不同程度重金屬污染對(duì)稻田土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響①

閆 華，歐陽(yáng)明，張旭輝，應(yīng) 多，趙熙君，張玉嬌，鄭聚鋒，劉曉雨，卞榮軍，李戀卿，潘根興

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不同程度重金屬污染對(duì)稻田土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響①

閆 華，歐陽(yáng)明，張旭輝*，應(yīng) 多，趙熙君，張玉嬌，鄭聚鋒，劉曉雨，卞榮軍，李戀卿，潘根興

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)資源與生態(tài)環(huán)境研究所，南京 210095)

為了研究土壤真菌群落結(jié)構(gòu)在不同程度重金屬污染中的變化，本文用Illumina HiSeq高通量測(cè)序技術(shù)分析了蘇南地區(qū)某金屬冶煉廠和加工產(chǎn)業(yè)區(qū)的重金屬污染水稻土的真菌群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)不同程度重金屬污染對(duì)水稻季土壤真菌豐度和群落結(jié)構(gòu)均有顯著影響。經(jīng)過真菌主成分分析發(fā)現(xiàn)，PC1影響因素對(duì)樣品處理差異的貢獻(xiàn)率是35.96%，PC2影響因素對(duì)樣品處理差異的貢獻(xiàn)率是21.48%；通過真菌冗余度分析發(fā)現(xiàn)，重金屬Pb和Cu污染對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響顯著；通過對(duì)真菌屬水平的相對(duì)豐度分析表明，重金屬污染會(huì)顯著降低敏感真菌的豐度，如被孢霉屬相對(duì)豐度最高降低了87.50%、木霉屬最高降低了99.46%、離殼菌屬和菇屬最高降低了100.00%，同時(shí)耐性真菌的相對(duì)豐度會(huì)提高，如類球囊霉屬的相對(duì)豐度最高增加了98倍、四枝孢霉屬最高增加了56倍、根囊壺菌屬最高增加了2.62倍。綜上所述，不同程度重金屬污染對(duì)稻田土壤真菌群落結(jié)構(gòu)有顯著影響，且隨著污染程度的增加，抗逆真菌相對(duì)數(shù)量和種類顯著增加，敏感真菌的相對(duì)數(shù)量急劇減少，真菌群落結(jié)構(gòu)隨著重金屬污染程度增加進(jìn)一步分化。

重金屬污染；稻田土壤；真菌群落結(jié)構(gòu)；Illumina HiSeq高通量測(cè)序

重金屬在土壤中不易被微生物所分解，只能在環(huán)境中遷移、轉(zhuǎn)化，并不斷積累，當(dāng)超過一定限度時(shí)便對(duì)植物和土壤微生物產(chǎn)生毒害作用，從而破壞土壤生態(tài)系統(tǒng)平衡，進(jìn)而影響整個(gè)環(huán)境系統(tǒng)的功能[1-2]。土壤微生物是維持土壤生物活性的重要組分，在地球生物化學(xué)循環(huán)過程中扮演重要角色，幾乎參與土壤中一切生物和生物化學(xué)反應(yīng)，包括對(duì)動(dòng)植物殘?bào)w的分解、養(yǎng)分的貯藏轉(zhuǎn)化、水分入滲、氣體交換、土壤結(jié)構(gòu)的形成與穩(wěn)定、有機(jī)物的合成及異源生物的降解等方面[3]，與土壤中的動(dòng)植物相比土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成對(duì)外界環(huán)境污染干擾更加靈敏。因此，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)是表征土壤生態(tài)系統(tǒng)群落結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的重要參數(shù)，能夠較好地指示土壤環(huán)境污染狀況[4]。而真菌則對(duì)重金屬污染較細(xì)菌敏感，土壤重金屬污染可顯著減少真菌生物量、改變真菌群落組成[5-7]。

