圓齒野鴉椿朔果著色及呈色分析

袁雪艷，鄒小興，黃 維，張曉華，陳澤明，孫維紅，李艷蕾，陳路瑤，鄒雙全

（福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院自然生物資源保育利用福建省高校工程研究中心，福建 福州 350002）

圓齒野鴉椿Euscaphis konishii Hayata為省沽油科Staphyleaceae野鴉椿屬Euscaphis植物，是賞藥兩用的優(yōu)良鄉(xiāng)土樹(shù)種。傳統(tǒng)及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，圓齒野鴉椿果實(shí)有很好的抗癌及抗炎癥等作用，其根、花、干果均可入藥[1]。而且近年來(lái)，圓齒野鴉椿開(kāi)始用作觀賞植物[2-3]， 最突出的觀賞部位是果實(shí)，其掛果期長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月，滿樹(shù)的紅果橫跨秋冬季節(jié)，可為秋冬季節(jié)增添許多喜慶的色彩，被認(rèn)為是極具開(kāi)發(fā)潛力的秋冬季觀果樹(shù)種。目前，有關(guān)圓齒野鴉椿的相關(guān)研究?jī)H集中在繁殖技術(shù)[4]、化學(xué)成分研究[5]和藥理研究[6]等方面，而有關(guān)果實(shí)著色機(jī)制的研究未見(jiàn)報(bào)道。

在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中，果實(shí)的呈色與葉綠素（Chlorophyll）、類胡蘿卜素（Carotenoid）和類黃酮（Flavonoid）的種類和含量比例有關(guān)[7]。通常，果實(shí)在幼果時(shí)為綠色，成熟后則呈現(xiàn)多彩的顏色，這是因?yàn)殡S著果實(shí)的成熟，果實(shí)細(xì)胞中的葉綠素不斷降解，黃色、橙色果實(shí)中的類胡蘿卜素和紫色、紅色果實(shí)中的花青素（Anthocyanin）（屬于類黃酮物質(zhì)）的不斷積累的結(jié)果[8]。果色是影響經(jīng)濟(jì)果品經(jīng)濟(jì)價(jià)值的重要因素之一，在各類果樹(shù)中已引起廣泛關(guān)注，如獼猴桃[9]、柑橘[10]和荔枝[11]等，同時(shí)果色作為園林觀果樹(shù)種最重要的觀賞性狀之一，果實(shí)變色機(jī)理已在秋海棠[12]、南天竹[13]等觀果植物進(jìn)行過(guò)研究，但圓齒野鴉椿作為極具觀賞價(jià)值的觀果樹(shù)種，其朔果發(fā)育過(guò)程中果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育和色澤變化方面的變化機(jī)理未見(jiàn)報(bào)道?，F(xiàn)今，廣泛應(yīng)用的園林觀賞植物均具多元化的觀賞性，單一的葉色、花色、果色等已不能滿足人們的觀賞需求，于是利用分子手段人工調(diào)控觀賞性狀逐漸成為園林觀賞植物的研究趨勢(shì)。因此，本文研究圓齒野鴉椿朔果7個(gè)時(shí)期的色素和色澤變化，以探討其果實(shí)色素與呈色的變化規(guī)律，為深入研究圓齒野鴉椿果實(shí)顏色調(diào)控機(jī)制、選育圓齒野鴉椿新品種提供理論依據(jù)及技術(shù)支持，也為利用分子生物手段改良品種提供生理學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在福建清流靈地鎮(zhèn)選擇3株生長(zhǎng)基本一致且集中生長(zhǎng)的圓齒野鴉椿作為試驗(yàn)樣株，圓齒野鴉椿果實(shí)采樣于6月末—11月初進(jìn)行，共采集7個(gè)階段（盛花期后50、70、100、115、130、160、180 d）圓齒野鴉椿果實(shí),見(jiàn)圖1。將一部分圓齒野鴉椿的果皮和種子進(jìn)行分離，一部分用錫紙包住，凍存于干冰中，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后馬上用液氮速凍存放于-80 ℃冰箱備用。一部分用60 ℃鼓風(fēng)干燥箱烘干至恒質(zhì)量，并稱取干質(zhì)量，另外再摘取新鮮的果實(shí)存于裝有冰袋的冰盒中，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后馬上用相機(jī)拍攝整體果實(shí)外觀、內(nèi)果皮和外果皮。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 果實(shí)顏色數(shù)字化描述

