基于雙重PCR技術(shù)的鹿茸及其偽品DNA指紋特征和鑒定

高麗君，何程遠(yuǎn)，李盈諾，巴宏宇，李梓僮，夏 薇，李明成，苑廣信，張麗華，艾金霞

(1.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院臨床血液與體液檢驗(yàn)教研室，吉林 吉林 132013；2. 北華大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室，吉林 吉林 132013；3.吉林雷寧食品藥品檢測技術(shù)服務(wù)有限公司，吉林 吉林 132013)

鹿茸是我國名貴中藥，《本草綱目》中記載：鹿茸具有生精補(bǔ)髓、養(yǎng)血益陽和強(qiáng)健筋骨等功效。我國2015年版《中華人民共和國藥典》中指出：鹿茸為鹿科動物梅花鹿(Cervus Nippon Temminck)或馬鹿(Cervus elaphus Linnaeus)的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，前者習(xí)稱“花鹿茸”，后者習(xí)稱“馬鹿茸”[1]。目前，鹿茸藥材品種繁多、成分復(fù)雜，市場上易混品和偽品較多，再加之我國中藥現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中檢驗(yàn)方法的局限性，很難對同屬的鹿茸真?zhèn)巫龀鰷?zhǔn)確判斷。目前，國內(nèi)外多采用紅外線、紫外線、化學(xué)和液相色譜等方法鑒別中藥，這些方法雖為鹿茸藥材的鑒定提供了一定的參考依據(jù)，但均存在一定的不足，例如對同科、同屬、不同種的易混藥材鑒別的專屬性差，尤其對化學(xué)結(jié)構(gòu)相似物質(zhì)鑒別的特異性不強(qiáng)，而且操作繁瑣、費(fèi)用高，很難滿足對中藥材、尤其對中藥易混品種的鑒定[2]。

分子遺傳學(xué)標(biāo)記技術(shù)為中藥及其偽品的鑒別提供了一條新的途徑[3]。線粒體DNA(mitochrondrial DNA，mtDNA)作為遺傳信息的載體，是研究動物起源進(jìn)化及對群體進(jìn)行遺傳分析的理想對象。鹿科動物mtDNA呈共價(jià)閉合環(huán)狀，是細(xì)胞核外具有自主復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯能力的遺傳物質(zhì)，與核DNA比較，因其具有分子結(jié)構(gòu)簡單、堿基突變率高、不同區(qū)域進(jìn)化速度存在差異等特點(diǎn)，使mtDNA成為一種有效的遺傳標(biāo)志[4]。線粒體細(xì)胞色素b(cytochromeb,Cytb)基因進(jìn)化速度適中，是分析種內(nèi)及種間遺傳多樣性和進(jìn)化關(guān)系的適當(dāng)?shù)腄NA片段，可應(yīng)用于生物的分類、系統(tǒng)發(fā)育和遺傳多樣性的研究[5-6]。細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ(cytochrome C oxidase subunit 1，COⅠ)是線粒體中約650 bp的一段序列，其基因進(jìn)化速度比Cytb基因更快，因此可以用來區(qū)分進(jìn)化非常緊密的物種[7-8]。

4.作文課堂單調(diào)少趣，作文評價(jià)輕描淡寫。豐富多彩的作文課堂不僅能調(diào)動學(xué)生寫作興趣，還能有效提升學(xué)生寫作能力。當(dāng)前我校作文課堂模式較為單一，先理論后寫作，作文教學(xué)方法如何創(chuàng)新化、多樣化、輕松化是急需思考的。作文評價(jià)是作文教學(xué)的重要環(huán)節(jié)，是師生雙向交流的主要形式。有的老師輕視作文評價(jià)，輕描淡寫，寥寥數(shù)語。忽視了應(yīng)帶著學(xué)生去發(fā)現(xiàn)問題、總結(jié)問題、反思問題，以致作文批改“徒勞無功”。從調(diào)查中可以發(fā)現(xiàn)，絕大部分同學(xué)希望能親身參與到作文評價(jià)中，因此我們教學(xué)應(yīng)多創(chuàng)造學(xué)生自評，學(xué)生互評，師生互動的環(huán)節(jié)，讓學(xué)生在實(shí)踐中思考，參與中提高。

