乳清分離蛋白限制性脫酰胺及一些性質(zhì)的表征

李丹，易偉民，范馨文，翟愛華，關(guān)琛

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶163319）

乳清分離蛋白（whey protein isolated，WPI）是一種優(yōu)質(zhì)的動物性蛋白資源，由于其具有營養(yǎng)價值高、易消化吸收、含有多種活性成分等特點，乳清分離蛋白日漸受到重視[1]。資料顯示，每年美國由制作干酪而產(chǎn)生的乳清達3 300萬噸，但僅有55%的乳清得到了進一步加工，其余未加工的乳清隨污水排放，既造成資源浪費又造成環(huán)境污染[2]。因此，生產(chǎn)一些高附加值產(chǎn)品使乳清蛋白被充分利用顯得尤為重要。近年來，與乳清分離蛋白有關(guān)的研究也有很多[3-4]，然而幾乎沒有與脫酰胺有關(guān)的研究。

酶法脫酰胺主要使蛋白質(zhì)分子側(cè)鏈的谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為谷氨酸，使肽鏈內(nèi)的負電荷有所增加，最終使得蛋白質(zhì)的許多功能性質(zhì)，如溶解性、表面疏水性、抗氧化性、與二價金屬離子螯合的能力等特性均受到不同程度的影響[5]。Matsudomi[6]、Hamada[7]等指出，脫酰胺作用基本不影響蛋白的一級與二級結(jié)構(gòu)，食物蛋白的脫酰胺度達2%～6%時就能顯著提高食物中蛋白質(zhì)的相關(guān)功能特性，尤其是溶解性。聶小華等[8]采用HCl對大米蛋白進行脫酰胺處理，結(jié)果表明，脫酰胺處理使大米蛋白功能性質(zhì)均得到顯著提高，而且脫酰胺大米蛋白的表面疏水性也發(fā)生了明顯下降。

本研究采用谷氨酰胺酶（EC 3.2.1.5），對乳清分離蛋白進行限制性脫酰胺，從而制得具有較低脫酰胺度的蛋白產(chǎn)物，并對其產(chǎn)物的界面性質(zhì)及Fe2+/Zn2+等二價金屬離子的螯合能力進行了評價和比較。研究結(jié)果可以為多功能食品的開發(fā)提供很好的基料，為乳清分離蛋白更好地應(yīng)用于食品加工業(yè)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳清分離蛋白：天津銀河偉業(yè)進出口有限公司；3-（2-吡啶基）-5，6-雙（4-苯磺酸）-1，2，4-三嗪（Ferrozine）、谷氨酰胺酶（EC 3.2.1.5，酶活為 17.3 U/g）：美國Sigma公司；大豆油：九三集團；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

UV-2401PC紫外-可見分光光度計：日本島津公司；Kjeltec TM 3200全自動凱氏定氮儀：瑞士Foss公司；AR224CN型電子天平：奧豪斯國際貿(mào)易（上海）有限公司；JJ-1型精密定時電動攪拌器：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；LD4-1.8型臺式離心機：北京京立離心機有限公司。

1.2 方法

1.2.1 乳清分離蛋白限制性脫酰胺

將一定量的乳清分離蛋白溶液與超純水、不同體積的谷氨酰胺酶溶液（濃度為0.1 g/mL）混合，配制成乳清分離蛋白濃度為5%、酶添加量分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 U/g乳清分離蛋白的反應(yīng)體系。體系分別在 30、33、36、39、42 ℃下反應(yīng) 1 h～20 h，按照以下方法分別測定產(chǎn)物的脫酰胺度。以未加谷氨酰胺酶溶液的乳清分離蛋白溶液為空白。

1.2.2 蛋白質(zhì)含量測定

蛋白質(zhì)含量測定采用凱氏定氮法GB/T 5009.5-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定》）[9]。

1.2.3 脫酰胺度測定

脫酰胺度測定采用苯酚-次氯酸鹽法[10]。

分別準(zhǔn)確稱取5.0 g苯酚、25 mg亞硝基鐵氰化鈉，并加入雙蒸水定容至500 mL配制試劑A備用。準(zhǔn)確稱取2.5 g NaOH并溶于雙蒸水中，移取4.2 mL次氯酸鈉溶液加入到NaOH溶液中，并容至500 mL配制試劑B。

準(zhǔn)確移取5.0 mL試劑A于試管中，加入20 μL不同濃度的硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)溶液（或待測樣品），充分振蕩、混勻。然后準(zhǔn)確移取5.0 mL試劑B加入到上述混合溶液中，充分振蕩、混勻。迅速轉(zhuǎn)移至水浴鍋中，在37℃下水浴顯色20 min。然后冷卻至室溫，在625 nm處測定溶液吸光值。每個濃度做3個平行。

