過表達(dá)P21減輕順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷*

曹 雷， 鄭 灼， 李 寧， 趙 訊， 張穎軒

(哈勵遜國際和平醫(yī)院腎內(nèi)科， 河北 衡水 053000)

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是一種常見的臨床危重癥，死亡率較高，往往表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞凋亡、壞死、異常增殖及纖維化等[1-3]。而在細(xì)胞增殖與凋亡失平衡的事件中必然伴隨著細(xì)胞周期的改變，且研究證實(shí)細(xì)胞周期阻滯參與AKI的發(fā)生[4]。細(xì)胞周期水平的變化多取決于周期素(cyclins)、周期素依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs)及周期素依賴性激酶抑制物(cyclin-dependent kinases inhibitors，CDKIs)的綜合調(diào)控作用[5-6]。P21是一種CDKIs，隸屬于CIP/KIP(cyclin inhibition protein/kinase inhibition protein)家族[7]。早前有研究顯示，CIP/KIP家族的P18缺失可加重順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷[8]；在缺血再灌注所致腎損傷模型小鼠中可檢測到P21的高表達(dá)，并與缺血預(yù)處理的保護(hù)效應(yīng)密切相關(guān)[9]。但AKI發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，且不同原因所致AKI的病理機(jī)制不盡相同，P21在順鉑(cisplatin)所致腎損傷中的作用尚不明確。

在上述實(shí)驗(yàn)背景下，本研究首先利用順鉑體外誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞HK-2損傷，并檢測該過程中P21的表達(dá)情況，然后通過P21過表達(dá)進(jìn)一步探討P21對順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷的影響及相關(guān)作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、DMEM/F12培養(yǎng)基及Opti-MEM培養(yǎng)基購于Gibco；順鉑購于Sigma； LipofectamineTM2000購于Invitrogen；人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2細(xì)胞)購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；CCK-8細(xì)胞活力分析試劑盒購于Dojindo；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于南京凱基公司；pcDNA3-P21、pcDNA3空載體及SYBR Green I real-time PCR 試劑盒由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組 HK-2細(xì)胞置于含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中，并在37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每隔1～2 d更換培養(yǎng)基，每隔4～5 d胰酶常規(guī)消化傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞消化并接種于6孔板中，待細(xì)胞融合至60%左右，更換為不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基同步化12 h，隨后轉(zhuǎn)染pcDNA3-P21或pcDNA3空載體。組別設(shè)置為對照組(control組)，pcDNA3空載體轉(zhuǎn)染組(pcDNA3組)及pcDNA3-P21轉(zhuǎn)染組(P21組)。將質(zhì)粒及LipofectamineTM2000分別溶解于Opti-MEM培養(yǎng)基中并孵育5 min，輕柔混合后室溫靜置20 min，形成復(fù)合體。而后將所得的復(fù)合體按組別要求分別加入6孔板中，放置于培養(yǎng)箱中孵育6 h，更換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，測定過表達(dá)效率后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。過表達(dá)后實(shí)驗(yàn)共分為4組：正常對照(control)組采用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)；順鉑處理組于培養(yǎng)基中加入順鉑(終濃度為10 μmol/L)；陰性對照組(cisplatin+pcDNA3組)在轉(zhuǎn)染pcDNA3空載體同時加入10 μmol/L順鉑；P21過表達(dá)組(cisplatin+P21)在轉(zhuǎn)染pcDNA-P21的同時加入10 μmol/L順鉑。

2.2CCK-8法測定細(xì)胞活力 取對數(shù)生長期的細(xì)胞消化后接種于6孔板，給予相應(yīng)處理后繼續(xù)培養(yǎng)至截止時間前2 h，向每孔加入10 μL CCK-8溶液，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h。用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔在450 nm波長處的吸光度(A)值，計算細(xì)胞的相對活力。每組設(shè)置3個復(fù)孔取均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

2.3流式細(xì)胞術(shù)Annexin V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡 依據(jù)說明書要求，采用流式細(xì)胞儀(Annexin V /PI 雙染色法)檢測細(xì)胞凋亡。各組細(xì)胞消化后用PBS漂洗2次并于1 000×g轉(zhuǎn)速下離心5 min；加入binding buffer 重懸細(xì)胞；加Annexin V-FITC混勻并室溫避光靜置10 min；室溫避光加PI染色液孵育5 min后上機(jī)檢測。激發(fā)波長Ex=488 nm，發(fā)射波長Em=530 nm。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

