而備受關(guān)注，Cd對(duì)植物有毒害作用，抑制植物的生長(zhǎng)，影響植物細(xì)胞膜透性、抗氧化酶活性、光合作用以及植物器官對(duì)營養(yǎng)元素的吸收等[1]。

Cd毒性較強(qiáng)，尤其是在酸性土壤中，Cd更易于被植物體吸收積累，最終成為含鎘植物，進(jìn)而通過食物鏈的傳播轉(zhuǎn)移至人體內(nèi)，威脅人類的健康。Cd會(huì)刺激人體的呼吸道，長(zhǎng)時(shí)間暴露會(huì)導(dǎo)致嗅覺喪失癥、牙齦有黃斑或漸成黃圈等癥狀[2]。

外界環(huán)境中的Cd主要來源于自然因素和人類活動(dòng)。Cd主要以兩種形式對(duì)土壤造成污染：一種形式是工業(yè)廢氣中的Cd隨著風(fēng)擴(kuò)散，經(jīng)過空氣中自然的沉降作用，積累于工廠周圍的土壤中；另一種形式是用含Cd的工業(yè)廢水、生活廢水等灌溉農(nóng)田，使土壤受到嚴(yán)重的Cd污染。植物凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度等隨著Cd脅迫濃度的增加而下降，導(dǎo)致植物營養(yǎng)失衡和超微結(jié)構(gòu)損傷[3]，同時(shí)導(dǎo)致植物體內(nèi)的活性氧自由基含量增加，加速植物的衰老，降低植物產(chǎn)量。

鈣（Ca）是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的一種大量元素，是重要的調(diào)節(jié)因子，植物從氯化鈣等鹽類中吸收Ca離子。Ca主要存在于植物的葉片和衰老的組織器官中，它是一個(gè)不容易移動(dòng)的元素。Ca在生物膜系統(tǒng)中可以作為磷脂的磷酸根和膜蛋白的羧基之間的橋梁，可以保持生物膜的穩(wěn)定[4]。

缺Ca時(shí)會(huì)阻礙植物細(xì)胞壁的形成，影響細(xì)胞的有絲分裂過程，或者不能形成新的細(xì)胞壁，產(chǎn)生多核細(xì)胞[5]。缺Ca會(huì)抑制植物的生長(zhǎng)，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致植物的幼嫩器官化膿壞死。外源Ca能在一定程度上減輕高溫、低溫、缺水、鹽害等逆境對(duì)植物造成的傷害[6]。適量的Ca可增強(qiáng)旱柳對(duì)Cd脅迫的抗性，Ca可以通過抑制植物對(duì)Cd的吸收，促進(jìn)可溶性蛋白、可溶性糖和光合色素的合成，維持高的抗氧化物質(zhì)含量、礦質(zhì)營養(yǎng)平衡和總抗氧化能力來增強(qiáng)旱柳對(duì)Cd脅迫的抗性[7]。

Cd脅迫下，旱柳會(huì)受到氧化脅迫，為抵御活性氧化物的毒害作用，旱柳體內(nèi)的抗氧化酶活性會(huì)發(fā)生一系列的變化[8]。活性氧清除系統(tǒng)包括三種重要的抗氧化酶：超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）。SOD是活性氧清除系統(tǒng)的第一道防線，其作用為清除超氧陰離子，把超氧陰離子轉(zhuǎn)化為H2O2和O2。植物體內(nèi)的抗氧化能力越強(qiáng)，在受到Cd脅迫時(shí)其SOD活性越高，所以植物體內(nèi)SOD活性的大小標(biāo)志著植物抗氧化能力的強(qiáng)弱[9]。

POD在植物體內(nèi)廣泛存在，其活性在植物幼嫩組織中較低，衰老組織中較高，因此可以用POD的活性來判斷植物的老化程度[10]。與SOD類似，POD在植物細(xì)胞中也可以清除活性氧自由基，減輕Cd脅迫對(duì)植物體造成的傷害。

CAT也是植物體內(nèi)一種重要的清除劑。CAT可以催化植物中的過氧化氫分解為氧氣和水，主要存在于某些組織的過氧化物體內(nèi)，使細(xì)胞免于遭受過氧化氫的毒害。