本課題組建立了基于鹿科動物mtDNA的Cytb和COⅠ具有特異性鑒別意義的基因序列[9-10]。在此基礎(chǔ)上，利用Cytb及COⅠ的特性，設(shè)計(jì)了用于鑒定鹿茸的雙重特異性引物，即在同一PCR反應(yīng)體系中同時(shí)檢測梅花鹿、馬鹿、新西蘭鹿和馴鹿鹿茸，達(dá)到快速、準(zhǔn)確鑒定鹿茸真?zhèn)蔚哪康?，以期為中藥真?zhèn)蔚蔫b別提供又一新的方法。

當(dāng)前，中國石油油氣管網(wǎng)管理體制實(shí)行“1+5+5”運(yùn)行模式，即1個北京油氣調(diào)控中心、5家區(qū)域管道公司、5家區(qū)域天然氣銷售公司。

1 材料與方法

1.5 市售鹿茸樣品的檢測按照1.2中的方法提取鹿茸DNA，采用優(yōu)化的雙重PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件對市售鹿茸進(jìn)行鑒定。

1.2 鹿茸樣品基因組DNA的提取采用堿變性方法提取基因組DNA[11]：①取鹿茸樣品剪碎至1 mm×1 mm×1 mm左右，稱取0.1 g樣品加入0.01 mmol·L-1Tris-HCl 500 μL、10%SDS 30 μL和20 g·L-1PK15 μL，混勻后置于56℃水浴振蕩16～18 h；②取出，加入飽和NaAC 500 μL，輕輕振蕩10 min，4℃、11 000 r·min-1離心10 min，取上清液加入等體積的異丙醇，-20℃放置1 h；③ 4℃、11 000 r·min-1離心10 min，棄上清液，向沉淀中加入70%乙醇500 μL 充分沖洗，4℃、11 000 r·min-1離心10 min，留沉淀室溫干燥(必要時(shí)可洗滌2次)；④加入80 μL雙蒸水溶解DNA，即為鹿茸基因組DNA。將所獲得的基因組DNA樣本經(jīng)適當(dāng)稀釋，采用紫外分光光度儀測定吸光度(A)值，計(jì)算A(260)/A(280)比值。采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察和分析結(jié)果。

DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)在中藥材鑒定中被廣泛使用，該標(biāo)記技術(shù)具有多態(tài)性強(qiáng)和準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)。利用DNA分子標(biāo)記技術(shù)對鹿茸進(jìn)行鑒別，直接從遺傳物質(zhì)DNA 的核苷酸序列上檢測遺傳變異，可準(zhǔn)確鑒別鹿茸的真?zhèn)巍?/p>

1.4 PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化①PCR反應(yīng)中特異引物的確定：分別應(yīng)用Cytb及COⅠ單一引物逐一實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)條件及程序同1.3中所述。②PCR反應(yīng)中最適解鏈溫度的確定：分別設(shè)置單獨(dú)PCR擴(kuò)增Cytb 1及COⅠ1的最適解鏈溫度分別為50℃和56℃；雙重PCR擴(kuò)增解鏈溫度分別為57.5℃、58℃、58.5℃、59℃、60℃和61℃,其他條件不變。

1.1 材料、主要試劑和儀器本實(shí)驗(yàn)所用的鹿茸共11個批次。梅花鹿茸(吉林)由中國食品藥品檢定研究院提供，馬鹿茸和馴鹿茸由吉林省雙陽鹿養(yǎng)殖基地提供，新西蘭鹿茸和梅花鹿茸(安徽)購自吉林省吉林市匯豐參茸行，市售鹿茸樣品P1、P2、P3、P4、P5和P6購自吉林省吉林市參茸市場。樣品真?zhèn)斡杉质〖质惺称匪幤窓z驗(yàn)所鑒定。DNA混合酶購于北京天根生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號：Lot#Q5328；瓊脂糖購于北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司。GeneAmp R PCR System2700 Applied Biosystem(美國Perkin-Elmer公司)，UV WHITE2020D凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-rad公司)。