在晴天光線充足的環(huán)境下用同一相機(jī)拍攝。相機(jī)機(jī)身為Nikon/尼康 D 810，鏡頭Nikon 7 mm F 2.8微距鏡頭。相機(jī)設(shè)置：光圈優(yōu)先，鏡頭光圈F8，白平衡設(shè)置為日光模式。背景紙選用白色A4紙。顏色數(shù)字化描述參照李欣等[14]的方法。打開(kāi)Photoshop 圖像處理軟件，選取CMYK 模式命令，添加試材圖像到選區(qū)，選取果實(shí)兩側(cè)的中間部位，從頂端到果梗的前端進(jìn)行切割，切割的果長(zhǎng)乘以黃金分割點(diǎn)0.618（從頂端開(kāi)始算起），得到待測(cè)區(qū)域，再用吸管吸取外果皮、內(nèi)果皮和種皮典型色域的顏色，得出C（青色）、M（洋紅色）、Y（黃色）、K（黑色） 的百分比值。

1.2.2 果實(shí)色素的初步分析

1.2.2.1 色素類型的定性分析

取不同發(fā)育時(shí)期的果實(shí)，經(jīng)液氮研磨后各取0.1 g于10 mL離心管中，分別加入石油醚、10%鹽酸溶液、30%氨水5 mL，觀察顏色變化并進(jìn)行記錄。

1.2.2.2 類黃酮的顯色反應(yīng)

測(cè)定方法參照智雅靜等[15]的方法，取不同烘干果皮粉末各0.1±0.005 g，分別用鹽酸（HCl）化甲醇（MeOH）溶液（HCl與MeOH體積比為1∶99） 提取15 h，過(guò)濾，定容至25 mL，各取2 mL提取液，進(jìn)行以下9種顯色反應(yīng)：濃鹽酸-鋅粉反應(yīng)；濃鹽酸-鎂粉反應(yīng)；三氯化鐵反應(yīng)；三氯化鋁反應(yīng)；氨性氯化鍶反應(yīng)；硼酸反應(yīng)；濃硫酸反應(yīng)；堿性試劑反應(yīng)；硼氫化鈉反應(yīng)。

1.2.3 果皮色素的定量分析

參照高俊鳳的方法[16]測(cè)定葉綠素和類胡蘿卜素的含量；采用熱浸提法測(cè)定圓齒野鴉椿果實(shí)的類黃酮含量，具體方法參照吳清韓等[17]的方法；采用超聲輔助的pH示差法測(cè)定圓齒野鴉椿果實(shí)的花青素，具體方法參照楊敏等[18]和吳春太等[19]的方法。

2 結(jié)果分析

2.1 果色的數(shù)據(jù)化描述

隨著果實(shí)的成熟，外果皮的C、M、Y、K值變化差異顯著，見(jiàn)圖1、圖2。由圖1、圖2可知，K值始終保持低值，在盛花期后50～70 d的C、M、Y值大小依次為：Y＞C＞M，在70 d之后則呈現(xiàn)Y≥M＞C，說(shuō)明在外果皮綠色期C、Y值對(duì)色彩的變化起決定作用，而外果皮從紅綠相間到全紅，是M、Y值起決定作用。

在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中，內(nèi)果皮的C、M、Y、K值的變化呈現(xiàn)出一定的規(guī)律，在7個(gè)發(fā)育階段中K值均接近0，而Y值基本處于高值。隨著果實(shí)的成熟，C值呈逐漸下降的趨勢(shì)，在盛花期后70 d就低于M值，而M值則逐漸升高，并在盛花期100 d超過(guò)Y值，之后均保持高值。即，在盛花期后50 d時(shí)，C、Y是內(nèi)果皮呈現(xiàn)嫩綠色的主要原因，在盛花期后70～180 d內(nèi)果皮由粉綠相間逐漸變成全紅，是由M、Y值起決定作用，見(jiàn)圖1、圖2。

圓齒野鴉椿種皮顏色的變化是觀測(cè)果實(shí)成熟的重要指標(biāo)。在盛花期50 d，其種皮為乳白色，C、M、K、Y均為最小值；盛花期后70 d，種皮為棕色，其K值接近0，C值略大于50 d，而M、Y值則呈現(xiàn)激增的現(xiàn)象，說(shuō)明種皮棕色與M、Y值關(guān)系密切；盛花期后100～115 d，屬于棕黑相間的時(shí)期，期間C、K值逐漸升高，Y值逐漸下降，而M值則先降后升；盛花期115～180 d，屬于C、K值先急劇增大后趨于平穩(wěn)，且C、M、Y、K值相互間逐漸接近，說(shuō)明C、K值對(duì)種皮顏色加黑有決定性作用，見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 圓齒野鴉椿果實(shí)顏色變化Fig. 1 The color change of Euscaphis konishii Hayata fruit