土壤真菌作為土壤微生物中重要的種類之一，參與有機(jī)質(zhì)分解，促進(jìn)物質(zhì)循環(huán)，為植物提供養(yǎng)分，是生態(tài)系統(tǒng)健康的指示物種[8]。與細(xì)菌相比，真菌利用等量底物時(shí)，可以形成更多的自身生物量，且真菌能量流的周期較長(zhǎng)[9-10]。真菌不僅能分泌胞外酶，而且其菌絲具有機(jī)械穿插作用，共同降解土壤中難降解的纖維素和木質(zhì)素[11-12]，因此真菌可以更有效地利用有機(jī)底物，是土壤有機(jī)質(zhì)分解和轉(zhuǎn)化的積極參與者。因此，雖然真菌數(shù)量不及細(xì)菌和放線菌，但真菌呼吸作用所釋放的CO2占土壤總呼吸作用的81% ~ 95%[13-14]，在陸地生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)中占有重要地位。土壤重金屬污染可能會(huì)通過減少微生物對(duì)單一碳底物的利用能力，而減少群落的多樣性和改變其群落結(jié)構(gòu)。如在重金屬污染的稻田土壤中，重金屬污染降低了微生物生物量和真菌優(yōu)勢(shì)度，提高了代謝商，從而改變了稻田土壤中與碳素周轉(zhuǎn)相關(guān)的生物化學(xué)過程及CO2排放[15]。外界干擾如殺菌劑的使用、重金屬污染等，會(huì)影響真菌群落結(jié)構(gòu)或改變豐富度，進(jìn)而影響土壤有機(jī)質(zhì)的降解[16-17]。不同程度的重金屬污染可能對(duì)土壤真菌的碳利用效率影響不同，如在培養(yǎng)條件下，土壤中較低濃度的重金屬污染可刺激土壤呼吸和土壤碳代謝作用，而較高濃度的重金屬污染則會(huì)抑制微生物的分解活動(dòng)從而導(dǎo)致土壤有機(jī)碳礦化率降低[18]。研究表明長(zhǎng)期Cd、Pb、Cu、Zn的復(fù)合污染降低了稻田土壤微生物生物量，污染程度越高，微生物生物量越低，且土壤微生物生物量與土壤有效Cd、Pb、Cu、Zn的含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系[19]。重度重金屬污染可以顯著降低微生物多樣性指數(shù)，導(dǎo)致微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生實(shí)質(zhì)性變化[20]，但在長(zhǎng)期重金屬污染的田間環(huán)境中真菌群落結(jié)構(gòu)是如何隨重金屬污染程度的變化而變化還需要進(jìn)一步研究。

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展和分子生物技術(shù)水平的提高，在分子水平上研究重金屬污染對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響已經(jīng)成為可能。本研究利用Illumina HiSeq高通量測(cè)序技術(shù)分析了不同程度重金屬污染水平下稻田土壤真菌的群落結(jié)構(gòu)差異，研究了不同程度重金屬污染對(duì)土壤中不同菌群的影響，探討了土壤中重金屬耐性菌和敏感菌的變化，以期為重金屬污染下水稻土有機(jī)碳穩(wěn)定性機(jī)制的研究提供生物學(xué)方面的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試土壤為水稻土-普通鐵聚水耕人為土，土壤樣品于2015年10月28日采自蘇南宜興地區(qū)某金屬冶煉廠和加工產(chǎn)業(yè)區(qū)的Pb-Cd污染水稻土，在污染源的下風(fēng)向分別選取距污染源120 m(P1)、80 m(P2)、60 m(P3)、30 m(P4)及10 m(P5)的土樣代表不同污染程度的土壤樣品，并選取鄰近農(nóng)作相同的未污染田塊作為對(duì)照(P0)。采樣時(shí)各處理隨機(jī)3點(diǎn)采集0 ~ 15 cm土壤樣品，田間混合后裝袋，將土樣盛于保鮮箱內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，分出部分鮮樣置于 –80 ℃冰箱中保存，供土壤總DNA提?。皇Ｓ嗤寥罉悠诽蕹参餁?bào)w和石塊后，風(fēng)干，研磨后分別過20目和100目篩，過20目篩土壤用于測(cè)定土壤pH、CEC，過100目篩土壤用于測(cè)定土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、全鉀及土壤重金屬含量。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 供試土壤基本性質(zhì)測(cè)定 供試土壤的基本理化性質(zhì)參照《土壤農(nóng)化分析》[21]相關(guān)方法測(cè)定。土壤Pb、Cd、Cu、Zn全量用王水-高氯酸消化[22]，土壤重金屬有效態(tài)含量采用DTPA浸提，其中Cu和Zn采用火焰原子吸收分光光度法測(cè)定，Cd、Pb采用石墨爐原子吸收分光光度法測(cè)定。