旱柳（Salix matsudana Koidz）是我國重要的優(yōu)良造林樹種之一。旱柳的光合速率高，根系較發(fā)達(dá)，生長(zhǎng)速度快，繁殖容易，采用扦插等無性繁殖的方法容易成活，根莖修剪后容易萌發(fā)新枝，對(duì)生態(tài)環(huán)境具有較強(qiáng)的適應(yīng)性和抗逆性，適用于植物修復(fù)[11-12]。

本次實(shí)驗(yàn)主要研究外源Ca對(duì)Cd脅迫下旱柳無性系抗氧化酶活性的影響，探討Cd脅迫下抗氧化酶在防御系統(tǒng)中所起的作用，為旱柳在植物修復(fù)中的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料的培養(yǎng)與處理

本實(shí)驗(yàn)采用天津師范大學(xué)生物科技園內(nèi)的旱柳作為實(shí)驗(yàn)材料，選取相對(duì)較粗的長(zhǎng)勢(shì)一致的旱柳枝條，修剪成約15cm的短枝，分成四組，每組20枝固定在打好孔的泡沫板上。在含蒸餾水的塑料盆中室溫下培養(yǎng)，每24h換一次水。當(dāng)枝條培養(yǎng)至根長(zhǎng)約10cm且萌發(fā)出葉片后，添加1/2Hoagland營養(yǎng)液并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理。只添加了1/2Hoagland營養(yǎng)液的為對(duì)照組，其他三組分別置于濃度為5mmol/L Ca、50μmol/L Cd、5mmol/L Ca+50μmol/L Cd的營養(yǎng)液中培養(yǎng)28天。處理期間，每天觀察旱柳枝條的生長(zhǎng)狀況，每七天更換一次營養(yǎng)液，并及時(shí)添加蒸餾水以補(bǔ)充葉片蒸騰作用失去的水分。

1.2 抗氧化酶的活性測(cè)定

按照李合生[13]、Zhang[14]等人的實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定SOD、POD、CAT活性。并按下列公式計(jì)算酶活性。

SOD活性（U/g）=

■

POD活性（U/g）=

■

CAT活性（U/g）=

■

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 外源Ca對(duì)Cd脅迫下旱柳根和葉中SOD活性變化

圖1 顯示了28天后不同處理?xiàng)l件下旱柳葉片和根系中SOD活性的變化。結(jié)果顯示，在整個(gè)處理過程中，葉片中的SOD活性在50μmol/L Cd處理組中最高，其次是5mmol/L Ca+50μmol/L Cd處理組>5mmol/L Ca處理組>對(duì)照組，對(duì)照組的SOD活性處于最低，且各處理組之間酶活性變化顯著。說明50 μmol/L Cd處理對(duì)旱柳的毒害作用最大，SOD的活性的提高可以減輕Cd對(duì)旱柳的氧化損傷，施加外源Ca后的SOD酶活性比50μmol/L Cd處理時(shí)SOD酶活性降低。與葉片不同的是，旱柳根系中的SOD活性在對(duì)照組中最高，順序?yàn)?mmol/L Ca處理組>5mmol/L Ca +50μmol/L Cd處理組>50μmol/L Cd 處理組，在50μmol/L Cd處理時(shí)酶的活性最低，說明隨著50μmol/L Cd脅迫程度的加強(qiáng)，旱柳根系中SOD的活性逐漸降低，加入外源Ca后有效緩解了Cd的脅迫作用。

2.2 外源Ca對(duì)Cd脅迫下旱柳根和葉中POD活性變化

圖2 顯示28天后不同處理?xiàng)l件下旱柳葉片和根系中POD的活性變化。結(jié)果顯示，對(duì)照組中旱柳葉片的POD活性與其他組相比處于最低，且與Ca處理組相比變化幅度較小。各處理組中POD的活性為50μmol/L Cd處理組中最高，其次是5mmol/L Ca+50μmol/L Cd處理組和5mmol/L Ca處理組，對(duì)照組中POD活性最低，施加外源Ca后比50μmol/L Cd處理時(shí)POD的活性降低。對(duì)照組中旱柳根系的POD活性與其他組相比始終處于最低，整體變化為50μmol/L Cd處理組>5mmol/L Ca+50μmol/L Cd處理組>5mmol/L Ca處理組>對(duì)照組，說明Cd脅迫下旱柳受到嚴(yán)重傷害，施加了Ca后比50 μmol/L Cd處理時(shí)POD活性下降，說明外源Ca可以有效緩解Cd的脅迫作用。