根據(jù)所測定的樣品游離氨含量及總酰胺含量，計算脫酰胺度，計算公式見式（1）。

1.2.4 Fe2+螯合能力測定

采用Ferrozine顯色法測定二價鐵螯合能力[11]，略有改動。

準(zhǔn)確吸取0.25 mL樣品溶液（1 mg/mL，終濃度0.10 mg/mL） 與0.15 mL 1 mmol/L的 FeSO4·7H2O 溶液（終濃度0.03 mmol/L，現(xiàn)用現(xiàn)配）混合。加入1.20 mL超純水，使反應(yīng)體系終體積為1.50 mL。混勻后放置2 min，再加入1.00 mL 0.50 mmol/L的Ferrozine顯色劑水溶液（終濃度0.20 mmol/L），充分振蕩、混勻。室溫下靜置反應(yīng)10 min，使Fe2+與Ferrozine充分結(jié)合，形成穩(wěn)定的Fe2+-Ferrozine復(fù)合物，紫外分光光度法562 nm下測定吸光值。樣品對Fe2+的螯合效率計算公式見式（2）：

式中：AT為樣品吸光度；AC為對照樣吸光度。

1.2.5 Zn2+螯合能力測定

樣品鋅離子螯合能力的測定參照Wang等[12]的方法，計算方法略有改動。

鋅-肽螯合反應(yīng)：分別取1.0 mL 0.05 mol/L ZnSO4（乙醇溶解）于4個25 mL離心管中，并分別緩慢滴入10 mL 2%的乳清分離蛋白和3份不同脫酰胺度的脫酰胺乳清分離蛋白樣品溶液（用體積分數(shù)為50%的乙醇溶解），室溫下攪拌反應(yīng)1 h，直至有白色沉淀生成。

螯合鋅含量的測定：分別取上述反應(yīng)液5 mL于4個燒杯中濃縮至近干，加入15 mL無水乙醇，混勻后5 000 r/min離心20 min，取沉淀并用蒸餾水定容至50 mL。用乙二胺四乙酸（elhylene diamine tetraacetic acid，EDTA）絡(luò)合滴定法測定螯合態(tài)鋅的含量。移取20 mL容量瓶中的溶液至錐形瓶中，加兩滴二甲酚橙指示劑（0.5%水溶液），滴加質(zhì)量分數(shù)為20%的六亞甲基四胺-鹽酸緩沖液（pH 5.0）至溶液呈穩(wěn)定的紫紅色后再加入4 mL緩沖液，用已標(biāo)定的0.001 mol/L EDTA溶液滴定至溶液由紫紅色變成黃色，記錄EDTA的消耗量。樣品的Zn2+螯合能力計算公式見式（3）：

式中：AP為沉淀中Zn2+含量，mg；P為樣品蛋白質(zhì)含量，g。

1.2.6 界面性質(zhì)測定

1.2.6.1 乳化性及乳化穩(wěn)定性的測定

分別配置濃度為0.01%、0.02%、0.03%和0.04%的脫酰胺蛋白溶液。取150 mL蛋白溶液與50 mL大豆油混合，12 000 r/min均質(zhì) 1 min，靜置，在 0 min和10 min時從容器底部取50μL乳狀液于試管中，加5mL 0.1%的十二烷基磺酸鈉（sodium dodecylsulphate，SDS），充分混勻，于500 nm處測定吸光度值（以0.1%的SDS調(diào)整儀器零點）[13]。乳化活性指數(shù)及乳化穩(wěn)定性的計算方法見公式（4）、（5）。

式中：T=2.303；A0為零時刻的吸光度值；C為蛋白質(zhì)濃度，g/mL；Φ為溶液中油的體積分數(shù)；A10為靜置10 min后的吸光度值。

1.2.6.2 起泡性及泡沫穩(wěn)定性的測定

準(zhǔn)確稱取2 g乳清分離蛋白（脫酰胺乳清分離蛋白），加入100 mL水，置于裝料杯中，在高速組織搗碎機中攪打1 min，迅速倒入500 mL量筒中，記錄泡沫體積a；靜置10 min后，再次測量泡沫體積b[14]。起泡性與泡沫穩(wěn)定性計算公式見公式（6）、（7）。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS16.0軟件中的單因素方差分析（Oneway ANOVA）和Duncan’s多重比較法進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，p＜0.05為差異顯著，p＜0.01為差異極顯著。所有指標(biāo)的數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。用Excel 2007軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳清分離蛋白限制性脫酰胺反應(yīng)條件

通過研究發(fā)現(xiàn)，酶添加量分別為 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 U/g乳清分離蛋白時，谷氨酰胺酶對乳清分離蛋白的脫酰胺作用隨酶添加量的增加而增大（如圖1），而酶添加量分別為0.8、1.0 U/g乳清分離蛋白時，脫酰胺度沒有大幅度變化，基本一致。

