擬南芥IQM1互作蛋白的篩選與驗證

羅慧婷　呂天曉　范甜　謝楚萍　周玉萍　田長恩

【摘 要】擬南芥IQM1為一個Ca2+不依賴型的鈣調(diào)素結(jié)合蛋白，由AT4G33050編碼，包含1個IQ基序。本實驗室的前期研究發(fā)現(xiàn)，IQM1介導光和非生物脅迫信號的轉(zhuǎn)導，參與氣孔開放和根生長發(fā)育的調(diào)節(jié)。為了探討IQM1調(diào)控這些生理進程的分子機制，本研究構(gòu)建了IQM1與GAL4 DNA結(jié)合域BD的融合誘餌蛋白BD-IQM1質(zhì)粒，與擬南芥幼苗cDNA的GAL4系統(tǒng)酵母雙雜交文庫AD質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化AH109酵母，經(jīng)過初篩、復篩、測序得到了14個候選互作蛋白，經(jīng)過一對一酵母雙雜交互作驗證，初步確定編碼基因At5g51570和轉(zhuǎn)錄因子TCP21都與IQM1蛋白存在互作關(guān)系。

【關(guān)鍵詞】IQM1；擬南芥；TCP21；互作蛋白

中圖分類號： Q946 文獻標識碼： A 文章編號： 2095-2457（2018）09-0083-002

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2018.09.039

Screening and Verification of the Protein Interacting with IQM1 in Arabidopsis

LUO Hui-ting LV Tian-xiao FAN tian XIE Chu-ping ZHOU Yu-ping TIAN Chang-En*

（Guangzhou Key Laboratory for Functional Study on Plant Stress-Resistant Genes，Guangzhou University，Guangzhou Guangdong 510006）

【Abstract】The IQM1 protein encoded by Arabidopsis thaliana AT4G33050 is a Ca2+-independent calmodulin-binding protein containing an IQ motif.Our previous study found that IQM1 mediates the transduction of light and abiotic stress signals and participates in the regulation of stomatal opening and root growth.In order to investigate the biomolecular mechanism of IQM1 involved in Arabidopsis thaliana，we first constructed the fusion bait protein BD-IQM1 between IQM1 and GAL4 DNA binding domain BD，and the Arabidopsis yeast cDNA library GAL4 system yeast two-hybrid library AD plasmid The transformed AH109 yeast was screened，screened，and sequenced to obtain 14 encoded proteins.After confirmation by one-to-one yeast two-hybrid experiment，the interaction between At5g51570 and TCP21 was preliminarily confirmed to have an interaction with IQM1 protein.

【Key words】IQM1；Arabidopsis thaliana；TCP21；Interaction protein

0 前言

擬南芥IQM家族共有6個成員，即IQM1-IQM6，均只含有1個能與鈣調(diào)素結(jié)合的 IQ 基序（氨基酸序列為IQXXXRGXXXR），N-端與豌豆重金屬誘導蛋白6A（Pea HeavyMmetalInducedProtein 6A，PHMIP 6A）同源，C-端與天花粉素（Trichosantin）同源[1]。其中，IQM1由At4g33050編碼。通過酵母雙雜交和雙分子熒光互補實驗證明IQM1在體內(nèi)、外都能與CaM結(jié)合，蛋白截短實驗證明IQ基序是其鈣調(diào)素結(jié)合所必需的結(jié)構(gòu)域[2]。本實驗室對IQM1進行了初步研究，發(fā)現(xiàn)該基因主要在根成熟區(qū)的皮層、葉片氣孔保衛(wèi)細胞和表皮毛中表達，iqm1突變體表現(xiàn)為根伸長減慢以及對光、暗和脫落酸誘導的氣孔運動不敏感的表型，且突變體氣孔中活性氧含量增高[2]。過量表達IQM1基因使光誘導下氣孔開度明顯比野生型和iqm1-1大，在暗誘導下氣孔開度則顯著變小，且主根比野生型和iqm1-1長，這表明了IQM1在植物氣孔運動和根系生長起著重要作用[3]。其次，本實驗室還發(fā)現(xiàn)IQM1可能介導JA信號參與植物氣孔防衛(wèi)[4-5]。本研究構(gòu)建pGBKT7-IQM1載體篩選擬南芥IQM1的互作蛋白，旨在進一步研究IQM1參與上述各項生理過程的具體分子機制，為IQM家族蛋白的研究提供更多的科學證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

pGBKT7、pGADT7載體質(zhì)粒，pGADT7-cDNA文庫質(zhì)粒，大腸桿菌Trans1-T1、酵母AH109菌株由本實驗室保存。試劑盒和工具酶：質(zhì)粒提取試劑盒、DNA 純化試劑盒、膠回收試劑盒和限制性核酸內(nèi)切酶均購自 TAKARA公司?；瘜W試劑及其他：硫酸鏈霉素、氨芐青霉素、氯化鈉、蛋白胨、瓊脂粉、葡萄糖、酵母提取物等購自生工公司；潮霉素、X-α-gal等購自Sigma公司。引物合成及DNA測序：由金唯智公司完成。

