貝伐單抗對(duì)兔耳損傷模型增生性瘢痕形成的影響

彭慧子,張玉蓉,苗常青

(1西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形美容科,西安 710061;2西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科;3西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診科;*通訊作者,E-mail:mcqfree@163.com)

目前治療增性性瘢痕主要采用類固醇注射、放療、激光和外用硅凝膠等方法[1]。由于增生性瘢痕形成過(guò)程復(fù)雜,一種治療方法只能干擾增生性瘢痕形成的某一環(huán)節(jié),因而需要聯(lián)合應(yīng)用,才能取得好的效果。血管生成對(duì)于傷口愈合至關(guān)重要。許多研究表明,過(guò)度血管生成會(huì)導(dǎo)致瘢痕形成,而且增生性瘢痕中新生毛細(xì)血管明顯多于一般瘢痕[2,3]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是血管生成的關(guān)鍵因素,病理性瘢痕中VEGF表達(dá)及血管數(shù)量均高于正常皮膚[4]。此外,眼部纖維化疾病及風(fēng)濕性疾病患者中VEGF表達(dá)均增高[5]。貝伐單抗是一種抗VEGF單克隆抗體,在眼科研究中已經(jīng)證實(shí),貝伐單抗具有抗血管生成作用[6]?？筕EGF藥物也可有效抑制瘢痕的形成[7],但是對(duì)增生性瘢痕形成影響還沒有相關(guān)報(bào)道。因而,本研究旨在評(píng)估貝伐單抗對(duì)兔耳損傷模型增生性瘢痕形成的影響,為臨床上抗VEGF治療增生性瘢痕奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡雌性新西蘭白兔10只,體質(zhì)量2 400-2 600 g,購(gòu)于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,合格證號(hào):醫(yī)動(dòng)字第07-002號(hào)。動(dòng)物在室溫下自由飲食和飲水。

1.2 主要試劑

貝伐單抗(瑞士羅氏制藥公司),抗CD31抗體(美國(guó)Sigma公司),VEGF酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(上海內(nèi)含子生物科技有限公司),HE染料(美國(guó)Sigma公司),馬松三色染色試劑盒(上海博谷生物科技有限公司)。

1.3 兔耳損傷模型制備

根據(jù)文獻(xiàn)[8]的方法制備兔耳增生性瘢痕模型,經(jīng)兔耳緣靜脈注射1%戊巴比妥鈉麻醉,避開雙耳腹側(cè)大血管,用手術(shù)刀在兔耳腹側(cè)面遠(yuǎn)離耳根部少毛區(qū)制備直徑約6 mm的圓形孔,每只兔耳制備4個(gè)孔,孔間隔約1.5 cm。圓孔去除皮膚和皮下軟組織,并剝離軟骨膜,暴露創(chuàng)面,待其自然愈合。于打孔后第2天開始在左側(cè)兔耳瘢痕內(nèi)注射貝伐單抗(0.2 ml/5 mg),為貝伐單抗組;右側(cè)瘢痕內(nèi)注射等量生理鹽水做為對(duì)照,1次/2 d,共7次,直到第14天。

1.4 VEGF水平檢測(cè)

在兔耳損傷模型后第10天,選擇2只兔,收集每只兔子兩耳增生瘢痕組織,用PBS沖洗,采用RIRP裂解緩沖液提取蛋白,然后混合液經(jīng)10 000 r/min離心10 min,按照酶聯(lián)免疫吸附試劑盒的說(shuō)明,檢測(cè)上清液中VEGF含量。

1.5 組織學(xué)分析

兔耳損傷模型后第40天,選擇6只兔,收集每只兔子兩耳增生瘢痕組織,10%福爾馬林固定,石蠟包埋切片,3只兔子分別進(jìn)行HE染色和馬松三色染色。

1.6 瘢痕增生指數(shù)(SEI)分析

HE染色兔耳增生瘢痕組織,低倍鏡下采用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng),分別檢測(cè)創(chuàng)面后真皮厚度和相臨正常組織真皮厚度,計(jì)算SEI[9]。SEI=(兔耳腹面瘢痕處皮膚厚度-鄰近正常組織皮膚厚度)/鄰近正常組織皮膚厚度。

1.7 毛細(xì)血管數(shù)評(píng)估

在兔耳損傷模型后第40天,提取剩余2只兔子兩耳增生瘢痕組織,采用CD31抗體對(duì)瘢痕組織切片進(jìn)行免疫組化標(biāo)記,高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野,用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)每個(gè)視野下CD31染色血管數(shù),直徑≤50 μm血管被視為毛細(xì)血管,求其平均數(shù)作為該標(biāo)本毛細(xì)血管數(shù)。再按Weidner方法,計(jì)算出組織切片中每平方毫米毛細(xì)血管數(shù)[10]。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。貝伐單抗和對(duì)照組比較采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兔耳損傷創(chuàng)面組織學(xué)變化

兔耳損傷模型后2周,兔耳所有缺損愈合,上皮形成。兩組間創(chuàng)面愈合時(shí)間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。HE染色表明,與對(duì)照組比較,貝伐單抗組瘢痕高度較低,瘢痕表面較規(guī)則(見圖1);馬松三色染色表明,貝伐單抗組膠原纖維呈規(guī)則和疏松分布,而對(duì)照組膠原纖維呈雜亂和致密分布(見圖2)。

