ELK-3蛋白在肝癌組織中的表達(dá)及其對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

李天柱，王加茹，張俊毅，王洪權(quán)，史鐵偉，周 靜，白春英，金成浩

(1. 赤峰學(xué)院醫(yī)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)研究中心，內(nèi)蒙古 赤峰 024000; 2. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，黑龍江 大慶 163319)

肝癌可分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩大類，是世界病死率較高的疾病之一，病死率居全球惡性腫瘤第3位，具有惡性程度高、易復(fù)發(fā)和易轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)[1-3]。肝癌的轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及大量基因異常表達(dá)以及相關(guān)信號(hào)通路的異常[4]。而上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中扮演重要的角色[5-6]。轉(zhuǎn)錄因子ELK-3(又稱Net)是Ras-MAPK信號(hào)通路下游靶點(diǎn)，在生理和病理過程中起重要作用，如傷口愈合、細(xì)胞遷移及新血管生成等[7-8]。研究[9]顯示：干擾ELK-3會(huì)導(dǎo)致p38基因表達(dá)水平降低，E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達(dá)水平升高，波形蛋白(vimentin)表達(dá)水平降低，進(jìn)而抑制人肝癌細(xì)胞的EMT過程。本文作者在前期研究[10]的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)：干擾ELK-3對(duì)人肝癌細(xì)胞的EMT過程具有抑制作用，但其是否通過調(diào)控EMT的作用對(duì)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響，目前尚未報(bào)道。本研究通過觀察肝癌組織中ELK-3蛋白表達(dá)與肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系，探討ELK-3在肝癌發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中的作用以及干擾ELK-3對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年3月—2016年5月在赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院手術(shù)切除的原發(fā)性肝癌患者腫瘤及癌旁(腫瘤外5 cm)新鮮術(shù)后組織18例，其中男性10例，女性8例，年齡42～75歲，平均年齡(52.4±9.3)歲。標(biāo)本取出后立即放置在-80℃冰箱中保存，以供Western blotting實(shí)驗(yàn)使用。所有患者術(shù)前均未接受放化療，并簽署知情同意書。石蠟組織標(biāo)本選自赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院病理庫(kù)：肝癌組織80例，其中男性60例，女性20例，年齡42～75歲，平均年齡(53.6±8.7)歲；癌旁正常組織49例，其中男性31例，女性18例，年齡42～75歲，平均年齡(51.8±9.5)歲。石蠟組織標(biāo)本供免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)使用。

1.2 細(xì)胞和主要試劑 人肝癌細(xì)胞系HepG2(中科院上海細(xì)胞庫(kù))。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)，LipofectamineTM2000(美國(guó)Invitrogen公司)，BCA-100蛋白質(zhì)定量試劑盒(上海申能博彩生物科技有限公司)，RIPA蛋白裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(北京康維世紀(jì)公司)，0.25%胰蛋白酶(杭州吉諾生物公司)，ELK-3 siRNA(美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司)，ELK-3(美國(guó)Abcam公司)，β-actin(美國(guó)Sigma公司)，TranswellTM遷移小室(美國(guó)Becton Dickinson Labware公司)

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 肝癌HepG2細(xì)胞，培養(yǎng)基為含10% FBS胎牛血清的DMEM，在飽和濕度、37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 免疫組織化學(xué)染色 切片經(jīng)二甲苯脫水，梯度乙醇復(fù)水，檸檬酸鈉緩沖液微波修復(fù)，3% H2O2阻斷后PBS沖洗3次，加入兔抗人ELK-3抗體(1∶500)，4℃孵育過夜。二抗37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。切片在200倍顯微鏡下取5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞在每個(gè)視野中所占的比例。ELK-3蛋白陽(yáng)性表達(dá)率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/癌細(xì)胞總數(shù)×100%，5個(gè)視野的陽(yáng)性表達(dá)率平均值為該張切片的陽(yáng)性表達(dá)率。表達(dá)率≥10%以上為陽(yáng)性，反之為陰性。