圖2 外果皮(ex)、內(nèi)果皮(en)和種皮(sc)顏色測(cè)定結(jié)果Fig. 2 The results of exocarp, endocarp and seed coat color

2.2 果實(shí)色素類型的特征顏色反應(yīng)

在石油醚反應(yīng)中，若提取液出現(xiàn)黃色，說(shuō)明果皮中可能含有類胡蘿卜素。本試驗(yàn)中，7個(gè)發(fā)育時(shí)期的圓齒野鴉椿果皮的石油醚顯色反應(yīng)都出現(xiàn)無(wú)色，說(shuō)明類胡蘿卜素含量極低或者不含類胡蘿卜素。

在10%的鹽酸測(cè)試中，若提取液呈現(xiàn)紅色，則說(shuō)明果皮中可能含有花青素。本試驗(yàn)中，提取液出現(xiàn)無(wú)色、粉色、紅色3類顏色。其中，盛花期后50～70 d為無(wú)色，說(shuō)明不含花青素或花青素含量極低；盛花期后100～115 d出現(xiàn)淡粉色和粉色，說(shuō)明花青素含量較低；盛花期后130～180 d表現(xiàn)為淡紅色和紅色，說(shuō)明花青素含量較高。

在30%氨水測(cè)試中，7個(gè)不同發(fā)育期的圓齒野鴉椿提取液表現(xiàn)出不同程度的黃色。盛花期50、130 d出現(xiàn)深黃色，表明果皮中可能含有黃酮醇類化合物；盛花期后70、100、115、160 d呈現(xiàn)黃色，表明果皮中可能含有黃酮色素。見(jiàn)表1。

表1 圓齒野鴉椿果皮色素類型測(cè)試的顏色反應(yīng)?Table 1 Color reaction of pigments of Euscaphis konishii Hayata

2.3 類黃酮的定性測(cè)試

（1）濃鹽酸-鋅粉反應(yīng)：由表2可知，盛花期后50～100 d出現(xiàn)不同程度的黃色，表明這3個(gè)時(shí)期的圓齒野鴉椿果皮可能含有黃酮，而盛花期后115～180 d呈現(xiàn)不同程度的粉色和紅色，表明可能含有黃酮、黃酮醇、二氫黃酮或花青素類化合物，說(shuō)明果實(shí)發(fā)育過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生新的黃酮類化合物。

（2）濃鹽酸-鎂粉反應(yīng)：盛花期后50～70 d出現(xiàn)綠色和黃色，而100～180 d出現(xiàn)不同程度的粉色和紅色，說(shuō)明在100 d之后可能合成了黃酮、黃酮醇、二氫黃酮或花青素類化合物。

（3）FeCl3反應(yīng)：由表2可知，不同發(fā)育時(shí)期的圓齒野鴉椿果實(shí)浸提液與FeCl3反應(yīng)均出現(xiàn)深褐色，說(shuō)明7個(gè)發(fā)育時(shí)期的果皮均不含酚羥基。

（4）AlCl3反應(yīng)：盛花期后50、70 d出現(xiàn)不同程度的黃色，說(shuō)明可能含有黃酮。

（5）氨性氯化鍶反應(yīng)：不同發(fā)育時(shí)期的果皮均出現(xiàn)沉淀，說(shuō)明含有鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物。

（6）硼酸反應(yīng)：不同發(fā)育期的果皮不同程度的綠色、粉色及紅色，說(shuō)明不含C5-OH結(jié)構(gòu)。

（7）濃硫酸反應(yīng)：不同發(fā)育時(shí)期的果皮浸提液均出現(xiàn)紅褐色，可能含有花青素。

（8）堿性試劑：盛花期后50、130 d出現(xiàn)顏色較深的黃褐色，相比之下，其余的5個(gè)發(fā)育時(shí)期則出現(xiàn)顏色較淺的黃色，說(shuō)明前者可能含有的二氫黃酮或二氫黃酮醇大于后者。

（9）硼氫化鈉反應(yīng)：盛花期后50～70 d出現(xiàn)綠色和黃色。100～180 d出現(xiàn)不同程度的粉色和紅色，說(shuō)明100 d之后可能產(chǎn)生了二氫黃酮。

表2 圓齒野鴉椿果皮類黃酮的顯色反應(yīng)Table 2 Color reaction of flavonoids in different Euscaphis konishii Hayata

