下丘腦室旁核外源性 orexin-A對肥胖大鼠攝食的影響及NPY受體信號的調(diào)控*

王 程， 欒 曉， 郭菲菲， 孫向榮， 徐 珞

(青島大學基礎醫(yī)學院生理學與病理生理學系， 山東 青島 266021)

隨著社會發(fā)展和人民生活水平提高，肥胖和由此引發(fā)的心腦血管等系統(tǒng)疾病已經(jīng)逐漸成為世界上最重要的人類健康問題之一[1]。神經(jīng)內(nèi)分泌對攝食的調(diào)控是能量調(diào)控的重要節(jié)點之一。

食欲素(orexins)系統(tǒng)由2種神經(jīng)肽(orexin-A和orexin-B)和2種G蛋白偶聯(lián)受體[食欲素1型受體(orexin receptor 1，OX1R)和食欲素2型受體(orexin receptor 2，OX2R)]組成[2-3]。Orexins神經(jīng)元胞體主要位于下丘腦外側(cè)區(qū)(lateral hypothalamic area，LHA)和穹隆周區(qū)(perifornical area，PeF)，這些神經(jīng)元可發(fā)出纖維在中樞廣泛投射[4-5]。Orexin-A主要參與攝食行為、睡眠/覺醒、能量平衡和獎勵等多種生理活動調(diào)控[6-8]。側(cè)腦室注射orexin-A可促進大鼠攝食，并呈現(xiàn)劑量依賴關系。Orexin基因敲除或orexin神經(jīng)元缺乏的大鼠呈現(xiàn)食欲消退和減弱[9]。神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y，NPY)屬于胰多肽家族，含有36個氨基酸，在調(diào)控攝食和體重等方面發(fā)揮著重要作用。中樞注射NPY可顯著促進大鼠攝食[10]；禁食大鼠下丘腦弓狀核(arcuate nucleus，ARC)內(nèi)NPY表達增加[11]。NPY受體有6種亞型，其中NPY受體Y1(NPY receptor Y1，NPY-1R)和NPY受體Y5(NPY receptor Y5，NPY-5R)可參與攝食調(diào)控[12-13]。因此，orexin-A和NPY是重要的攝食調(diào)節(jié)因子。

下丘腦室旁核(paraventricular nucleus，PVN)是參與攝食整合的重要腦區(qū)[14]，但下丘腦PVN的orexin-A對攝食和葡萄糖敏感(glucose-sensitive，GS)神經(jīng)元的調(diào)控機制尚不清楚。因此，本研究主要觀察并比較PVN的orexin-A對SD大鼠和飲食誘導肥胖(diet-induced obese，DIO)大鼠攝食及GS神經(jīng)元興奮性的影響，以及NPY5R信號通路對該過程的調(diào)控。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

健康雄性SD大鼠(購于山東省青島市藥品檢驗所，動物合格證編號：0014125)，體質(zhì)量為150～180 g。大鼠置于適宜的環(huán)境中飼養(yǎng)[溫度(25±2) ℃；光照時間8:00～20:00]，自由攝食和飲水。本實驗中的實驗處置方法均符合倫理學標準。

2 實驗儀器及試劑

大鼠腦立體定位儀(Scientifica)；熒光顯微鏡(Olympus)。Cy3 標記的IgG抗體(Jackson ImmunoResearch)；orexin-A、抗OX1R抗體、orexin-A受體拮抗劑SB-334867、抗NPY-5R 抗體、NPY-5R拮抗劑CGP-71683和抗c-Fos 抗體均購于Sigma。

3 主要方法

3.1DIO大鼠模型的建立[15]實驗室飲食以適應實驗環(huán)境，1周后，喂養(yǎng)高脂飲食(4 357 kcal/kg)，2周后稱量大鼠體重，根據(jù)大鼠體重選出中間1/3為正常SD大鼠，給予正常飲食(3 253 kcal/kg)。剩余大鼠繼續(xù)喂養(yǎng)高脂飲食，8周稱量大鼠體重，根據(jù)大鼠體重選出上1/3大鼠為DIO大鼠，其余大鼠不用于本次實驗。