1.5 Western blotting法檢測(cè) 采用RIPA裂解緩沖液(強(qiáng))冰上裂解肝癌組織，BCA法測(cè)定蛋白濃度，每個(gè)樣品取30 μg上樣，10% SDS-PAGE，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%脫脂乳封閉1 h，與ELK-3抗體(稀釋比例1∶1 000)結(jié)合，4℃搖床孵育過夜。經(jīng)TBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗(稀釋比例1∶1 000)，37℃孵育1 h，TBST洗滌3次，加入ECL顯色，采用化學(xué)發(fā)光成像儀檢測(cè)目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，內(nèi)參采用β-actin。目的蛋白的表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.6 小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)設(shè)立對(duì)照組(control-siRNA)和ELK-3干擾組(ELK-3-siRNA)。轉(zhuǎn)染前，將HepG2細(xì)胞以2×105/孔接種于6孔板中，并將細(xì)胞培養(yǎng)基換成不含血清和抗生素的新鮮培養(yǎng)基，再按LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行操作。

1.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移能力 將成功轉(zhuǎn)染ELK-3的ELK-3-siRNA組和對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行重懸，分別接種于24孔板。細(xì)胞鋪滿單層后用小槍頭于孔中央劃1條線，在0和48 h對(duì)劃痕情況進(jìn)行觀察并照相，采用Image J測(cè)量2組細(xì)胞遷移距離(單位：μm)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 Transwell小室檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲能力 細(xì)胞重懸，上室加入100 μL各細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)，下室加入600 μL DMEM完全培養(yǎng)液。48 h后棄去上下室培養(yǎng)基，棉簽擦拭上室細(xì)胞。10%甲醛固定細(xì)胞30 s后，用蘇木精染色3 min，用鋒利刀片沿邊緣將小室膜切下，采用倒置顯微鏡(×200)和細(xì)胞計(jì)數(shù)器，對(duì)5個(gè)視野的穿膜細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，比較2組細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)(單位：個(gè))，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 不同臨床病理特征肝癌患者肝癌組織中ELK-3蛋白陽(yáng)性表達(dá)率 ELK-3蛋白主要表達(dá)于肝癌組織和癌旁正常組織的細(xì)胞質(zhì)中，呈褐色，且肝癌組織中ELK-3蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織(P<0.05)，見圖1(插頁(yè)二)和表1。ELK-3陽(yáng)性表達(dá)率與肝癌患者腫瘤數(shù)、TNM分期、Edmondson分級(jí)和門靜脈浸潤(rùn)有關(guān)聯(lián)(P<0.05)。見表2。

表1 肝癌組織和癌旁組織中ELK-3蛋白陽(yáng)性表達(dá)率

*P<0.05 compared with para-carcinima tissue.

表2 不同臨床病理特征肝癌患者肝癌組織中ELK-3蛋白陽(yáng)性表達(dá)率

Tab.2 Positive expression rates of ELK-3 in carcinoma tissue of HCC patients with different clinicopathologic features

ClinicopathologicfeaturenPositive expression of ELK-3 NumberRate (%)PAge (year) ≥50 <505228401676.957.10.875Sex Male Female6020411568.375.00.721Tumor size ≥5 cm <5cm4931352171.467.70.132Tumor number Solitary Multiple5129381874.562.10.036Edmondson Ⅰ+Ⅱ Ⅲ+Ⅳ2753223481.564.20.015TNM stage Ⅰ+Ⅰ Ⅲ+Ⅳ5624401671.466.70.023Venous infiltration Present Absent2258134359.174.10.019AFP ≥400 μg·L-1 <400 μg·L-14733332370.269.70.562HBsAg Negative Positive2456193779.266.10.473

2.2 肝癌患者不同組織中ELK-3蛋白表達(dá)水平 采用Western blotting法對(duì)肝癌組織和癌旁正常組織中的ELK-3蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，肝癌患者肝癌組織中ELK-3蛋白表達(dá)水平(91.2±4.5)明顯高于癌旁正常組織(48.7±2.4)(P<0.05)。見圖2。

Lane 1: Para-carcinoma tissue; Lane 2: HCC tissue.

