重復(fù)經(jīng)顱直流電刺激對(duì)帕金森病模型大鼠抑郁行為的改善作用及其機(jī)制

王春雷，常永麗，韓玲娜

(1.長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系，山西 長(zhǎng)治 046000； 2.長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，山西 長(zhǎng)治 046000)

經(jīng)顱直流電刺激(transcranial direct current stimulation,tDCS)是一種非侵入性的、無創(chuàng)的腦刺激技術(shù)，利用微弱的直流電調(diào)節(jié)大腦皮層神經(jīng)元電活動(dòng)，從而影響大腦皮層的功能[1]。研究[2]顯示：tDCS可明顯改善抑郁癥患者的抑郁行為。單次tDCS的作用持續(xù)時(shí)間短，使用重復(fù)tDCS可以延長(zhǎng)作用持續(xù)時(shí)間[3-4]，在臨床應(yīng)用更為廣泛。帕金森病(Parkinson’s disease,PD)的臨床表現(xiàn)以運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)癥狀為主，同時(shí)伴有一系列精神障礙，抑郁是PD患者最常見的一種精神障礙[5]。已有研究[6-7]證明：重復(fù)tDCS對(duì)PD大鼠和患者的運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)癥狀有明顯的改善作用，但重復(fù)tDCS對(duì)PD相關(guān)抑郁行為是否具有改善作用以及其作用機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)采用重復(fù)陽極或陰極tDCS刺激PD大鼠額葉區(qū)，通過觀察PD大鼠抑郁行為的變化以及抑郁相關(guān)腦區(qū)單胺類遞質(zhì)水平的變化，探討重復(fù)tDCS對(duì)PD相關(guān)抑郁行為的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器 32只健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量230～280 g，由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(陜)2012-003。6-羥多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)、地昔帕明、阿撲嗎啡(apomorphine,APO)購自美國(guó)Sigma公司。腦立體定位儀購自深圳瑞沃德公司，經(jīng)顱直流電刺激儀由西安交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究所提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 大鼠在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。32只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、PD組、陽極重復(fù)tDCS組和陰極重復(fù)tDCS組，每組8只。

1.3 PD模型的制備 除假手術(shù)組外，其余各組大鼠采用右側(cè)內(nèi)側(cè)前腦束(medial forebrain bundle,MFB)局部注射6-OHDA制備單側(cè)完全損毀的PD大鼠模型。大鼠經(jīng)腹腔注射4%水合氯醛(400 mg·kg-1)麻醉后，固定于腦立體定位儀上。于術(shù)前30 min腹腔注射地昔帕明(25 mg·kg-1)以保護(hù)去甲腎上腺素(noradrenaline,NA)能神經(jīng)元。頭部正中切開，暴露顱骨，根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜確定右側(cè)MFB坐標(biāo)(AP：- 4.4 mm；L：1.2 mm；D：7.8～7.9 mm)，于MFB坐標(biāo)上方顱骨處鉆直徑 2 mm小孔，剝離硬腦膜，暴露腦表面。將尖端粘有玻璃微電極的10 μL微量進(jìn)樣器推進(jìn)至MFB位置，并以緩慢速度將4 μL含12 μg 6-OHDA的溶液注射至右側(cè)MFB。假手術(shù)組大鼠MFB位置局部注射等量的生理鹽水。

APO誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)行為實(shí)驗(yàn)用于模型檢測(cè)，于造模術(shù)后1周進(jìn)行。大鼠頸部皮下注射APO(0.05 mg·kg-1)，觀察15 min內(nèi)大鼠的行為，如果出現(xiàn)恒定向健側(cè)(左側(cè))旋轉(zhuǎn)，且大于25圈/ 5 min，則視為模型制備成功，其余均予以淘汰。本實(shí)驗(yàn)所用PD大鼠注射APO后，5 min內(nèi)旋轉(zhuǎn)均大于32圈。