圖1 酶添加量對乳清分離蛋白脫酰胺度的影響（n=3）Fig.1 The effect of addition level of glutaminase on the degree of deamidation of WPI（n=3）

脫酰胺度隨反應(yīng)時間的延長而增加（如圖2）。

圖2 反應(yīng)時間對乳清分離蛋白脫酰胺度的影響（n=3）Fig.2 The effect of reaction time of glutaminase on the degree of deamidation of WPI（n=3）

當(dāng)反應(yīng)達到8 h以上時，脫酰胺度趨于平緩狀態(tài)。說明即使繼續(xù)延長反應(yīng)時間，也不會增加脫酰胺度。因此，酶添加量選取0.8 U/g乳清分離蛋白、反應(yīng)時間在8 h以下為宜。

乳清分離蛋白的脫酰胺反應(yīng)還與反應(yīng)溫度及pH值有關(guān)（如圖3、圖4）。

圖3 反應(yīng)溫度對乳清分離蛋白脫酰胺度的影響（n=3）Fig.3 The effect of reaction temperature on the degree of deamidation of WPI（n=3）

圖4 反應(yīng)pH值對乳清分離蛋白脫酰胺度的影響（n=3）Fig.4 The effect of pH on the degree of deamidation of WPI（n=3）

隨著反應(yīng)溫度的提高，乳清分離蛋白脫酰胺度呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)溫度為36℃時，脫酰胺度（2.1%）達到最高。另外，反應(yīng)pH值對乳清分離蛋白脫酰胺度也有不同程度的影響。當(dāng)pH值為7時，乳清分離蛋白脫酰胺度達到最高，這說明，谷氨酰胺酶在pH7條件下作用于乳清分離蛋白時，其酶活性達到最高。

因此，可以初步確定乳清分離蛋白限制性脫酰胺反應(yīng)的適宜條件為：乳清分離蛋白溶液濃度5%、酶添加量0.8 U/g乳清分離蛋白、反應(yīng)溫度36℃、反應(yīng)pH為7。在此條件下，反應(yīng)分別進行1、4、8 h時，乳清分離蛋白脫酰胺度分別為1.5%、2.3%、2.9%，在以后的研究中分別稱為脫酰胺乳清分離蛋白（deamidated whey protein isolated，DWPI）1、2、3（或 DWPI 1、DWPI 2、DWPI 3）。

2.2 脫酰胺對乳清分離蛋白界面性質(zhì)的影響

2.2.1 乳化性質(zhì)

食品蛋白質(zhì)的功能特性與分子結(jié)構(gòu)具有高度相關(guān)性，因此脫酰胺反應(yīng)也必定影響到乳清分離蛋白的功能性質(zhì)。乳清分離蛋白、脫酰胺乳清分離蛋白的乳化活性及乳化穩(wěn)定性的相關(guān)評價結(jié)果如圖5、圖6所示。本研究選取脫酰胺反應(yīng)1 h和8 h的乳清分離蛋白制品DWPI 1、DWPI 3作為分析對象。

圖5 乳清分離蛋白與脫酰胺乳清分離蛋白的乳化活性指數(shù)（n=3）Fig.5 Emulsifying activity index of WPI and DWPI products（n=3）

圖6 乳清分離蛋白與脫酰胺乳清分離蛋白的乳化穩(wěn)定性（n=3）Fig.6 Emulsifying stability index of WPI and DWPI products（n=3）

由圖5可知，與乳清分離蛋白相比，4個濃度下的脫酰胺乳清分離蛋乳狀液的乳化活性指數(shù)均呈降低趨勢，而乳化穩(wěn)定性都有不同程度的升高，尤其在高濃度下，脫酰胺乳清分離蛋白較乳清分離蛋白而言具有非常高的乳化穩(wěn)定性。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度為0.03%時，DWPI 1和DWPI 3的乳化穩(wěn)定性接近100%，而WPI的乳化穩(wěn)定性僅為70%。這一結(jié)果顯示，經(jīng)谷氨酰胺酶脫酰胺的乳清分離蛋白制品提高了乳化穩(wěn)定性，而削弱了乳化活性。乳清分離蛋白經(jīng)脫酰胺后，會生成更多的谷氨酸殘基，從而乳清分離蛋白分子增加了許多帶負電荷的羧基。從而導(dǎo)致修飾后的蛋白質(zhì)分子疏水性降低，蛋白質(zhì)分子間的靜電斥力增大，與水結(jié)合的能力有所提高。從理論上講，蛋白質(zhì)的疏水性降低會導(dǎo)致蛋白質(zhì)修飾產(chǎn)物的乳化活性降低，而蛋白質(zhì)間的靜電斥力和與水結(jié)合的能力增加，導(dǎo)致乳化穩(wěn)定性提高。這也解釋了，脫酰胺乳清分離蛋白的乳化活性比乳清分離蛋白的低，而乳化穩(wěn)定性有所提高的原因。