3.2免疫組織化學染色實驗 大鼠用戊巴比妥(50 mg/kg，ip)麻醉后，先后輸入等滲鹽水和4%多聚甲醛溶液行大鼠腦灌注固定，用冰凍切片機連續(xù)冠狀切片，切片厚15 μm，所有切片均放于-20 ℃冰箱避光凍存。選取PVN區(qū)域較大的切片，加入正常羊血清封閉非特異性抗原，室溫條件下避光孵育約2 h后，加入抗OX1R抗體和抗NPY-5R 抗體，而空白對照組使用正常羊血清代替 I 抗進行上述處理，避光過夜；再加入Cy3 標記的羊抗兔IgG，室溫環(huán)境避光孵育2 h，PBS洗滌3次，每次5 min，防淬滅熒光封片劑封片。在熒光顯微鏡下觀察實驗結果。

3.3PVN置管和藥物注射 大鼠注射戊巴比妥麻醉(50 mg/kg，ip)后固定于三維腦立體定位儀，參照Paxinos和Watson腦圖譜，在PVN(前囟1.8 mm, 旁開0.3 mm, 顱骨下8 mm)內(nèi)植入一不銹鋼套管(26 gauge, 15 μm)，內(nèi)芯置入套管內(nèi)，以避免套管阻塞。將不銹鋼內(nèi)套管與微量注射器連接，各類藥物通過注射器注入。手術大鼠連續(xù)3 d腹腔注射8×104U青霉素防止術后感染。大鼠術后至少恢復7 d方可進行后續(xù)實驗。

3.4電生理實驗 拉制儀拉制5管玻璃微電極(電極尖端直徑10～20 μm，電極阻抗5～15 MΩ)，其中1管為記錄電極，充以0.5 mol/L乙酸鈉和20 g/L的滂胺天藍用于神經(jīng)元放電記錄，另外4管根據(jù)分組情況分別充灌不同的藥物。在觀察orexin-A對PVN內(nèi)GS神經(jīng)元放電活動影響時，其余4管分別充以5 mmol/L葡萄糖溶液、生理鹽水(normal saline,NS)、orexin-A(15 nmol/L)和OX1R拮抗劑SB-334867(25 nmol/L)；另外，在探究NPY受體信號通路是否參與調(diào)節(jié)orexin-A對大鼠PVN內(nèi)GS神經(jīng)元放電活動的影響作用時，剩余4管分別充以5 mmol/L葡萄糖溶液、NS、orexin-A(15 nmol/L)和NPY-5R拮抗劑CGP-71683(150 nmol/L)。在PVN內(nèi)微量首次注射ore-xin-A(15 nmol/L)后觀察orexin-A對PVN內(nèi)GS神經(jīng)元放電活動影響，待神經(jīng)元的放電活動恢復，在PVN內(nèi)預先注射OX1R拮抗劑SB-334867(25 nmol/L)或NPY-5R拮抗劑CGP-71683(150 nmol/L)后，再次微量注射orexin-A，觀察orexin-A誘導的放電效應的改變；用液壓推進器將微電極送至PVN區(qū)，記錄的電信號經(jīng)MEZ-8201型微電極放大器輸入VC-11雙道示波器，經(jīng)SUMP-PC生物信號系統(tǒng)進行放電頻率處理與分析。神經(jīng)元放電頻率的變化率超過20%作為神經(jīng)元興奮或抑制指標。

3.5組織學檢查 細胞外放電記錄實驗結束后，微電極接陰極，無關電極接陽極，以電流強度為50 μA的直流電通電20 min，微電泳使電極內(nèi)的滂胺天藍泳入腦組織，標記微電極所在位置。先后用生理鹽水和4%多聚甲醛溶液灌注固定，快速斷頭取腦，4%多聚甲醛內(nèi)浸泡2 d，作50 μm系列冠狀切片，中性紅染色，檢查電極記錄位置，位置不準確的實驗數(shù)據(jù)棄去不用。

