CaSR在腎結(jié)石形成中表達(dá)的動(dòng)態(tài)研究*

申茂磊，王勤章，鄭麗英，錢 成，徐 浩，錢 彪△

1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科(石河子832000)，2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院院內(nèi)感染控制辦公室(石河子832000)，3.解放軍69235部隊(duì)(奎屯833200)

主題詞 腎結(jié)石 受體， 鈣敏感 乙二醇 因果律

腎結(jié)石是腎盞中的礦物質(zhì)沉積物，常沉積于腎乳頭，是泌尿科的常見病[1-2]，且結(jié)石的形成原因難以明確，因此，研究結(jié)石形成機(jī)制是治療腎結(jié)石的重要突破點(diǎn)。草酸鈣是大多數(shù)結(jié)石的主要成分，高鈣尿癥，高草酸尿是主要的危險(xiǎn)因素[3]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究顯示，鈣敏感受體(Calcium-sensing receptor，CaSR)可抑制腎小管對(duì)鈣離子的重吸收，從而導(dǎo)致高鈣尿，影響結(jié)石的形成[4-5]。推測(cè)CaSR表達(dá)異?？赡芘c腎結(jié)石形成有關(guān)，本課題組通過胃內(nèi)灌注乙二醇和氯化銨誘石劑，連續(xù)10周動(dòng)態(tài)檢測(cè)Wistar雄性大鼠腎臟CaSR的表達(dá)情況，初步探討CaSR在乙二醇形成結(jié)石中的作用。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料 本研究中使用的所有雄性Wistar大鼠都是購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，6周齡左右，共60只，大鼠可自由獲取飲用水。所有大鼠在光照條件下(12 h光照和黑暗周期)，溫度、濕度適宜的條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分成正常對(duì)照組(30只)和乙二醇組(30只)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物模型的建立：60只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(2 ml生理鹽水灌胃2周)、乙二醇組(大鼠1%乙二醇飲水和2%氯化銨AC 2 ml灌胃2周)每組30只。標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)，飲用自來水。

2.2 病理學(xué)檢查：水合氯醛麻醉處死實(shí)驗(yàn)大鼠，手術(shù)切取雙側(cè)腎，兩側(cè)腎臟各取一部分，用甲醛溶液固定并包埋于石蠟中，HE染色后通過普通光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)變化及腎小管區(qū)有無結(jié)石結(jié)晶，以判斷腎結(jié)石模型是否成功建立。按照安瑞華等[6]的判定腎臟結(jié)石標(biāo)準(zhǔn)的方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，0級(jí)被判為陰性，Ⅰ～Ⅳ級(jí)被判為陽性，若同一只大鼠的雙腎都是陽性時(shí)，則計(jì)為1次，觀察10周內(nèi)兩組大鼠的腎結(jié)晶情況。

2.3 Western blot檢測(cè)CaSR表達(dá)：取病理鑒定模型成功的另一部分腎臟用于做Western blot檢測(cè)。①將腎臟組織研磨，放入EP管中；②將蛋白裂解液移置1.5 ml EP管中，在4 ℃；③12 000 g條件下離心15 min，離心后緩慢吸取上清放液，移入到一個(gè)干凈的離心管中，置于-20℃冰箱中備用；④采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。制備分離膠和濃縮膠，將樣品和Loading Buffer混勻100 ℃煮樣約5 min，加樣20μl，恒壓80 V電泳跑膠；⑤結(jié)束后采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，用TBST進(jìn)行5 min洗膜，共完成兩次，然后封閉1 h；⑥加入稀釋后的一抗，在4 ℃環(huán)境中，于搖床上慢慢搖動(dòng)孵育過夜，TBST洗膜3次，每次5 min；⑦ECL發(fā)光試劑中顯色，然后進(jìn)行顯影和定影，利用Quantity one軟件分析實(shí)驗(yàn)圖片。

結(jié) 果

1 病理組織學(xué)檢查 1～2周兩組未發(fā)現(xiàn)晶體顆粒沉積，第3周以后乙二醇組Wistar雄性大鼠腎小管內(nèi)發(fā)現(xiàn)晶體顆粒沉積，且主要分布于近、遠(yuǎn)曲小管，晶體顆粒大多呈零星散在分布，少部分晶體互相連接成片狀分布。第1～10周，對(duì)照組Wistar雄性大鼠腎臟內(nèi)未見晶體顆粒沉積(圖1)。1～10周，乙二醇組Wistar雄性大鼠腎臟晶體顆粒陽性11只(59.1%)，因乙二醇組Wistar雄性大鼠在第3周開始成石，而前二周已處死的Wistar雄性大鼠也存在成石的可能，所以在計(jì)算成石率時(shí)將前兩周已處死的大鼠排除在大鼠總計(jì)數(shù)之外，對(duì)照組均為陰性，乙二醇組Wistar雄性大鼠腎臟晶體顆粒陽性率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1 。