1.4 tDCS 于造模術(shù)后2周進(jìn)行刺激電極固定。刺激電極采用直徑為2 mm的圓柱形塑料管，管內(nèi)填充導(dǎo)線和海綿，用牙科水泥將刺激電極固定于大鼠右側(cè)額葉區(qū)，參考電極固定于胸腹部。刺激時(shí)用生理鹽水將海綿浸濕保證電極的導(dǎo)電性[8]。為了保證不燒傷大鼠腦組織，采用80 μA直流電流作為刺激電流[9]。電極固定24 h后進(jìn)行直流電刺激實(shí)驗(yàn)。其中假手術(shù)組和PD組大鼠不給予電刺激。陽極重復(fù)tDCS組大鼠給予電流強(qiáng)度為80 μA陽極電流刺激，陰極重復(fù)tDCS組大鼠則給予相同強(qiáng)度的陰極電流刺激。各重復(fù)tDCS組大鼠給予重復(fù)tDCS，強(qiáng)度不變，每天刺激時(shí)間為30 min，連續(xù)刺激10 d。

1.5 行為學(xué)實(shí)驗(yàn) tDCS結(jié)束后進(jìn)行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和蔗糖偏好實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠的抑郁行為。①強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)：第1天進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，將大鼠放入水中游泳15 min，24 h后進(jìn)行檢測(cè)，記錄將大鼠放入水中 5 min內(nèi)的不動(dòng)時(shí)間。不動(dòng)時(shí)間定義為大鼠靜止漂浮于水面而不做任何動(dòng)作，或?yàn)榱吮３诸^部露出水面而僅作的微小活動(dòng)保持的時(shí)間。不動(dòng)時(shí)間可作為抑郁行為的檢測(cè)指標(biāo)[10]。②蔗糖偏好實(shí)驗(yàn)：將大鼠單籠飼養(yǎng)，雙瓶飲1%蔗糖溶液24 h，適應(yīng)后禁食禁水24 h，再同時(shí)給予水和1%蔗糖溶液各1瓶，自由飲水1 h，期間隨意交替2瓶位置數(shù)次。1 h 內(nèi)蔗糖消耗量可反映大鼠的抑郁行為表現(xiàn)，減少的蔗糖消耗量可作為抑郁行為的檢測(cè)指標(biāo)[11]。蔗糖消耗量=[糖水消耗量/(糖水消耗量+水消耗量)]×100%。

1.6 神經(jīng)化學(xué)檢測(cè) 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后，采用高效液相色譜-電化學(xué)法檢測(cè)各組大鼠腦內(nèi)抑郁相關(guān)腦區(qū)內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)(medial prefrontal cortex,mPFC)和中縫核(raphe nuclei,RN)中單胺類遞質(zhì)多巴胺(dopamine,DA)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)和NA水平。具體方法：大鼠斷頭取腦，迅速分離出mPFC和RN，稱質(zhì)量，按照每4 mg組織加入1 mL高氯酸(0.3 mol·L-1)的比例加入高氯酸，采用超聲粉碎儀將組織勻漿，4 ℃低溫離心后去上清液，按1∶2比例將上清液與流動(dòng)相混合，吸取20 μL混勻的樣本加入自動(dòng)進(jìn)樣器中，單胺類遞質(zhì)通過分析柱被分離后，經(jīng)電化學(xué)檢測(cè)器定量分析，計(jì)算組織中各種單胺類遞質(zhì)水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠抑郁行為 與假手術(shù)組比較，PD組大鼠的不動(dòng)時(shí)間明顯延長(zhǎng)(t=4.437,P<0.01)，蔗糖消耗量明顯減少(t=3.354,P<0.05)，提示PD模型大鼠有抑郁行為表現(xiàn)。與PD組大鼠比較，重復(fù)tDCS組大鼠的不動(dòng)時(shí)間明顯降低，其中陽極重復(fù)tDCS組(t= 4.572,P<0.01)較陰極重復(fù)tDCS組(t=3.585,P<0.05)降低更明顯；與PD組比較，陽極重復(fù)tDCS組大鼠的蔗糖消耗量明顯增加(t=3.095,P<0.05)，而陰極重復(fù)tDCS組大鼠的蔗糖消耗量雖然有增加趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠不動(dòng)時(shí)間和蔗糖消耗量

GroupImmobility time(t/s) Sucrose consumption(η/%)Sham operation41.38±3.52 76.18±6.29PD 78.63±9.33??55.10±3.96?Anodal repeated tDCS42.75±4.04△△ 74.55±4.01△Cathodal repeated tDCS51.75±5.35△ 64.23±2.76

*P<0.05，**P<0.01 compared with sham operation group;△P<0.05，△△P<0.01 compared with PD group.