3.6攝食量測定 將30只SD大鼠和30只DIO大鼠均隨機分為6組(n=5)：(1)對照(NS)組；(2)ore-xin-A (1.0 nmol)組；(3)orexin-A受體拮抗劑SB-334867(1.0 nmol)組；(4)orexin-A受體拮抗劑SB-334867(1.0 nmol)+orexin-A(1.0 nmol)組；(5)NPY-5R拮抗劑CGP-71683(5.0 nmol)組；(6)NPY-5R拮抗劑CGP-71683(5.0 nmol)+orexin-A(1.0 nmol)組。實驗開始前30 min注射相應的藥物。將大鼠放置于各自籠子內(nèi)，給予事先稱量好的食物，分別在注射藥物后2 h和4 h稱量剩余食物的量。計算出大鼠在0～2 h和0～4 h累積攝食量。所有的實驗均在上午9點開始。

4 統(tǒng)計學處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，兩獨立樣本間比較采用t檢驗，多組間均數(shù)采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 PVN內(nèi)OX1R和NPY-5R的表達

熒光免疫組織化學染色實驗結果發(fā)現(xiàn)，在SD大鼠和DIO大鼠PVN中均可觀察到OX1R和NPY-5R。與SD大鼠相比，DIO大鼠PVN內(nèi)OX1R和NPY-5R表達顯著增多，見圖1。

Figure 1. The OX1R and NPY-5R immunopositive neurons in the PVN (fluorescent immunohistochemical staining, ×100).

圖1PVN內(nèi)OX1R和NPY-5R免疫陽性神經(jīng)元表達

2 Orexin-A對SD大鼠PVN內(nèi)GS神經(jīng)元放電活動的影響

微量注射器向SD大鼠PVN內(nèi)注入5 mmol/L葡萄糖溶液，觀察神經(jīng)元放電頻率的變化，以鑒別GS神經(jīng)元，若神經(jīng)元的放電頻率隨著局部葡萄糖濃度的增加而增加，則確定為葡萄糖興奮性(glucose-excited,GE)神經(jīng)元；若神經(jīng)元的放電頻率隨著局部葡萄糖濃度增加而降低，則稱為葡萄糖抑制性(glucose-inhibited,GI)神經(jīng)元，見圖2。

Figure 2. The discharge of glucose-sensitive (GS) neurons in the PVN of SD rats. A: glucose-excited (GE) neurons; B: glucose-inhibited (GI) neurons.

圖2SD大鼠PVN內(nèi)葡萄糖敏感神經(jīng)元放電活動

在本次實驗中，共記錄27只SD大鼠中117個PVN神經(jīng)元的放電情況，在117個PVN神經(jīng)元中，81個神經(jīng)元被鑒定為GS神經(jīng)元，其中有46個(46/117，39.3%)為GI神經(jīng)元，35個(35/117，29.7%)神經(jīng)元為GE神經(jīng)元。

我們觀察orexin-A對SD大鼠PVN內(nèi)GS神經(jīng)元放電活動的影響，PVN內(nèi)微量注射orexin-A后，在46個GI神經(jīng)元中，33個GI神經(jīng)元(33/46，71.7%)的放電頻率顯著降低(P<0.01),有8個GI 神經(jīng)元(8/46，17.4%)興奮,其余5個GI神經(jīng)元放電活動沒有明顯變化;PVN內(nèi)微量注射orexin-A后，在35個GE神經(jīng)元中，24個GE神經(jīng)元(24/35，68.6%)的放電頻率明顯增加(P<0.01),有6個GE 神經(jīng)元(6/35，17.1%)放電被抑制，其余5個GE神經(jīng)元(5/35，14.3%)的放電活動沒有明顯變化，見表1。

表1Orexin-A對SD大鼠PVN內(nèi)GS神經(jīng)元的影響

Table 1. The effects of orexin-A on the PVN GS neurons in SD rats

NeuronsnResponsetoorexin?AInhibitedExcitedNoresponse GI4633(71．7%)8(17．4%)5(10．8%) GE3524(68．6%)6(17．1%)5(14．3%)

GI: glucose-inhibited; GE: glucose-excited.