2.2.2 泡沫性質(zhì)

經(jīng)過對比乳清分離蛋白與脫酰胺乳清分離蛋白制品（DWPI 1、DWPI 3）的另外一個界面性質(zhì)—泡沫性質(zhì)發(fā)現(xiàn)，在同一濃度下，脫酰胺乳清分離蛋白的起泡性比乳清分離蛋白的起泡性有所提高，并且隨著脫酰胺度的增加，起泡性隨著增加，而泡沫穩(wěn)定性隨脫酰胺度的增加有所降低（如圖7）。

圖7 乳清分離蛋白與脫酰胺乳清分離蛋白的泡沫性質(zhì)（n=3）Fig.7 Foam properties of WPI and DWPI products（n=3）

本研究中，DWPI 3的起泡性為85.2%，為WPI的1.86倍；而WPI的泡沫穩(wěn)定性是DWPI 3的1.6倍。究其原因，起泡性的提高與脫酰胺度有關(guān)。

2.3 乳清分離蛋白及脫酰胺乳清分離蛋白對Fe2+/Zn2+的螯合能力

有研究表明，蛋白質(zhì)水解物具有與金屬離子如鐵、鋅等螯合的能力，進而提高礦物質(zhì)的溶解性和生物利用率[15]。本試驗測定了乳清分離蛋白及脫酰胺乳清分離蛋白產(chǎn)物DWPI 1、DWPI 2、DWPI 3與二價金屬離子的螯合能力，研究脫酰胺度對乳清分離蛋白與二價金屬離子螯合能力的影響，結(jié)果如表1所示。

從表1中能夠看出，與乳清分離蛋白相比，脫酰胺乳清分離蛋白螯合二價鐵的能力略有增加，當(dāng)脫酰胺度達到2.9%時，DWPI 3與Fe2+螯合能力達到（2.98±0.19）%，比乳清分離蛋白的螯合能力提高了49.7%，即乳清分離蛋白殘基上谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為谷氨酸的量越多，與二價鐵螯合能力越強。

表1 乳清分離蛋白與脫酰胺乳清分離蛋白產(chǎn)物的Fe2+、Zn2+螯合能力（n=3，p＜0.05）Table 1 Iron，zinc chelating activity of WPI or DWPI products（n=3，p＜0.05）

同樣，乳清分離蛋白及脫酰胺產(chǎn)物與Zn2+螯合能力的測定結(jié)果顯示，隨著脫酰胺度的增加，脫酰胺蛋白產(chǎn)物的Zn2+螯合能力呈現(xiàn)增大的趨勢，DWPI 3的Zn2+螯合能力較WPI的螯合能力提高了27.3%。Wang等[16]研究結(jié)果表明，蛋白質(zhì)水解物與Zn2+螯合能力不同，是由其游離氨基的含量引起的，因此脫酰胺乳清分離蛋白表現(xiàn)出不同的Zn2+螯合能力也可能與其游離氨含量不同有關(guān)。

食品蛋白質(zhì)螯合金屬離子能力越強，其相關(guān)生物活性就越強，如對Fe2+螯合能力越強，其蛋白質(zhì)抗氧化能力越強；對Zn2+螯合能力越強，其蛋白質(zhì)ACE抑制作用也相應(yīng)提高[17]。因此，脫酰胺乳清分離蛋白與Fe2+/Zn2+的螯合能力有益于促進蛋白的其他生物活性。

3 結(jié)論

以脫酰胺度為評價指標(biāo)，通過單因素分析考察酶添加量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)pH值及反應(yīng)時間對乳清分離蛋白限制性脫酰胺的影響并確定適宜的脫酰胺條件：乳清分離蛋白的濃度為5%、谷氨酰胺酶添加量0.8 U/g乳清分離蛋白、36℃、pH 7。在此適宜反應(yīng)條件下分別反應(yīng)1、4、8 h，制得3種脫酰胺乳清分離蛋白，其脫酰胺度分別為1.5%、2.3%、2.9%。限制性脫酰胺對乳清分離蛋白的一些功能性質(zhì)有了不同程度的改變，其中脫酰胺反應(yīng)提高了乳清分離蛋白的乳化穩(wěn)定性、起泡性及對二價金屬離子Fe2+/Zn2+的螯合能力，并隨著脫酰胺度的增加而增加；而脫酰胺乳清分離蛋白的乳化活性及泡沫穩(wěn)定性由于限制性脫酰胺作用而有所下降。研究結(jié)果可以為開發(fā)多功能食品提供很好的基料以及理論基礎(chǔ)。