2.2 各組大鼠mPFC和RN中單胺類遞質(zhì)水平 在mPFC中，與假手術(shù)組比較，PD組大鼠DA和5-HT水平明顯降低(DA：t=3.203,P<0.05；5-HT：t=4.492,P<0.01)，但NA水平無明顯變化(P>0.05)；與PD組比較，陽極重復(fù)tDCS組大鼠DA和5-HT水平均明顯升高(DA：t= 2.961,P<0.05; 5-HT：t=3.142,P<0.01)，陰極重復(fù)tDCS組大鼠僅5-HT水平明顯升高(t=2.843,P<0.05)，陽極重復(fù)tDCS組和陰極重復(fù)tDCS組大鼠mPFC中NA水平均無明顯變化(P>0.05)。在RN中，與假手術(shù)組比較，PD組大鼠5-HT水平明顯降低(t=3.318,P<0.01)，DA和NA水平雖有下降趨勢(shì)，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與PD組比較，陽極重復(fù)tDCS組大鼠DA和5-HT水平均明顯升高(DA:t=3.881,P<0.01; 5-HT:t=3.870,P<0.01)，NA水平無明顯變化(P>0.05)；陰極重復(fù)tDCS組大鼠DA和NA水平無明顯變化(P>0.05)，mPFC中5-HT水平明顯升高(P<0.05)。見表2。

3 討 論

PD是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床上以運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)癥狀為主，同時(shí)伴發(fā)有一系列非運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)癥狀[12]。抑郁是PD最常見的非運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)癥狀，其在PD患者中發(fā)生率達(dá)到40%～ 50%，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[13]。本研究中，與假手術(shù)組比較，采用單側(cè)MFB注射6-OHDA制備的PD模型大鼠出現(xiàn)不動(dòng)時(shí)間的明顯延長(zhǎng)和蔗糖消耗量的明顯降低，提示黑質(zhì)致密部單側(cè)完全損毀可以誘發(fā)大鼠出現(xiàn)抑郁行為，與以往的研究[14]結(jié)果一致。目前，對(duì)PD抑郁的治療方法主要包括心理療法、藥物治療和行為學(xué)治療等，治療效果不佳，甚至?xí)霈F(xiàn)嚴(yán)重的副作用。

表2 各組大鼠mPFC和RN中DA、5-HT和NA水平

Tab.2 Levels of DA,5-HT and NA in mPFC and RN of rats in various groups

GroupDAmPFCRN5-HTmPFCRNNAmPFCRNSham operation300.02±52.59286.22±35.41679.17±177.911488.22±101.44675.46±53.35416.26±49.39PD 142.98±20.51?224.38±28.92372.86±38.58??883.66±145.29??517.79±46.32334.21±25.09Anodal repeated tDCS288.16±32.12△424.08±45.74△△587.13±48.46△△1588.88±148.53△△590.14±29.31454.31±67.08Cathodal repeated tDCS200.38±24.28295.01±33.35566.69±109.74△1330.44±113.39547.06±30.68361.31±20.12

*P<0.05，**P<0.01 compared with sham operation group;△P<0.05，△△P<0.01 compared with PD group.