但PVN內(nèi)預先注射OX1R拮抗劑SB-334867，再次注射orexin-A,發(fā)現(xiàn)orexin-A對GS神經(jīng)元放電活動的影響被顯著減弱(P<0.01)，提示orexin-A對GS神經(jīng)元放電活動的影響作用可能主要依賴于orexin-A受體信號通路；而單獨注射SB-334867后，PVN內(nèi)GS神經(jīng)元的放電活動沒有明顯變化，見表2。

表2 Orexin-A對SD大鼠PVN中GS神經(jīng)元放電活動的影響

**P<0.01vsbefore the drug injection;##P<0.01vsorexin-A group.

3 NPY受體信號通路參與調(diào)節(jié)orexin-A對SD大鼠PVN內(nèi)GS神經(jīng)元放電活動的影響

我們進一步觀察NPY-5R拮抗劑CGP-71683對orexin-A誘導SD大鼠PVN內(nèi)GS神經(jīng)元放電活動的影響。在PVN內(nèi)預先注射NPY-5R拮抗劑CGP-71683后，再注射orexin-A，實驗結果觀察到orexin-A對GE和GI神經(jīng)元放電活動的興奮和抑制效應有所減弱，但差異無統(tǒng)計學意義，表明CGP-71683可部分阻斷orexin-A對PVN內(nèi)GS神經(jīng)元放電活動的作用；而單獨注射CGP-71683，PVN內(nèi)GS神經(jīng)元的放電活動沒有明顯變化，見表3。

表3 CGP-71683對SD大鼠orexin-A誘導的GS神經(jīng)元放電活動的影響

**P<0.01vsbefore the drug injection.

4 Orexin-A對DIO大鼠PVN內(nèi)GS神經(jīng)元放電活動的影響

為了探究肥胖與orexin-A信號通路的關系，在本次實驗中，共記錄27只DIO大鼠中123個PVN神經(jīng)元的放電情況，通過微量注射器向PVN內(nèi)注入5 mmol/L葡萄糖溶液，85個神經(jīng)元被稱為葡萄糖敏感神經(jīng)元(GS神經(jīng)元)，48個(48/123，39.0%)神經(jīng)元放電頻率明顯降低為GI神經(jīng)元；37個(37/123，30.0%)神經(jīng)元放電頻率明顯增加為GE神經(jīng)元，見圖3。

Figure 3. The discharge of glucose-sensitive (GS) neurons in the PVN of DIO rats. A: glucose-excited (GE) neurons; B: glucose-inhibited (GI) neurons.

圖3DIO大鼠PVN內(nèi)葡萄糖敏感神經(jīng)元放電活動

我們觀察orexin-A對DIO大鼠PVN內(nèi)GS神經(jīng)元放電活動的影響，PVN內(nèi)微量注射orexin-A后，30個GI神經(jīng)元(30/48，62.5%)的放電活動被抑制(P<0.01)，11個GI 神經(jīng)元(11/48，22.9%)興奮,其余7個GI神經(jīng)元放電活動沒有明顯變化; 8個GE神經(jīng)元(24/37，64.9%)的放電頻率明顯增加(P<0.01)，24個GE 神經(jīng)元(8/37，21.6%)放電活動被抑制，其余5個GE神經(jīng)元(5/37，13.5%)的放電活動沒有明顯變化，見表4。然而，orexin-A對DIO大鼠PVN內(nèi)GS神經(jīng)元放電活動的影響也可被SB-334867阻斷(P<0.01);單獨注射SB-334867后，PVN內(nèi)GS神經(jīng)元的放電活動沒有明顯變化，見表5。

表4Orexin-A對DIO大鼠PVN內(nèi)GS神經(jīng)元的影響

Table 4. The effects of orexin-A on the PVN GS neurons in DIO rats

NeuronsnResponsetoorexin?AInhibitedExcitedNoresponse GI4830(62．5%)11(22．9%)7(14．6%) GE3724(64．9%)8(21．6%)5(13．5%)

GI: glucose-inhibited; GE: glucose-excited.