A：第9周乙二醇組 B ：第9周對(duì)照組

表1 兩組Wistar雄性大鼠腎組織結(jié)晶分級(jí)[例(%)]

注：乙二醇組與對(duì)照組成石率相比，P<0.05

2 腎組織CaSR蛋白Western blot檢查結(jié)果 由條帶灰度值可發(fā)現(xiàn)CaSR在乙二醇組中持續(xù)表達(dá)，1～2周和對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是3～10周其灰度值逐漸增加且明顯高于對(duì)照組；1～10周，CaSR在對(duì)照組中雖然持續(xù)表達(dá)，但其灰度值卻未見明顯改變(圖2)。

A、C分別為第6、第9周對(duì)照組，B、D分別為第6、第9周乙二醇組；與第6周對(duì)照組相比，aP<0.05; 與第9周對(duì)照組相比，bP<0.05

討 論

泌尿系結(jié)石是泌尿外科住院病人中最常見的原因，其中腎結(jié)石是最常見的病因之一。腎結(jié)石發(fā)病率及流行率在世界范圍內(nèi)又增加的趨勢(shì)，有研究顯示可能與感染、激素、骨橋蛋白、性別、年齡、種族密切相關(guān)[7-12]，但其形成機(jī)制仍不明確，近年來眾多學(xué)者對(duì)CaSR的研究為我們研究腎結(jié)石的形成機(jī)制提供了新思路。

CaSR是在20余年前被發(fā)現(xiàn)的，能夠維持生理機(jī)體離子鈣濃度，其在腎臟中高表達(dá)，與尿鈣吸收、排泄密切相關(guān)，也在腎臟之外的臟器中表達(dá)如骨、甲狀腺等[13-14]。CaSR在腎臟排泄鈣離子的過程起著關(guān)鍵作用[15]。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乙二醇組造模期間有2只大鼠死亡，此結(jié)果可能于乙二醇及氯化銨的腎毒性有關(guān)。造模早期各組大鼠無特殊變化；造模3～8周時(shí)，正常對(duì)照組無特殊表現(xiàn)，乙二醇組出現(xiàn)煩躁，活動(dòng)增加。第8～10周乙二醇組出現(xiàn)精神疲倦，活動(dòng)度減少，食量減少；正常對(duì)照組無特殊表現(xiàn)，此表現(xiàn)可能與乙二醇及氯化銨造成腎臟損傷有關(guān)。腎臟病理切片發(fā)現(xiàn)，乙二醇組大鼠腎臟內(nèi)從第3周起可見鈣鹽結(jié)晶沉積， 主要分布于腎小管， 而1～10周正常對(duì)照組大鼠腎組織未見晶體， 乙二醇組結(jié)石分析成石率較正常對(duì)照組高。乙二醇組腎臟腎小管內(nèi)鈣鹽晶體沉積較多，伴有部分腎小管上皮細(xì)胞空泡樣變性及小管上皮腫脹，可見腎間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)或腎小管上皮脫落；正常對(duì)照組腎臟組織未見病理改變。此結(jié)果與傳統(tǒng)乙二醇+氯化銨造模機(jī)制[16]相符，但本實(shí)驗(yàn)的成石率卻較其低，因?yàn)楸狙芯棵恐芏继幩来笫?，在處死的未形成大鼠里面有形成結(jié)石的可能。Western blot結(jié)果顯示乙二醇組腎臟CaSR的表達(dá)和對(duì)照組無明顯差異，但是3～10周乙二醇組腎臟CaSR的表達(dá)量明顯比正常對(duì)照組多，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。升高的CaSR能夠抑制腎小管對(duì)鈣離子的重吸收，從而導(dǎo)致高鈣尿，影響結(jié)石的形成[4-5]。這表明CaSR表達(dá)增強(qiáng)可能在結(jié)石形成中起重要作用。與以往乙二醇建立腎結(jié)石模型觀察CaSR的表達(dá)相比較，本實(shí)驗(yàn)動(dòng)態(tài)觀察CaSR的表達(dá)，增加結(jié)果可信度。

綜上所述，Wistar雄性大鼠在乙二醇灌胃2周后，CaSR的表達(dá)量逐漸增加，其抑制腎小管對(duì)鈣離子的重吸收，增加尿鈣，促進(jìn)結(jié)石的形成。但CaSR是如何具體影響鈣離子排泄的，其具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。