tDCS是一種非侵入性的腦刺激技術(shù)，已有研究[2，15-16]表明tDCS對(duì)抑郁行為有明顯的改善作用，加之tDCS不良反應(yīng)少、使用方便，在臨床上已經(jīng)成為治療抑郁的一種新方法。tDCS對(duì)于PD相關(guān)抑郁行為是否有治療作用，目前尚無相關(guān)報(bào)道。本研究擬通過對(duì)PD模型大鼠使用重復(fù)tDCS，觀察大鼠的抑郁行為及相關(guān)腦區(qū)單胺類遞質(zhì)水平的變化，揭示tDCS對(duì)PD相關(guān)抑郁行為的作用及其相關(guān)機(jī)制，為臨床尋找新方法治療PD相關(guān)抑郁行為提供理論依據(jù)。

tDCS分為陽極tDCS和陰極tDCS，電極的陽極靠近神經(jīng)元胞體或樹突時(shí)，膜電位降低，發(fā)生去極化，神經(jīng)元興奮性增強(qiáng)；相反，陰極靠近時(shí)膜電位升高，發(fā)生超極化，神經(jīng)元興奮性降低[17]。本研究結(jié)果顯示：陽極重復(fù)tDCS和陰極重復(fù)tDCS對(duì)PD相關(guān)抑郁行為均有一定作用。在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中，陽極重復(fù)tDCS組和陰極重復(fù)tDCS組PD大鼠的不動(dòng)時(shí)間均明顯縮短；在蔗糖偏好實(shí)驗(yàn)中，陽極重復(fù)tDCS組PD大鼠的蔗糖消耗量明顯增加，陰極重復(fù)tDCS組大鼠雖然有增加趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在反映抑郁行為的2種實(shí)驗(yàn)中大鼠出現(xiàn)以上差異，可能是因?yàn)橹貜?fù)tDCS對(duì)PD大鼠的運(yùn)動(dòng)行為會(huì)有一定的改善作用[5]，而大鼠在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中的不動(dòng)時(shí)間長(zhǎng)短一定程度上也與其運(yùn)動(dòng)能力有關(guān)，而蔗糖偏好實(shí)驗(yàn)恰好能夠排除tDCS對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)能力的影響 。本研究提示：重復(fù)tDCS對(duì)PD相關(guān)抑郁行為具有改善作用，其中陽極重復(fù)tDCS的作用強(qiáng)于陰極重復(fù)tDCS。

研究[18]表明：tDCS具有抗抑郁作用，其機(jī)制可能是tDCS通過提高神經(jīng)元可塑性以緩解抑郁癥狀。目前臨床使用的抗抑郁藥可提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)中單胺類遞質(zhì)水平[19-20]，說明單胺系統(tǒng)在抑郁行為中發(fā)揮重要作用。tDCS的抗抑郁作用與腦內(nèi)單胺類遞質(zhì)水平變化是否有關(guān)，目前尚無相關(guān)報(bào)道。本研究采用高效液相-電化學(xué)法觀察假手術(shù)組、PD組、陽極重復(fù)tDCS組和陰極重復(fù)tDCS組大鼠腦內(nèi)mPFC和RN中DA、5-HT及NA水平的變化，結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，PD組大鼠mPFC中DA及5-HT水平明顯降低，RN中5-HT水平明顯降低，提示PD大鼠出現(xiàn)抑郁行為與腦內(nèi)DA及5-HT水平降低有關(guān)；與PD組比較，陽極重復(fù)tDCS組大鼠mPFC和RN中DA和5-HT水平明顯升高，陰極重復(fù)tDCS組只有mPFC中5-HT水平明顯升高，RN中5-HT以及mPFC和RN中DA水平有升高趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而陽極和陰極重復(fù)tDCS對(duì)NA水平均無明顯影響。因此，重復(fù)tDCS可以升高大鼠腦內(nèi)單胺類遞質(zhì)水平，尤其是DA和5-HT水平，這可能是tDCS發(fā)揮抗抑郁效應(yīng)的機(jī)制之一。

本研究結(jié)果證實(shí)：通過對(duì)額葉區(qū)使用重復(fù)tDCS可改善大鼠PD相關(guān)抑郁行為，該作用可能與改變相關(guān)腦區(qū)中單胺類遞質(zhì)水平有關(guān)。陽極重復(fù)tDCS對(duì)大鼠抑郁行為的改善作用強(qiáng)于陰極重復(fù)tDCS，其具體機(jī)制尚不明確，需要后續(xù)進(jìn)一步研究。