2 結(jié) 果

2.3 PCR反應(yīng)中特異性引物的選擇 分別應(yīng)用Cytb和COⅠ單一引物進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：應(yīng)用單一引物無法鑒定鹿茸正品和偽品。將Cytb 1、Cytb 2和COⅠ1、COⅠ2、COⅠ3分別進(jìn)行不同的組合，即將Cytb和COⅠ以不同的組合形式同時(shí)加入PCR反應(yīng)體系，最后確定Cytb 1和COⅠ1引物組合后特異性強(qiáng)，能區(qū)分鹿茸正品及偽品(圖2)。

M：546 bp DNA marker；Lane 1：Cervus Nippon Temminck antler(Jilin)；Lane 2：Cervus elaphus Linnaeus antler； Lane 3：Rangifer tarandus antler；Lane 4：Cervus Nippon Temminck antler(Anhui)；Lane 5：New Zealand pilose antler.

圖1 鹿茸樣品DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

Fig.1 Electrophoregram of agarose gel of genomic DNA extracted from velvet antlers

2.4 PCR反應(yīng)中最適解鏈溫度的選擇 解鏈溫度是影響PCR擴(kuò)增的一個重要因素，對于雙重PCR尤其如此。由于單獨(dú)進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，Cytb 1及COⅠ1的最適解鏈溫度分別為50℃和56℃，因此解鏈溫度分別為57.5℃、58℃、58.5℃、59℃、60℃和61℃， 其他條件不變，檢測雙重PCR擴(kuò)增效果。當(dāng)解鏈溫度在57.5℃～61.0℃時(shí)，均可實(shí)現(xiàn)2種目的基因的雙重PCR，但以58℃時(shí)效果最好。故確定雙重PCR的最適解鏈溫度為58℃(圖3)。

鹿茸作為貴重藥材，產(chǎn)源不足但需求量增加，使得不同渠道來源的偽品、混淆品和代用品在國內(nèi)的藥源市場屢見不鮮。偽品鹿茸的價(jià)格昂貴卻完全失去藥用效果，不僅延誤患者的救治，而且降低人們對中藥的信任，嚴(yán)重影響我國傳統(tǒng)藥學(xué)的發(fā)展，更制約著中國傳統(tǒng)醫(yī)藥的規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化和國際化。該情況在其他名貴中草藥中也常見，如龜甲、川貝母和貂心等[12-16]。為在世界范圍內(nèi)弘揚(yáng)我國傳統(tǒng)的中醫(yī)中藥學(xué)，急需建立一套準(zhǔn)確、有效和標(biāo)準(zhǔn)的鹿茸真?zhèn)蔚蔫b定方法，確保藥材質(zhì)量，保障臨床用藥的安全性和準(zhǔn)確性。

表2 5種鹿茸的純度和濃度檢測結(jié)果

2.1 鹿茸樣品基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳特征 采用堿變性法從所有鹿茸及其偽品中提取DNA，梅花鹿茸(吉林、安徽)、馬鹿茸、馴鹿茸和新西蘭鹿茸經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳均可見1條片段長度約為23 000 bp的單一條帶(圖1)。

M：100 bp DNA marker；Lane 1：Negative control；Lane 2：Cervus Nippon Temminck antler(Jilin)；Lane 3：Cervus elaphus Linnaeus antler；Lane 4：Rangifer tarandus antler；Lane 5：Cervus Nippon Temminck antler(Anhui)；Lane 6：New Zealand pilose antler.