Fig.2 Electrophoregram of expressions of ELK-3 protein in HCC tissue and para-carcinoma tissue detected by Western blotting method

2.3 各組HepG2細(xì)胞的遷移能力 細(xì)胞進(jìn)行劃痕處理48 h后，ELK-3-siRNA組細(xì)胞遷移距離為(40.0±5.6)μm，對(duì)照組細(xì)胞遷移距離為(210.0±5.6)μm。與對(duì)照組比較，ELK-3-siRNA組細(xì)胞遷移距離明顯縮短(P<0.05)。見圖3。

A,B: 0 h; C,D: 48 h; A,C: Control-siRNA group; B,D: ELK-3-siRNA group.

2.4 各組HepG2細(xì)胞的侵襲能力 細(xì)胞侵襲48 h后，ELK-3-siRNA組穿膜細(xì)胞數(shù)為(26±3)個(gè)，對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)為(58±5)個(gè)，ELK-3-siRNA組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯少于對(duì)照組(P<0.05)。見圖4(插頁(yè)二)。

3 討 論

系統(tǒng)研究肝癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制、尋找新的特異性肝癌分子標(biāo)志物可以為肝癌的診斷和治療提供新的思路和治療策略[11]。研究[12]表明：EMT現(xiàn)象普遍存在于肝癌發(fā)生發(fā)展過程中，并與肝癌的侵襲和遷移有密切關(guān)聯(lián)。腫瘤的轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的重要原因之一，通過抑制EMT過程可改變腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，發(fā)揮抗腫瘤作用[13-14]。

ELK-3、ELK-1和Sap-1形成三元復(fù)合物的轉(zhuǎn)錄因子家族(ternary complex transcription factor subfamily，TCF)，在靜止期細(xì)胞受到生長(zhǎng)因子的刺激時(shí)參與早期反應(yīng)[15]。本文作者前期研究[9]顯示：ELK-3蛋白在人肝癌細(xì)胞中的表達(dá)高于正常肝細(xì)胞，干擾ELK-3通過下調(diào)P38蛋白表達(dá)水平抑制人肝癌細(xì)胞的EMT。上述結(jié)果同樣出現(xiàn)在本實(shí)驗(yàn)中，ELK-3蛋白在肝癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，同樣具有抑制EMT的作用，且ELK-3表達(dá)與肝癌患者腫瘤數(shù)、TNM分期、Edmondson分級(jí)和門靜脈浸潤(rùn)有關(guān)聯(lián)。

EMT作為腫瘤遷移過程中的重要階段，尤其是在即將發(fā)生遷移現(xiàn)象的運(yùn)動(dòng)細(xì)胞的前緣出現(xiàn)頻率最高[16-17]。劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室實(shí)驗(yàn)[18-20]顯示：柴胡皂苷D可以通過改變EMT抑制人成骨肉瘤細(xì)胞MG-63的遷移和侵襲，miR-34a也可以通過EMT轉(zhuǎn)化調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞侵襲和遷移能力，同時(shí)ELK-3具有調(diào)節(jié)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和血管生成等生物學(xué)效應(yīng)。結(jié)合上述研究結(jié)果，本文作者推測(cè)：干擾ELK-3也可以減弱細(xì)胞的EMT作用，從而抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。本研究利用相同的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，ELK-3-siRNA組細(xì)胞的遷移距離變短，穿膜細(xì)胞數(shù)減少，侵襲能力降低，表明干擾ELK-3可以降低肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，從而抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

綜上所述，ELK-3蛋白表達(dá)與肝癌患者病理特征有密切關(guān)聯(lián)，在肝癌的發(fā)生發(fā)展和癌細(xì)胞的EMT過程中發(fā)揮重要作用，因此ELK-3可能成為新的肝癌分子標(biāo)志物及生物治療靶點(diǎn)。本研究結(jié)果為肝癌治療提供了新的理論依據(jù)。