2.3 外源Ca對(duì)Cd脅迫下旱柳根和葉中CAT活性變化

圖3 顯示28天后不同處理?xiàng)l件下旱柳葉片和根系中CAT的活性變化。結(jié)果顯示，旱柳葉片中的CAT活性始終大于根系，且處理28天后各實(shí)驗(yàn)組之間CAT活性差異顯著。在葉片中對(duì)照組CAT的活性最高，其次是5mmol/L Ca處理組>5mmol/L Ca +50μmol/L Cd 處理組>50μmol/L Cd處理組，在Cd處理時(shí)酶活性達(dá)到最低，說明Cd脅迫下會(huì)明顯抑制旱柳葉片內(nèi)CAT的活性，而外源Ca的加入則減緩了Cd對(duì)旱柳葉片CAT活性的抑制作用。在旱柳根系中CAT的活性較低，整體順序?yàn)閷?duì)照組>5mmol/L Ca處理組>5mmol/L Ca+50μmol/L Cd處理組>50μmol/L Cd處理組，外源Ca的加入顯著緩解了Cd對(duì)旱柳根系的毒害作用。

3 討論

Cd是植物細(xì)胞生長(zhǎng)的非必需元素，但Cd是毒性最強(qiáng)的重金屬元素之一，當(dāng)Cd進(jìn)入到植物體內(nèi)并積累到一定程度時(shí)，就會(huì)對(duì)植物體產(chǎn)生很強(qiáng)的毒害作用[15-16]。Cd會(huì)刺激植物體產(chǎn)生活性氧（ROS），ROS導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化，對(duì)植物體產(chǎn)生氧化脅迫，使植物的細(xì)胞膜受到傷害，這是其產(chǎn)生毒性的主要原因。Cd在植物體內(nèi)主要以與蛋白質(zhì)結(jié)合的形式存在，高劑量的Cd會(huì)干擾植物的正常形態(tài)和生長(zhǎng)發(fā)育[17]，使植物新長(zhǎng)出的葉片發(fā)黃失綠，還會(huì)抑制植物根系的生長(zhǎng)，使植物根的側(cè)根減少，產(chǎn)生褐變，此外，旱柳幼嫩細(xì)胞細(xì)胞壁中的纖維素、果膠和糖蛋白等化合物形成的網(wǎng)孔，對(duì)于植物吸收積累Cd元素均起到了很大作用[18]。Cd被植物體吸收后，會(huì)在植物體內(nèi)積累遷移，破壞植物根部，干擾植物的正常代謝，還會(huì)通過拮抗作用和協(xié)同作用影響植物體對(duì)其他元素的吸收利用，進(jìn)而影響植物體內(nèi)一系列的生理生化代謝活動(dòng)，加速植物的衰老過程[19]。

Ca是植物體必須的營養(yǎng)元素之一，Ca可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的粘性和滲透性，能維持細(xì)胞的正常形態(tài)和生理狀態(tài)，還參與植物細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成，酶的代謝等過程，是多種酶的組成成分和激活劑。研究表明，Cd的毒害作用干擾了植物細(xì)胞內(nèi)Ca代謝，致使Ca在細(xì)胞中不正常的分布，Ca的穩(wěn)態(tài)機(jī)制由此被破壞，施用外源Ca可以增加植物細(xì)胞內(nèi)部Ca的含量，細(xì)胞內(nèi)的 Ca 通過與鈣調(diào)素的結(jié)合來調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝過程，從而減輕了Cd脅迫對(duì)植物體造成的危害[20]。在本次實(shí)驗(yàn)研究中，施加一定濃度的外源Ca后，隨著植物體內(nèi) Ca 濃度的增加以及Cd和Ca的拮抗作用，使Cd對(duì)旱柳脅迫的毒性減弱，對(duì)Cd的吸收也大幅度下降，同時(shí)增強(qiáng)旱柳體內(nèi)的防御系統(tǒng)，使旱柳對(duì)各種營養(yǎng)元素的吸收也回歸正常[21]。