引物序列：

1.2 實驗方法

酵母雙雜交篩選cDNA文庫：用Nde I和Pst I雙酶切構(gòu)建誘餌載體pGBKT7-IQM1，轉(zhuǎn)化AH109酵母感受態(tài)得到酵母轉(zhuǎn)化子。用含有正確pGBKT7-IQM1誘餌質(zhì)粒的AH109酵母轉(zhuǎn)化子作為受體菌制備感受態(tài)，將文庫質(zhì)粒pGADT7-cDNA轉(zhuǎn)入其中，涂SD-Trp-Leu-His-Ade平板篩選。將所得陽性菌株分別搖菌、提質(zhì)粒、DNA測序，并與GeneBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行BLAST比對分析。

酵母雙雜交[6]驗證互作蛋白：分別克隆互作蛋白的編碼基因，雙酶切連接pGADT7載體，用pGBKT7-IQM1分別與這些載體進行一對一酵母雙雜交實驗，初步確定與pGBKT7-IQM1相互作用的蛋白。

2 結(jié)果與分析

構(gòu)建酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7-IQM1，篩選cDNA文庫，經(jīng)過對陽性克隆的His和Ade以及LacZ報告基因檢測，DNA測序和BLAST比對分析，結(jié)果得到了包括基因編碼蛋白At2g37130和At5g51570在內(nèi)的14個不同的候選互作蛋白。我們分別克隆了這14個編碼序列，再次利用酵母雙雜交進行一對一互作驗證（表1）。

酵母雙雜交一對一驗證結(jié)果顯示，在14個候選蛋白中只有編碼蛋白At5g51570和轉(zhuǎn)錄因子TCP21（At5g08330）與IQM1在酵母中相互作用。14個候選蛋白與IQM1在酵母中的驗證結(jié)果如圖1所示。

3 討論

已知擬南芥IQM1編碼一個全新的Ca2+不依賴的鈣調(diào)素結(jié)合蛋白，介導CaM、光和部分非生物脅迫信號的轉(zhuǎn)導，參與氣孔防衛(wèi)和根生長發(fā)育的（下轉(zhuǎn)第88頁）（上接第84頁）調(diào)節(jié)。但IQM1在擬南芥中發(fā)揮作用的分子機理仍然未知，因此有必要通過研究其互作蛋白及其調(diào)控機制。本文構(gòu)建pGBKT7-IQM1酵母載體篩選擬南芥幼苗cDNA文庫，得到14個不同的候選互作蛋白。通過一對一酵母雙雜交驗證得到兩個與IQM1在酵母中互作的蛋白。其中At5g51570的基因功能尚未明確，而轉(zhuǎn)錄因子TCP21是生物鐘基因CCA1的轉(zhuǎn)錄抑制子，使CCA1基因表達下調(diào)[7]。這一結(jié)果為IQM1后續(xù)的功能研究提供了參考，接下來還需要利用BiFC和Co-IP在植物體內(nèi)對TCP21與IQM1的互作進行進一步的驗證。

【參考文獻】

[1]Zhou YP，F(xiàn)ujibe T，Wang XL，Cheng HZ，Yamamoto KT，Tian CE.Initial characterization of Arabidopsis T-DNA insertion mutants of the IQM1 gene that encodes an IQ motif-containing protein.Plant Cell Physiol，2007，48（Suppl）：s197.

[2]周玉萍，陳瓊?cè)A，陳潔珊，陳惠貞，田長恩.IQM1過量表達對擬南芥氣孔運動及根系生長的影響[J].西北植物學報， 2013，33（5）：904–910.

[3]Zhou YP，Duan J，Yamamoto KT，Tian CE.AtIQM1，a novel calmodulin-binding protein，is involved in stomatal movement in Arabidopsis[J].Plant Mol Biol，2012，79（5）：333–346.

[4]黃章科.擬南芥IQM1介導CaM信號參與氣孔防衛(wèi)的研究[D].廣州：廣州大學，2015.

[5]莫忠蓁.擬南芥IQM1介導茉莉酸信號轉(zhuǎn)導的分子遺傳學研究[D].廣州：廣州大學，2015.

[6]Fields S，Song O.A novel genetic system to detect protein- protein interactions[J].Nature，1989，340（6230）：245-246.

[7]劉麗娟，高輝.TCP家族基因研究進展[J].生物技術(shù)通報， 2016，32（9）：14-22.