圖2 特異性引物瓊脂糖凝膠電泳圖

Fig.2 Electrophoregram of agarose gel of specific primers

2.2 鹿茸樣品基因組DNA的紫外光譜分析 采用堿變性法提取鹿茸基因組DNA，測得樣本A(260)/A(280)值為1.80±0.02(表2)，說明此樣本無RNA和蛋白質(zhì)污染。

Lane 1-8：57.5℃；Lane 9-16：58.0℃;M：100 bp DNA marker；Lane 1，9：Cervus Nippon Temminck antler(Jilin)；Lane 2，10：Cervus elaphus Linnaeus antler；Lane 3，11：Rangifer tarandus antler；Lane 4，12：Cervus Nippon Temminck antler(Anhui)；Lane 5，13：New Zealand pilose antler；Lane 6，14：Counterfeits of velvet antler；Lane 7，15： Genuine velvet antler；Lane 8，16：Negative control.

圖3 選擇最適解鏈溫度的瓊脂糖凝膠電泳圖

Fig.3 Electrophoregram of agarose gel of determination of optimum annealing temperature

2.5 確定最優(yōu)PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件取待檢樣品DNA溶液0.5 μL、引物(Cytb 1及COⅠ1)各1 μL，分別置于25 μL PCR反應(yīng)體系中，混勻。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃、30 s，58℃、30 s，72℃、 30 s，循環(huán)反應(yīng)30次；72℃延伸10 min。

2.6 市售樣品的檢測結(jié)果采用確定的鹿茸DNA的提取方法及最優(yōu)的PCR反應(yīng)條件，對市售樣品(P1、P2、P3、P4和P5)進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果與實(shí)際情況完全一致(圖4)。進(jìn)一步證明本研究建立的雙重PCR技術(shù)快速鑒定鹿茸及其偽品的方法可行。

M：100 bp DNA marker；Lane 1：Cervus Nippon Temminck antler(Jilin)；Lane 2：Cervus elaphus Linnaeus antler； Lane 3：Rangifer tarandus antler；Lane 4：Cervus Nippon Temminck antler(Anhui)；Lane 5：New Zealand pilose antler；Lane 6-11：Sold velvet antler；Lane 12：Negative control.

圖4 正品和市售鹿茸樣品的瓊脂糖凝膠電泳圖

Fig.4 Electrophoregram of agarose gel of genuine and sold velvet antlers

3 討 論

由于社會環(huán)境的影響和不同學(xué)生價(jià)值觀取向不同，也直接決定其個人行為方式的差異。近年來，隨著社會主義改革事業(yè)的蓬勃發(fā)展，社會生產(chǎn)方式及社會利益結(jié)構(gòu)也發(fā)生了巨大變化。此外，再加上當(dāng)代大學(xué)生價(jià)值觀取向的日漸實(shí)用化及價(jià)值評判標(biāo)準(zhǔn)的日漸多元化，使得當(dāng)代大學(xué)生的擇業(yè)觀念也逐漸呈現(xiàn)出一系列全新特點(diǎn)。

創(chuàng)新建設(shè)市場管理模式。確定了5家工程建設(shè)領(lǐng)域守信激勵和失信懲戒制度建設(shè)試點(diǎn)單位。委屬72家市場主體在全國水利建設(shè)市場信用信息平臺建立了信用檔案。完成了黃河水利工程建設(shè)項(xiàng)目招標(biāo)進(jìn)入公共資源交易市場的工作。