2.4 果皮色素成分的紫外可見(jiàn)光譜分析

利用可見(jiàn)紫外分光光度計(jì)在400～700 nm范圍內(nèi)全波段掃描葉綠素和類胡蘿卜素提取液，葉綠素的特征吸收峰出現(xiàn)在665 nm附近，類胡蘿卜素大約在435、470 nm有吸收峰；類黃酮在500 nm左右出現(xiàn)峰值，且無(wú)雜峰干擾，在500 nm處，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)樣品的吸光值，并以吸光值為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程為：y＝4.917 2x＋0.005 1，R2＝0.999 1，表明蘆丁質(zhì)量濃度在0.013 8～0.082 8 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；花青素在520 nm左右出現(xiàn)峰值，且無(wú)雜峰干擾。

圖3 葉綠素、類胡蘿卜素、類黃酮和花青素光譜掃描圖Fig. 3 UV-Vis absorption spectrum of chlorophyl, carotenoid, flavonoid and anthocyanin

2.5 果皮色素含量分析

在圓齒野鴉椿果實(shí)發(fā)育過(guò)程中，葉綠素呈現(xiàn)先急劇下降到緩慢下降的趨勢(shì)。盛花期后50 d葉綠素含量最高，其含量高達(dá)0.303 mg·g-1，在盛花期30～115 d葉綠素含量急劇下降，之后下降趨勢(shì)減緩，并在180 d達(dá)到最小，見(jiàn)圖4A。

由圖4B可知，在不同的發(fā)育階段，圓齒野鴉椿類胡蘿卜素含量分布在0.016～0.050 mg·g-1之間，含量均較低，隨著果實(shí)的成熟，類胡蘿卜素基本呈現(xiàn)不斷下降的趨勢(shì)。類胡蘿卜素與葉綠素之間呈顯著正相關(guān)（R＝0.991）（表3），說(shuō)明在合成代謝過(guò)程中二者可能有良好的協(xié)同作用。

在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中，類黃酮含量出現(xiàn)先下降后上升再下降的S型變化趨勢(shì)，見(jiàn)圖4C。由圖4C可知，類黃酮最高出現(xiàn)在盛花期后50 d，含量高達(dá)28.378 mg·g-1，之后出現(xiàn)劇降，直到盛花期后100 d才又開(kāi)始逐漸上升，并在盛花期后130 d出現(xiàn)第二個(gè)峰值25.326 mg·g-1，之后開(kāi)始逐漸下降至盛花期180 d出現(xiàn)最低值20.975 mg·g-1。類黃酮與葉綠素和類胡蘿卜素均呈顯著正相關(guān)，而與花青素相關(guān)性不顯著，見(jiàn)表3。

圖4 果實(shí)主要色素的變化Fig. 4 The changes of fruit pigments

圖4D表明，隨著野鴉椿果實(shí)的不斷成熟，花青素的積累量不斷增加。其中，在盛花期后50～70 d，花青素含量緩慢增加，在盛花期后70～180 d，花青素含量處于激增狀態(tài)，并在180 d達(dá)到最高值3.880 mg·g-1。花青素與葉綠素和類胡蘿卜素均呈顯著負(fù)相關(guān)（表3），說(shuō)明果實(shí)呈色過(guò)程中，葉綠素和類胡蘿卜素含量逐漸減少，伴隨著花青素的增加。

2.6 果實(shí)色澤與色素含量的關(guān)系

在CMYK模式中，C、M值分別代表青色和洋紅，測(cè)得圓齒野鴉椿果皮的葉綠素和類胡蘿卜素含量與內(nèi)外果皮的C值呈顯著正相關(guān)，而與M值呈顯著負(fù)相關(guān)，說(shuō)明圓齒野鴉椿從綠色變?yōu)榧t色，可能與葉綠素和類胡蘿卜素的降解有關(guān)；類黃酮的含量很高，但卻與內(nèi)外果皮的CMYK值均無(wú)顯著相關(guān)，說(shuō)明圓齒野鴉椿果實(shí)發(fā)育過(guò)程中，類黃酮出現(xiàn)了較為復(fù)雜的變化，可能會(huì)有新黃酮類物質(zhì)產(chǎn)生同時(shí)伴隨某些黃酮類物質(zhì)消解；花青素的含量與內(nèi)外果皮的C值呈顯著負(fù)相關(guān)，而與外果皮的M值、內(nèi)果皮的M、Y值呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明果實(shí)由綠轉(zhuǎn)紅的過(guò)程中，可能與花青素的積累有關(guān)。