2.4Western blot檢測蛋白表達(dá)水平 加RIPA裂解液提取各組蛋白樣品，并用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。調(diào)整各組上樣量至80 μg，并加入4倍體積的蛋白上樣緩沖液，98 ℃水浴變性5 min。SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，加5%脫脂牛奶室溫封閉90 min；而后分別加入不同的待測Ⅰ抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌5 min、3次；加入抗HRP標(biāo)記的 II 抗，室溫孵育90 min，TBST洗滌10 min、3次。于暗室中將PVDF膜的蛋白面浸入ECL發(fā)光液中激發(fā)熒光，經(jīng)壓片、顯影及定影后對蛋白條帶行灰度分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

2.5RT-qPCR檢測mRNA表達(dá)水平 依據(jù)Trizol說明書提取各組細(xì)胞總RNA，純化后測定樣品的A280值并定量。取2 μg總RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下逆轉(zhuǎn)錄，而后采用SYBR Green I real-time PCR的方法檢測mRNA的相對表達(dá)。P21的正向引物為5’-TAGCAGCGGAACAAGGAG-3’，反向引物為5’-AAACGGGAACCAGGACAC-3’。 GAPDH作為內(nèi)參照，正向引物為5’-GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT-3’，反向引物為5’-AAGAATGGGAGTTGCTGTTGAAGT-3’。PCR反應(yīng)體系為：1 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、10 μL SYBR Green PCR Master Mix和100 nmol/L引物，加ddH2O調(diào)整總體積至25 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；92 ℃10 s、60 ℃ 50 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法分析mRNA的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均錄入SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)分析軟件中進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組數(shù)據(jù)行單因素方差分析，并用Bonferroni法進(jìn)行各組均數(shù)間的兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 P21在順鉑誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞中的表達(dá)

我們首先采用不同劑量(0、5、10、20 μmol/L)順鉑梯度刺激HK-2細(xì)胞24 h后，檢測P21的表達(dá)情況，結(jié)果顯示P21的mRNA及蛋白表達(dá)水平隨著順鉑濃度的增加不斷升高。而以10 μmol/L順鉑孵育HK-2細(xì)胞0、6、12、24 h后，同樣可檢測到P21的表達(dá)依次升高。該結(jié)果提示順鉑可呈時間及劑量依賴性地誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞中P21的表達(dá)，見圖1。

Figure 1. The expression of P21 in the renal tubular epithelial cells treated with cisplatin. A: cisplatin induced the increases in mRNA and protein expression of P21 in a dose-dependent manner in the HK-2 cells; B: cisplatin at 10 μmol/L induced the increases in the mRNA and protein expression of P21 in a time-dependent manner in the HK-2 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vs0 μmol/L;#P<0.05vs0 h.

圖1順鉑誘導(dǎo)P21在腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)

2 過表達(dá)P21對順鉑誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷的影響

為進(jìn)一步檢測P21對順鉑誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷的作用，我們在HK-2細(xì)胞中外源性過表達(dá)P21，并檢測其對細(xì)胞活力及腎小管上皮細(xì)胞急性損傷標(biāo)記物腎損傷因子1(kidney injury molecule-1,KIM-1)和中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)表達(dá)的影響，結(jié)果見圖2。過表達(dá)效率檢測顯示轉(zhuǎn)染pcDNA3-P21后，P21的表達(dá)明顯升高；CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，順鉑可致細(xì)胞活力明顯降低，而相比于順鉑處理組， P21過表達(dá)組細(xì)胞活力有所回升。Western blot實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，順鉑可誘導(dǎo)KIM-1和NGAL的表達(dá)，但過表達(dá)P21后，細(xì)胞中KIM-1和NGAL的表達(dá)明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 過表達(dá)P21對順鉑誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，順鉑可致HK-2細(xì)胞凋亡率顯著增加，而過表達(dá)P21可部分逆轉(zhuǎn)順鉑所致的腎小管上皮細(xì)胞凋亡(P<0.05)。

除此之外，我們還檢測了caspase家族凋亡效應(yīng)蛋白caspase-3的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，10 μmol/L順鉑處理可致細(xì)胞中cleaved caspase-3的蛋白水平明顯增加，而相比于順鉑處理組， P21過表達(dá)組細(xì)胞中cleaved caspase-3的蛋白水平減少，見圖3。

Figure 2. P21 over-expression attenuated cisplatin-induced HK-2 cells damage. After pcDNA3-P21 transfection, the cells were treated with 10 μmol/L cisplatin for 12 h. Mean±SD.n=6.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vscisplatin group.