與SD大鼠相比，在DIO大鼠中orexin-A對GI神經(jīng)元的抑制效應和對GE神經(jīng)元的興奮效應顯著增強(P<0.05)，可能與DIO大鼠PVN內(nèi)OX1R表達增多有關，見圖4。

表5 Orexin-A對DIO大鼠PVN內(nèi)GS神經(jīng)元放電活動的影響

**P<0.01vsbefore the drug injection；##P<0.01vsorexin-A group.

5 NPY受體信號通路參與調(diào)節(jié)orexin-A對DIO大鼠PVN內(nèi)GS神經(jīng)元放電活動的影響

我們進一步觀察CGP-71683對orexin-A誘導DIO大鼠PVN內(nèi)GS神經(jīng)元放電活動的作用，實驗結果發(fā)現(xiàn)DIO大鼠PVN內(nèi)預先注射CGP-71683后，再注射orexin-A，觀察到orexin-A對GS神經(jīng)元放電活動的影響效應有所減弱，但差異無統(tǒng)計學意義，表明CGP-71683也可參與調(diào)節(jié)orexin-A對DIO大鼠PVN內(nèi)GS神經(jīng)元放電活動的影響。單獨注射CGP-71683，DIO大鼠PVN內(nèi)GS神經(jīng)元的放電活動沒有明顯變化，見表6。

預先注射CGP-71683，DIO大鼠PVN內(nèi)GS神經(jīng)元放電頻率變化率比正常SD大鼠更明顯(P<0.05)，可能是由于DIO大鼠PVN內(nèi)NPY-5R表達增多導致的，見圖4。

以上實驗數(shù)據(jù)表明，SD大鼠和DIO大鼠PVN內(nèi)注射orexin-A可能主要通過OX1R信號通路均參與GS神經(jīng)元興奮性調(diào)控，NPY-5R信號也參與了該過程，并且在DIO大鼠中的調(diào)控更加敏感。

6 Orexin-A對SD大鼠和DIO大鼠攝食量的影響

與生理鹽水(NS)組相比，SD大鼠和DIO大鼠PVN內(nèi)注射1.0 nmol orexin-A，大鼠在0～2 h和0～4 h攝食量均顯著增加(P<0.05);預先注射OX1R拮抗劑SB-334867可完全阻斷orexin-A的促攝食作用;然而PVN內(nèi)預先注射NPY-5R拮抗劑CGP-71683可部分阻斷orexin-A對攝食的促進作用(P<0.05)，表明SD大鼠和DIO大鼠下丘腦PVN orexin-A主要通過OX1R信號通路參與攝食調(diào)控，NPY-5R信號也參與了該過程調(diào)控。與SD大鼠相比，DIO大鼠PVN內(nèi)注射orexin-A對攝食的促進作用更加明顯(P<0.05)，可能與DIO大鼠內(nèi)orexin-A受體表達增多有關，見圖5。

Figure 4. Comparison of the changes of firing rate of GS neurons of PVN in SD and DIO rats. A, C: changes of firing rate of PVN GI neurons (A) and GE neurons (C) in SD and DIO rats when injection of orexin-A; B, D: changes of firing rate of PVN GI neurons (B) and GE neurons (D) in SD rats and DIO rats when administration of CGP-71683. Mean±SD.n=27.*P<0.05vsthe same group in SD rats. Change of firing rate was calculated as 100×(firing rate of GS neurons after treatment-firing rate of GS neurons before treatment)/firing rate of GS neurons before treatment.

圖4正常大鼠和DIO大鼠PVN內(nèi)GS神經(jīng)元放電頻率變化率比較

表6 CGP-71683對DIO大鼠orexin-A誘導的GS神經(jīng)元放電活動的影響

**P<0.01vsbefore the drug injection.

Figure 5. The effects of orexin-A on food intake in SD and DIO rats. A: 0～2 h food intake; B: 0～4 h food intake. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsNS group;#P<0.05vsorexin-A group.