當(dāng)旱柳受到Cd脅迫時(shí)，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生活性氧自由基，造成細(xì)胞葉綠體和線粒體膜的損傷，破壞細(xì)胞的代謝平衡，引起植物產(chǎn)生氧化脅迫和膜質(zhì)過氧化，會(huì)抑制植物生長(zhǎng)甚至導(dǎo)致植物死亡[22]。在正常情況下，植物體可以抑制活性氧的產(chǎn)生而使其保持在最低水平，降低其對(duì)植物的毒害作用。旱柳體內(nèi)有多種抗氧化酶能降低ROS的傷害，其活性的提高是一種急性解毒措施。在Cd脅迫的條件下SOD、POD、CAT 的活性因抗性不同而異。SOD是抗氧化酶系統(tǒng)在植物體內(nèi)清除活性氧過程中的第一道防線，是植物體內(nèi)重要的抗氧化酶，能有效清除植物體內(nèi)的超氧自由基，使之歧化為H2O2，防止生物膜脂質(zhì)過氧化，對(duì)生物膜起到了保護(hù)作用[23]。在本次實(shí)驗(yàn)研究中，旱柳葉片在50μmol/L Cd脅迫下SOD的活性顯著增加，可能是因?yàn)楹盗w內(nèi)超氧陰離子自由基的增加引起編碼SOD的基因大量表達(dá)導(dǎo)致酶活性的提高。在施加了外源Ca后，旱柳體內(nèi)SOD的活性較對(duì)照組高，說明外源Ca可能會(huì)通過提高旱柳體內(nèi)SOD活性來減輕Cd脅迫對(duì)旱柳葉片造成的氧化損傷。旱柳根系在50μmol/L的Cd脅迫下SOD的活性達(dá)到最低，說明旱柳的根系比葉片敏感，過多的活性氧自由基破壞了細(xì)胞內(nèi)的多種功能膜及酶系統(tǒng)，使SOD的活性受到抑制而急劇下降。

POD也是植物體內(nèi)的抗氧化酶之一，被認(rèn)為是對(duì)外界環(huán)境條件的變化反應(yīng)靈敏的一種酶。POD的活性可以在植物體生長(zhǎng)發(fā)育的過程中和對(duì)外界逆環(huán)境的適應(yīng)性中體現(xiàn)，可通過愈創(chuàng)木酚作為電子供體在氧化過程中清除H2O2，將有毒的H2O2變?yōu)闊o毒的水，維持細(xì)胞低水平自由基，減輕逆境對(duì)植物體造成的傷害[24]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Cd處理組中POD的活性高于對(duì)照組，說明旱柳體內(nèi)具有形成抗氧化酶防御系統(tǒng)的潛能，可以適應(yīng)一定濃度的Cd脅迫。POD活性的增加是由于在Cd的脅迫下，旱柳體內(nèi)產(chǎn)生了H2O2，以及SOD在清除超氧陰離子自由基時(shí)產(chǎn)生的一小部分H2O2，過量的H2O2導(dǎo)致了旱柳體內(nèi) POD基因的大量表達(dá)。過氧化氫酶（CAT）能夠?qū)2O2轉(zhuǎn)化為H2O和O2，在植物體內(nèi)起清除 H2O2的作用。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CAT的活性在對(duì)照組中最高，隨著傷害的增大數(shù)值逐漸降低，在單一Cd處理組中達(dá)到最低，說明Cd的脅迫會(huì)降低旱柳體內(nèi)CAT的活性，而外源Ca的施加會(huì)減緩Cd對(duì)酶活性的抑制作用，維持植物的正常生長(zhǎng)。

4 結(jié)論

綜上所述，本次研究獲得以下結(jié)論：Cd脅迫會(huì)增加旱柳葉片中SOD活性和POD的活性，而CAT的活性降低。在旱柳根系中，Cd的脅迫降低了SOD和CAT的活性，增加了POD的活性。Cd脅迫下，外源Ca的施加能提升三種抗氧化酶的活性從而起到緩解Cd毒害作用。因此深入了解外源Ca與Cd拮抗作用，對(duì)于修復(fù)重金屬污染土壤，保護(hù)環(huán)境和提高植物抗性都具有重要意義。

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