評(píng)價(jià)土壤重金屬污染水平高低，常用內(nèi)梅羅污染指數(shù)[23]表示。內(nèi)梅羅指數(shù)的計(jì)算公式如下：{[(均)2最大)2]/2}1/2，式中均和最大分別是平均單項(xiàng)污染指數(shù)和最大單項(xiàng)污染指數(shù)，內(nèi)梅羅指數(shù)的計(jì)算參照國(guó)家土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB15618-2008)。

表1為供試土壤樣品的基本理化性質(zhì)，因?yàn)樵囼?yàn)地是一直作為農(nóng)用地使用，各養(yǎng)分含量差異不顯著。表2是供試土壤樣品的重金屬全量和DTPA浸提有效態(tài)重金屬含量，根據(jù)國(guó)家土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)內(nèi)梅羅指數(shù)的計(jì)算結(jié)果表明，無(wú)污染稻田內(nèi)梅羅指數(shù)最低，污染區(qū)域越靠近污染源點(diǎn)的稻田，內(nèi)梅羅指數(shù)越高，且主要污染因子為Pb、Cd。

表1 供試土壤樣品基本性質(zhì)

表2 不同程度重金屬污染下土壤重金屬含量和內(nèi)梅羅綜合指數(shù)

注：同列數(shù)據(jù)小寫字母不同表示不同土樣間差異顯著 (< 0.05)；土壤綜合污染程度分級(jí)：綜≤0.7 安全；0.7＜綜≤1.0 警戒線；1.0＜綜≤2.0 輕污染；2.0＜綜≤3.0 中污染；綜＞3.0 重污染。

1.2.2 土壤微生物基因組DNA的提取 取0.30 g土樣提取總DNA，使用DNA快速提取試劑盒(Power Soil，Mo Bio公司)，按操作說明進(jìn)行。DNA提取完成后，用1.5% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量，并對(duì)土壤總DNA的濃度進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定采用NanoDrop ND-1000微量分光光度計(jì)。

1.2.3 土壤真菌豐度的測(cè)定——定量PCR技術(shù) 土壤真菌18S rRNA基因拷貝數(shù)采用熒光定量PCR的方法進(jìn)行測(cè)定。定量試劑采用SYBR?TM(Takara Bio, Otsu, Shiga, Japan)反應(yīng)液，實(shí)驗(yàn)在iCycler IQ5定量PCR儀(Bio-Rad, Hercules, CA)上進(jìn)行，定量反應(yīng)體系為20 μl，包括1 μl的DNA模板，10 μmol/L上、下游引物各0.4 μl，7.8 μl滅菌雙蒸水和10.4 μl擴(kuò)增酶混合物。所用引物及PCR擴(kuò)增程序見表3。

表3 定量PCR分析所用目的基因的引物序列及擴(kuò)增程序

1.2.4 Illumina HiSeq高通量測(cè)序 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，土壤微生物學(xué)研究專家開發(fā)出一系列研究土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的方法，如PCR-DGGE、PLFA、BIOLOG，而這些方法往往會(huì)低估土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，因其能夠較為全面和準(zhǔn)確地反映土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，并能較為客觀地反映其中低豐度的重要功能微生物等優(yōu)勢(shì)，已逐漸成為土壤微生物學(xué)研究中最先進(jìn)的測(cè)序手段。目前，應(yīng)用于微生物測(cè)序的常見平臺(tái)有 454、Illumina 測(cè)序平臺(tái)，其中Illmina公司包含有HiSeq和MiSeq測(cè)序平臺(tái)，基于Solexa技術(shù)，其基本原理是單分子簇邊合成邊測(cè)序(Sequencing by Synthesis，SBS)和dNTP可逆終止化學(xué)反應(yīng)，該測(cè)序方法的主要優(yōu)點(diǎn)是通量高、準(zhǔn)確率高以及成本低等[25-27]。本試驗(yàn)研究采用Illumina HiSeq高通量測(cè)序技術(shù)，圖1為測(cè)序原理圖，表4 是測(cè)序所用引物序列。