表3 果實(shí)色素間及色素與CMYK值間的關(guān)系?Table 3 The relationship between fruit pigments and CMYK value

3 討論與結(jié)論

為了減少外界環(huán)境和主觀因素的影響，近年來(lái)，數(shù)碼技術(shù)已經(jīng)開(kāi)始運(yùn)用在植物色彩的描述上，如利用數(shù)碼技術(shù)描述觀賞海棠的色彩[14]、測(cè)定板栗果實(shí)的褐變[20]、描述芒果花瓣和花藥的色彩[21]等。因此本試驗(yàn)利用數(shù)碼測(cè)色法觀測(cè)圓齒野鴉椿果實(shí)色澤的變化，結(jié)合實(shí)際內(nèi)外果皮的顏色的變化（綠色→紅＋綠→紅色），發(fā)現(xiàn)果皮的綠色與C、Y值關(guān)系密切，而果皮的紅色是由M、Y值起決定作用的。CMKY值與色素含量相關(guān)性分析也表明，果實(shí)發(fā)育過(guò)程中逐漸下降的葉綠素和類胡蘿卜素含量，與果皮的C值均呈顯著正相關(guān)，與M值呈顯著負(fù)相關(guān)，而果實(shí)發(fā)育過(guò)程中逐漸升高的花青素的含量與果皮的C值呈顯著負(fù)相關(guān)，而與果皮的M值顯著正相關(guān)，說(shuō)明果實(shí)由綠轉(zhuǎn)紅的過(guò)程中，可能與葉綠素和類胡蘿卜素的降解，并伴隨著花青素的積累有關(guān)。

相關(guān)的研究表明，果實(shí)中含有葉綠素、類胡蘿卜素和類黃酮（花青素為類黃酮物質(zhì)）等多種色素，在果實(shí)發(fā)育的過(guò)程中，因各部分色素不斷代謝使果實(shí)的顏色發(fā)生變化。本研究表明，圓齒野鴉椿果實(shí)逐漸成熟的過(guò)程中，果皮呈現(xiàn)綠色→紅＋綠→紅色的色彩變化。隨著圓齒野鴉椿果實(shí)的成熟，各色素的變化呈現(xiàn)一定的規(guī)律，其中葉綠素和類胡蘿卜素的含量均呈逐漸下降的趨勢(shì)，且兩者呈顯著正相關(guān)，可能在合成代謝過(guò)程中二者有良好的協(xié)同作用，類胡蘿卜素對(duì)葉綠素分子有保護(hù)作用，具體作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究；花青素則出現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，與其它色素含量呈負(fù)相關(guān)，其中與類胡蘿卜素、葉綠素負(fù)相關(guān)顯著，結(jié)果與李果[22]、山楂[23]等的研究結(jié)果一致，說(shuō)明果實(shí)呈色過(guò)程中，葉綠素和類胡蘿卜的含量逐漸減少，伴隨著花青素的增加，花青素的積累與果實(shí)逐漸變紅可能有密切的聯(lián)系；類黃酮含量出現(xiàn)先下降后上升再下降的S型變化趨勢(shì)，分別在盛花期后50和130 d出現(xiàn)峰值，說(shuō)明果實(shí)發(fā)育過(guò)程中可能會(huì)產(chǎn)生新的黃酮類化合物，并伴隨著某些類黃酮物質(zhì)的消解，這在黃酮類物質(zhì)顯色反應(yīng)中得到相互印證，類黃酮的變化與花青素的變化沒(méi)有顯著相關(guān)性，這與蘋(píng)果[24]色素的研究結(jié)果一致，可能是隨著果實(shí)的成熟，果實(shí)中花青素含量不斷升高，光合產(chǎn)物流向花青素的合成途徑，減緩了酚類物質(zhì)的合成，從而使果實(shí)中類黃酮含量較穩(wěn)定。

綜上所述，本試驗(yàn)利用傳統(tǒng)的方法對(duì)圓齒野鴉椿果皮色素的組成及含量進(jìn)行了初步定性、定量分析，但要對(duì)色素進(jìn)行精確的定性及定量分析還需要利用更精準(zhǔn)的現(xiàn)代技術(shù)，如利用HPLC和LC-MS等，而且本試驗(yàn)的試驗(yàn)材料采自清流，還需采集多個(gè)地方的圓齒野鴉椿果實(shí)觀測(cè)其呈色變化，以便對(duì)圓齒野鴉椿果實(shí)顏色著色機(jī)制有更全面和精確的了解。