1.3 PCR擴(kuò)增①引物設(shè)計(jì)：查找GenBank中鹿茸線粒體Cytb及COⅠ的已知序列，采用Premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，采用Oligo 6.0引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行驗(yàn)證。針對Cytb設(shè)計(jì)了2對引物(Cytb1和Cytb2)，COⅠ設(shè)計(jì)了3對引物(COⅠ1、COⅠ2和COⅠ3)。堿基序列及擴(kuò)增的片段長度見表1。②PCR反應(yīng)體系：以提取的鹿茸基因組DNA為模板，滅菌雙蒸水作為陰性對照進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系25 μL，在150 μL PCR反應(yīng)管中依次加入DNA混合酶12.5 μL，Cytb或COⅠ上、下游引物各1 μL，模板0.5 μL，雙蒸水10 μL。③反應(yīng)程序：單一PCR：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，退火溫度30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)后于72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，90 V、40 min，100～600 bp DNA Marker作參照，凝膠成像分析系統(tǒng)觀察和分析結(jié)果。④雙重PCR擴(kuò)增：在反應(yīng)體系中加入Cytb及COⅠ2對引物，上、下游引物各1 μL，雙蒸水8 μL，其余條件同單一PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件。檢測方法與單一PCR擴(kuò)增的檢測方法相同。

動物線粒體在細(xì)胞中有較多的拷貝數(shù)，無論哪個生長期、哪種形態(tài)線粒體均能較好地保存下來，而且每個部位的DNA序列均完全一致，這種高保真性結(jié)構(gòu)有利于物種種內(nèi)、種間和進(jìn)化的研究[17]。Cytb位于線粒體內(nèi)膜脂質(zhì)雙分子層中，是線粒體本身編碼的少數(shù)功能蛋白之一，進(jìn)化速度合理，目前主要被用于動物的種類鑒別[18]。COⅠ比Cytb基因進(jìn)化迅速，適合鑒別關(guān)系緊密的物種，尤其可鑒別動、植物亞種[19]。

事實(shí)上，學(xué)到小數(shù)的時(shí)候，學(xué)生已經(jīng)掌握了數(shù)位的概念，具有一定的抽象思維能力.繼續(xù)使用這種圖示法純屬畫蛇添足，增加學(xué)生負(fù)擔(dān)，更是一種倒退.

本研究利用COⅠ和Cytb分別設(shè)計(jì)引物，采用雙重PCR技術(shù)進(jìn)行真?zhèn)温谷椎蔫b別。雙重PCR是Chamberian等在1988年提出的，指在同一反應(yīng)體系中同時(shí)加入2對引物，使2個PCR同時(shí)完成。雙重PCR可同時(shí)擴(kuò)增2個目的基因，具有特異性強(qiáng)、效率高和成本低的優(yōu)勢，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用[20]。雙重PCR在同一體系中特異性地?cái)U(kuò)增2個位點(diǎn)，其技術(shù)難度大，需要反復(fù)實(shí)驗(yàn)、全面分析，才能確定特異的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件等[21]。

本研究采用堿變性方法提取鹿茸及其偽品的基因組DNA，用引物設(shè)計(jì)軟件分別設(shè)計(jì)出針對鹿茸的Cytb和COⅠ的特異性引物，并進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增。經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)，確定了特異的PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系。本研究結(jié)果顯示：如果在395和525 bp處同時(shí)出現(xiàn)特異性條帶即為鹿茸正品，反之為偽品，正品與偽品有明顯差別。因此，本研究實(shí)現(xiàn)了從分子水平鑒定鹿茸的真?zhèn)?，該方法簡單、快速，結(jié)果可靠，易于推廣應(yīng)用。

歧義詞雖難，但是基本可以窮舉歧義詞的所有含義，使得正確分詞具有一定的概率，更為麻煩的是未登錄詞，如專業(yè)詞匯、人名、地名、機(jī)構(gòu)名、新造詞，等等。在Bakeoff2003 數(shù)據(jù)上的評估結(jié)果表明，未登錄詞造成的分詞精度失落至少比分詞歧義大5 倍以上[1]。

本研究利用已確定的方法檢驗(yàn)市售鹿茸，檢驗(yàn)結(jié)果與吉林省吉林市食品藥品檢驗(yàn)所的結(jié)果完全一致，進(jìn)一步證明本研究確定的檢驗(yàn)方法可從分子水平鑒別鹿茸的真?zhèn)巍?/p>