圖1 測(cè)序原理圖

表4 高通量測(cè)序引物序列

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

Illumina HiSeq高通量測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析：對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行QC之后，用usearch軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行去嵌合體和聚類的操作，usearch聚類時(shí)，先將reads按照豐度由大到小排序，通過97% 相似度的標(biāo)準(zhǔn)聚類，得到OUT，每個(gè)OUT被認(rèn)為可代表一個(gè)物種。在聚類過程中利用denovo方法去除嵌合體。接下來(lái)對(duì)每個(gè)樣品的tags進(jìn)行隨機(jī)抽平處理，并提取對(duì)應(yīng)的OUT序列。然后使用Qiime軟件，做alpha多樣性指數(shù)的稀釋曲線，根據(jù)稀釋曲線選擇合理的抽平參數(shù)，利用Qiime軟件對(duì)得到的抽平后OUT進(jìn)行分析，首先從OUT中分別提取一條reads作為代表序列，使用uclust方法，將該代表序列與ITS數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，從而對(duì)每個(gè)OUT進(jìn)行物種分類。歸類后，根據(jù)每個(gè)OUT中序列的條數(shù)，從而得到OUT豐度表，最后根據(jù)該OUT豐度進(jìn)行后續(xù)分析 (數(shù)據(jù)庫(kù)為：Findley ITS Database(ITS))。

數(shù)據(jù)處理用Excel 2003完成，采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(LSD法)，處理之間的顯著性分析均在<0.05 水平下進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測(cè)序序列預(yù)處理結(jié)果

不同程度重金屬污染水平下真菌群落結(jié)構(gòu)的變化通過Illumina HiSeq高通量測(cè)序進(jìn)行分析，高通量測(cè)序獲得了883 206條原始序列，除去質(zhì)量差的及嵌合體的序列，保留了863 969個(gè)序列，平均長(zhǎng)度為240.14 bp。利用usearch在0.97相似度下進(jìn)行聚類，對(duì)聚類后的序列進(jìn)行嵌合體過濾后得到1 926個(gè)OUT，平均每個(gè)樣品有544 ± 26.95個(gè)OUT。由于不同樣本對(duì)應(yīng)的reads數(shù)量差距較大，為了保證后期分析結(jié)果合理，對(duì)每個(gè)樣本的數(shù)據(jù)進(jìn)行隨機(jī)抽平處理，抽平參數(shù)根據(jù)alpha多樣性指數(shù)的稀釋曲線確定為39 705條reads，抽平后總OUT數(shù)是1 926，平均OUT數(shù)是543.81。

2.2 不同程度重金屬污染土壤的真菌豐度及多樣性分析

由表5可知，與對(duì)照P0相比，重金屬污染土壤的真菌豐度均顯著減少，但不同濃度重金屬污染處理之間的差異不顯著。真菌的香濃指數(shù)和辛普森指數(shù)均沒有顯著差異，但是重金屬污染對(duì)真菌的豐富度有顯著影響，與對(duì)照相比，P5處理Chao1指數(shù)雖然增加，但是差異不顯著，中、低濃度重金屬污染差異顯著，豐富度指數(shù)顯著降低，且隨著污染程度的降低，豐富度指數(shù)降低。

表5 不同程度重金屬污染土壤真菌的豐度、多樣性指數(shù)及豐富度指數(shù)

注：同列數(shù)據(jù)小寫字母不同表示不同土樣間差異顯著(< 0.05)。

2.3 不同程度重金屬污染土壤的真菌群落結(jié)構(gòu)主坐標(biāo)分析

通過對(duì)不同程度重金屬污染下土壤真菌的主坐標(biāo)分析發(fā)現(xiàn)(圖2)，各處理間真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的變化。PC1、PC2、PC3影響因素對(duì)樣品處理差異的貢獻(xiàn)率分別為35.96%、21.48%、11.71%，并將離污染源不同距離的采樣點(diǎn)明顯區(qū)分，大致呈現(xiàn)隨著距污染源距離由遠(yuǎn)到近，PC1值呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢(shì)。P5樣品作為高濃度重金屬污染樣品，與其余處理明顯分開，說明該樣品的真菌群落結(jié)構(gòu)組成與其他樣品有顯著差異，P3、P4樣品作為中濃度重金屬污染樣品其真菌群落結(jié)構(gòu)組成較相近，P1、P2樣品作為低濃度重金屬污染樣品其真菌群落結(jié)構(gòu)組成較相近，且高中低3個(gè)程度重金屬污染樣品與對(duì)照P0相比，真菌群落結(jié)構(gòu)組成差異顯著。