A. 對(duì)照組 B. 貝伐單抗組圖1 兩組兔耳瘢痕表面組織學(xué)分析 (HE染色,×100)Figure 1 Histological analysis of rabbit ear scar surface in two groups (HE staining,×100)

A. 對(duì)照組 B. 貝伐單抗組圖2 兩組兔耳膠原分布組織學(xué)分析 (馬松三色染色,×400)Figure 2 Histological analysis of the distribution of collagen in rabbit ears in two groups (Masson,×400)

2.2 兔耳增生瘢痕組織SEI變化

兔耳損傷模型第40天,貝伐單抗組SEI是1.85±0.14,對(duì)照組是1.98±0.15,貝伐單抗組SEI顯著低于對(duì)照組(P=0.004)。

2.3 兔耳增生瘢痕組織VEGF表達(dá)水平

兔耳損傷模型第10天,貝伐單抗組VEGF表達(dá)水平是(38.75±11.02)pg;對(duì)照組是(82.54±21.62)pg,貝伐單抗組顯著低于對(duì)照組(P=0.001)。

2.4 兔耳增生瘢痕組織毛細(xì)血管數(shù)量

兔耳損傷模型第40天,貝伐單抗組毛細(xì)血管數(shù)量是7.25±1.23;對(duì)照組是8.52±0.79,貝伐單抗組毛細(xì)血管數(shù)量明顯低于對(duì)照組(P=0.006,見圖3)。

A. 對(duì)照組 B. 貝伐單抗組圖3 兔耳增生瘢痕毛細(xì)血管分布 (免疫組化染色,×40)Figure 3 Capillary distribution of rabbit ear hypertrophic scars in two groups (HE,×40)

3 討論

增生性瘢痕形成與多種因素相關(guān),采用多種治療方法才能達(dá)到理想的效果。目前,常用治療方法存在全身不良反應(yīng)、治療周期長(zhǎng)及復(fù)發(fā)等缺點(diǎn),迫切需要新的治療方法。

糖尿病視網(wǎng)膜病變是由新生血管形成過(guò)多引起的視網(wǎng)膜纖維化,貝伐單抗可抑制血管生成,因而可用于治療糖尿病視網(wǎng)膜病。由于瘢痕形成實(shí)質(zhì)上是纖維化過(guò)程,所以貝伐單抗也可用于抑制瘢痕的形成。瘢痕形成是傷口愈合階段的正常過(guò)程,但增生性瘢痕和瘢痕疙瘩是創(chuàng)傷愈合后形成的病理狀態(tài)。

有研究表明,抗VEGF類藥物可減少瘢痕形成[11]。本研究主要觀察抗VEGF類藥物貝伐單抗對(duì)增生性瘢痕,而不是正常瘢痕形成的影響。在以往白兔模型中,貝伐單抗的使用劑量在1.25-3.75 mg之間。兔模型結(jié)膜下注射3.75 mg貝伐單抗可有效抑制血管生成,且不影響角膜上皮化或創(chuàng)面愈合[12]。盡管目前尚無(wú)皮膚和眼內(nèi)組織耐受性差異的研究,但由于皮膚作為正常的屏障,其對(duì)貝伐單抗的耐受應(yīng)高于眼內(nèi)組織。因此,本研究中貝伐單抗劑量高于以往常規(guī)用量。以往研究已經(jīng)證實(shí),正常瘢痕和增生性瘢痕血管數(shù)量存在差異[3]。增生性瘢痕中VEGF水平明顯增高,導(dǎo)致血管生成過(guò)度[4]。

血管生成對(duì)于傷口愈合至關(guān)重要。在本研究中,兔耳模型第10天提取增生瘢痕組織,結(jié)果表明,貝伐單抗局部注射能有效降低瘢痕組織中VEGF水平;兔耳模型第40天提取增生瘢痕組織,結(jié)果表明,貝伐單抗注射能減少瘢痕組織中毛細(xì)血管數(shù)量。貝伐單抗可能通過(guò)降低瘢痕組織中VEGF水平,導(dǎo)致血管生成減少,從而阻止增生性瘢痕形成。

增生性瘢痕主要是影響美觀,特別是血流增強(qiáng)引起的紅斑。在一項(xiàng)研究中,抗VEGF治療可使增生性瘢痕微循環(huán)灌注減少,與其他瘢痕治療方法相比,抗VEGF治療效果可能更明顯[13]。正常瘢痕與增生性瘢痕最明顯的區(qū)別在于表皮厚度。在本研究中,貝伐單抗治療的瘢痕組織SEI較低,表明貝伐單抗治療可減少瘢痕厚度。在多種纖維化疾病中,VEGF水平增高[14,15]。本研究結(jié)果表明,貝伐單抗組膠原纖維呈規(guī)則和疏松分布,而對(duì)照組膠原纖維呈雜亂和致密分布,此結(jié)果提示,貝伐單抗治療也可影響纖維化形成。

總之,本研究結(jié)果表明,在兔耳損傷模型局部注射貝伐單抗可有效抑制血管過(guò)度生成,從而阻止增生性瘢痕形成。應(yīng)對(duì)貝伐單抗的作用機(jī)制及不良反應(yīng)進(jìn)行研究。