圖5Orexin-A對SD大鼠和DIO大鼠攝食量的影響

討 論

早在20世紀20年代，下丘腦就被認為是調(diào)控攝食的關鍵腦區(qū)[16]。PVN是下丘腦內(nèi)重要的整合核團，可接受來自其它腦區(qū)的傳入信號，例如視交叉上核、ARC和LHA等。

下丘腦GS神經(jīng)元參與攝食和葡萄糖濃度的調(diào)控[17]，因其在食欲調(diào)節(jié)方面的潛在作用而受到廣泛的關注。在LHA orexins神經(jīng)元是GI神經(jīng)元[18]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，orexin-A可抑制PVN內(nèi)GI神經(jīng)元的放電活動，興奮GE神經(jīng)元的放電活動。但是預先注射SB-334867可完全阻斷orexin-A對GS神經(jīng)元放電活動的影響效應，然而預先注射CGP71683可部分阻斷以上orexin-A的作用。結果提示，下丘腦PVN 外源性orexin-A可能主要通過OX1R信號通路參與GS神經(jīng)元興奮性調(diào)控，NPY5受體信號也可能參與了該影響過程。

中樞注射orexin-A對攝食具有調(diào)節(jié)作用，尤其是在下丘腦。中樞注射orexin-A可顯著增加大鼠攝食量[19]。因為orexins和NPY神經(jīng)元之間存在形態(tài)學聯(lián)系，二者也可能協(xié)同起來共同調(diào)節(jié)攝食，我們的實驗結果與以上研究相類似，大鼠PVN內(nèi)注射orexin-A后，大鼠0～2 h和0～4 h的攝食量顯著增加；但是，orexin-A對攝食的促進作用可被SB-334867完全阻斷，在PVN內(nèi)預先注射CGP-71683可部分阻斷orexin-A對攝食促進作用。以上實驗數(shù)據(jù)表明orexin-A對攝食的促進作用主要是通過orexin-A受體信號通路，NPY受體信號通路也可能參與其中，并且在PVN內(nèi)可能orexin-A和GS神經(jīng)元相互作用共同參與攝食的中樞調(diào)控。

本實驗數(shù)據(jù)表明，與SD大鼠相比，注射相同劑量orexin-A，DIO大鼠orexin-A引起PVN GS神經(jīng)元興奮或抑制效應更明顯，對攝食的促進作用也顯著增強。同時注射相同劑量的NPY-5R拮抗劑CGP-71683，在DIO大鼠中，CGP-71683對orexin-A誘導的以上效應的抑制作用更明顯。DIO大鼠對orexin-A和CGP-71683反應敏感的作用機制現(xiàn)還不清楚，可能是DIO大鼠下丘腦PVN OX1R和NPY-5R表達量較高，為了驗證這個假設，我們觀察了SD和DIO大鼠PVN OXlR和NPY-5R表達。結果發(fā)現(xiàn)，DIO大鼠PVN內(nèi)OX1R和NPY-5R表達均比DIO大鼠顯著增多，提示高脂飲食可能誘導OX1R和NPY-5R表達增多，其具體機制尚不清楚。OX1R的增加和orexin-A引起PVN GS神經(jīng)元興奮性的增強和攝食量的增加是同步進行的。這表明下丘腦PVN orexin-A通過OX1R信號通路參與GS神經(jīng)元興奮性和攝食調(diào)控，NPY-5R信號也參與了該過程。

因此，大鼠PVN內(nèi)注射orexin-A對PVN內(nèi)GS神經(jīng)元興奮性和攝食的影響可能受到NPY信號通路的調(diào)控，在DIO大鼠中更加敏感。另外，免疫組織化學實驗結果表明在DIO大鼠下丘腦PVN OX1R和NPY-5R的表達明顯多于正常大鼠。本研究結果對NPY和orexin-A在攝食和GS神經(jīng)元興奮性調(diào)控中的相互作用有了更進一步的研究，也為肥胖的治療提供了一個新的途徑。