2.4 不同程度重金屬污染土壤的真菌類群分析

由圖3可知，在所有土壤樣品中檢測(cè)到7個(gè)真菌門，子囊菌門(Ascomycota)為最優(yōu)勢(shì)門，其次是接合菌門(Zygomycota)和擔(dān)子菌門(Basidiomycota)，相對(duì)豐度較少的是壺菌門(Chytridiomycota)、球囊菌門(Glomeromycota)、Rozellomycota和新麗鞭毛菌門(Neocallimastigomycota)。其中Basidiomycota隨著重金屬污染程度增加其相對(duì)豐度減少，而Chytridiom-ycota隨著重金屬污染程度增加其相對(duì)豐度增加，但是這兩個(gè)門的真菌豐度在不同污染水平下差異均不顯著；Zygomycota的相對(duì)豐度隨著重金屬污染程度降低而顯著增加，與對(duì)照P0相比，P3、P4樣品其豐度差異不顯著，P1、P2樣品中顯著降低，在P5中最?。籄scomycota在重金屬污染樣品中的豐度與對(duì)照P0相比均顯著增加；與對(duì)照P0相比，Glomeromycota相對(duì)豐度隨著樣品受重金屬污染程度增加而增大，P4處理相對(duì)豐度最大；Rozellomycota的相對(duì)豐度在高污染樣品P5中最高，并與其他處理相比差異顯著；Neocallimastigomycota在P3樣品中豐度最高，與其他處理相比差異顯著。

進(jìn)一步分析不同程度重金屬污染對(duì)不同真菌屬水平分布產(chǎn)生的影響，由表6可知，糞傘屬()、假酵母狀菌屬()及煙管霉屬()在各土樣間均不存在顯著差異。被孢霉屬()在P0樣品中豐度最大，與P3、P4土樣差異不顯著，與其他土樣相比差異顯著，且高濃度重金屬污染的P5樣品其豐度最小。擬拱頂菌屬()和單端孢霉屬()均在P1樣品中豐度最高，且與其他樣品差異顯著；田頭菇屬()在P2樣品中豐度最高，且與其他樣品差異顯著。這表明此3種真菌在較低濃度重金屬污染中可以正常生長(zhǎng)，甚至低濃度重金屬會(huì)刺激其生長(zhǎng)，增加其豐度；但高濃度重金屬污染，毒性增強(qiáng)，會(huì)抑制其生長(zhǎng)，從而降低其相對(duì)豐度。離殼菌屬()和菇屬()均在P0樣品中其豐度最高，且與其他樣品處理差異顯著，這表明這兩種真菌屬對(duì)重金屬污染敏感，重金屬污染顯著影響其生長(zhǎng)。穗葡萄孢菌屬()在高濃度重金屬污染樣品P5中豐度最高，且與其他樣品中的豐度有顯著差異，說明這種真菌在高濃度重金屬污染土壤中可以更好地生長(zhǎng)，高濃度重金屬污染促進(jìn)其生長(zhǎng)。木霉屬()在高濃度重金屬污染樣品P5中豐度最低，顯著低于其他土壤樣品，說明高濃度重金屬污染抑制其生長(zhǎng)。鐮刀菌()的相對(duì)豐度在P0與P1、P2、P3沒有顯著差異，在P4、P5樣品中顯著降低，表明鐮刀菌不耐高濃度重金屬污染，當(dāng)重金屬污染程度較大時(shí)其豐度顯著降低。水玉霉屬()、四枝孢霉屬()、無(wú)足孢殼屬()及根囊壺菌屬()這4個(gè)真菌屬均在P0和P5樣品中其豐度出現(xiàn)顯著差異，P0與其他樣品均沒有顯著差異，說明這4種真菌能承受一定濃度的重金屬污染，當(dāng)重金屬污染程度較大時(shí)，其生長(zhǎng)遭到抑制，豐度顯著降低。類球囊霉屬()在P4樣品中其豐度最大，與其他處理的差異顯著，在P0樣品中豐度最小，表明這種真菌隨著重金屬污染程度的增加，其豐度增加，當(dāng)達(dá)到最適重金屬濃度時(shí)達(dá)到最大豐度，重金屬污染程度再增加會(huì)降低其豐度。