圖2過表達(dá)P21可減輕順鉑所致的HK-2細(xì)胞損傷

4 過表達(dá)P21對順鉑誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

為進(jìn)一步觀察P21調(diào)控順鉑誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷的作用機(jī)制，我們檢測了過表達(dá)P21對HK-2細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路相關(guān)分子的影響，結(jié)果如圖4所示，10 μmol/L順鉑孵育可誘導(dǎo)細(xì)胞中GRP78、CHOP的表達(dá)，并促進(jìn)PERK及eIF2α的磷酸化；而在HK-2細(xì)胞中過表達(dá)P21，可使順鉑誘導(dǎo)的GRP78、CHOP水平及PERK、eIF2α的磷酸化明顯降低(P<0.05)。

討 論

AKI的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，且不同原因所致AKI的機(jī)制并不相同。研究顯示，AKI的主要損傷機(jī)制包括線粒體損傷、氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)及腎小管上皮細(xì)胞的凋亡及壞死等[10-11]。P21是目前已知的細(xì)胞周期抑制蛋白，可通過抑制CDKs的活性負(fù)調(diào)控細(xì)胞周期，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、凋亡及分化等病理生理過程[7]。本研究選取P21為靶點(diǎn)，系統(tǒng)分析了其在順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞HK-2損傷中的作用及相關(guān)作用機(jī)制。結(jié)果顯示，順鉑可時間及劑量依賴性地誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞中P21的mRNA及蛋白表達(dá)。提示順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷可能與P21的表達(dá)存在一定的聯(lián)系。通過P21過表達(dá)載體外源性提高HK-2細(xì)胞中P21的表達(dá)豐度，我們發(fā)現(xiàn)在HK-2細(xì)胞中過表達(dá)P21可顯著升高細(xì)胞活力，并減輕了順鉑所致細(xì)胞中KIM-1和NGAL的積累。KIM-1和NGAL均為急性腎損傷的早期標(biāo)志物[12-13]，因此我們認(rèn)為，過表達(dá)P21可減輕順鉑所致的腎小管上皮細(xì)胞損傷。

為進(jìn)一步了解過表達(dá)P21減輕順鉑所致腎小管上皮細(xì)胞損傷的作用機(jī)制，我們檢測了過表達(dá)P21對細(xì)胞凋亡水平的影響。結(jié)果顯示，順鉑可致HK-2細(xì)胞凋亡率顯著增加，而過表達(dá)P21可部分逆轉(zhuǎn)順鉑所致的腎小管上皮細(xì)胞凋亡，同時抑制caspase家族凋亡效應(yīng)蛋白caspase-3的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡。提示，過表達(dá)P21可通過抑制細(xì)胞凋亡來減輕順鉑所致的HK-2細(xì)胞損傷。

Figure 3. The effect of P21 over-expression on cisplatin induced cell apoptosis in the HK-2 cells. After pcDNA3-P21 transfection, the cells were treated with cisplatin at 10 μmol/L for 12 h. Mean±SD.n=6.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vscisplatin group.

圖3過表達(dá)P21對順鉑所致HK-2細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞凋亡是一個多因素、多通路調(diào)控的復(fù)雜病理生理過程；其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激不僅是調(diào)控腎細(xì)胞凋亡的一條重要途徑，同時也是AKI的關(guān)鍵病理機(jī)制[14-15]。有實(shí)驗(yàn)表明，P21可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所致的胰島組織損傷[16]，在缺血所致急性腎損傷中可出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平的改變并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。未折疊蛋白反應(yīng)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一；當(dāng)發(fā)生嚴(yán)重或持久的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，PREK等會激活CHOP、JNK及caspase等下游凋亡信號，執(zhí)行細(xì)胞凋亡[18-19]。GRP78作為一種小分子伴侶蛋白，可通過減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中非折疊蛋白或錯誤折疊蛋白的聚集，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平[20]。本研究的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，順鉑可誘導(dǎo)細(xì)胞中GRP78、CHOP的表達(dá)并促進(jìn)PERK及eIF2α的磷酸化；而在HK-2細(xì)胞中過表達(dá)P21，可使順鉑誘導(dǎo)的GRP78、CHOP的表達(dá)及PERK、eIF2α的磷酸化明顯減少；表明過表達(dá)P21減輕了順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平。

Figure 4. The effect of P21 over-expression on cisplatin induced endoplasmic reticulum stress in the HK-2 cells. After pcDNA3-P21 transfection, the cells were treated with cisplatin at 10 μmol/L for 12 h. Mean±SD.n=6.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vscisplatin group.

圖4過表達(dá)P21對順鉑所致HK-2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平的影響

以上結(jié)果提示過表達(dá)P21對順鉑所致腎小管上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)效應(yīng)可能與調(diào)控細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平有關(guān)。

綜上所述，過表達(dá)P21可減輕順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞急性損傷，其機(jī)制可能與調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路，抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。