圖2 不同程度重金屬污染土壤的真菌主坐標(biāo)分析

圖3 不同程度重金屬污染土壤中主要真菌門的相對(duì)豐度

2.5 不同程度重金屬污染土壤的真菌群落結(jié)構(gòu)組成與環(huán)境因子的冗余分析

為進(jìn)一步了解土壤不同重金屬污染元素與真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性變化的對(duì)應(yīng)關(guān)系，引入了RDA分析。由圖4可知，重金屬污染對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)的影響顯著，影響程度最大的環(huán)境因子是全量Pb和全量Cu，其次是有效態(tài)Cu和Pb。其中全量Pb與Cd、Zn呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與Cu是正相關(guān)關(guān)系；有效態(tài)Zn與Cd呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與Cu、Pb呈正相關(guān)關(guān)系?？偭縋b對(duì)樣品的影響程度最大，對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)的影響差異顯著。

表6 不同程度重金屬污染下土壤優(yōu)勢(shì)真菌屬的相對(duì)豐度(%)

注：數(shù)據(jù)是平均值，同一行數(shù)據(jù)小寫字母不同表示同一真菌屬相對(duì)豐度在不同土樣間差異達(dá)到<0.05顯著水平。

圖4 不同程度重金屬污染土壤真菌冗余分析(RDA)

3 討論

不同重金屬元素對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)影響不同。本研究通過RDA分析發(fā)現(xiàn)，重金屬Pb和Cu污染對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)的影響最顯著，Cd次之，Zn的影響最小，且Cd、Pb、Cu和Zn 4種金屬元素對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)的復(fù)合效應(yīng)機(jī)制表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)和拮抗效應(yīng)并存，這與韓桂琪等[28]研究結(jié)果相似。在對(duì)重金屬污染下紅壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化的研究中發(fā)現(xiàn)，Cd、Cu對(duì)供試土壤微生物學(xué)指標(biāo)的毒性影響較為明顯，Zn次之，Pb的影響最小[29]；楊曄等[30]認(rèn)為Cd對(duì)真菌的抑制比較明顯。造成這種不同重金屬元素影響能力不同的原因可能是供試土樣的重金屬元素濃度、土壤類型和基本性質(zhì)等不同，從而使不同重金屬元素的生物毒性出現(xiàn)差異。

野外長(zhǎng)期的重金屬污染會(huì)顯著降低真菌豐度，改變土壤中微生物耐性菌的比例。通過分析不同程度重金屬污染下稻田土壤真菌屬水平下的相對(duì)豐度變化情況可知，類球囊霉屬、青霉屬等真菌其相對(duì)豐度均在重金屬污染嚴(yán)重的土壤樣品中存在顯著增加趨勢(shì)，其中類球囊霉屬隨著重金屬污染程度增加，其相對(duì)豐度顯著增高，說明這類真菌對(duì)重金屬有一定的耐性。這與孔凡美[31]的研究結(jié)果相似，其在沈陽(yáng)礦區(qū)重金屬污染土壤中發(fā)現(xiàn)類球囊霉屬的相對(duì)豐度顯著增高，而類球囊霉屬中有些菌種屬于叢枝菌根真菌，對(duì)重金屬污染具有較強(qiáng)的耐性和適應(yīng)能力，這些叢枝菌根真菌能夠改善植物生長(zhǎng)狀況，減輕重金屬對(duì)植物的毒害。杜立棟等[32]研究發(fā)現(xiàn)某株青霉菌真菌可富集土壤中的可溶態(tài)鉛離子，最高富集率達(dá)96.54%，而青霉能夠產(chǎn)生草酸與重金屬發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，生成不溶性的草酸鹽，減少Pb的毒性。在高濃度銅離子培養(yǎng)基中，真菌抗銅菌株青霉可以誘導(dǎo)細(xì)胞合成高濃度的甘油幫助其排出過量的銅離子[33]。這些研究結(jié)果均表明，重金屬污染會(huì)增加耐性菌的數(shù)量，改變土壤中的優(yōu)勢(shì)菌群結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步改變微生物群落結(jié)構(gòu)。

重金屬污染還會(huì)顯著影響土壤中敏感菌的比例。本研究中被孢霉屬、離殼菌屬與菇屬對(duì)重金屬比較敏感，在重金屬污染水稻土中其相對(duì)豐度均明顯降低，且被孢霉屬相對(duì)豐度隨著重金屬污染程度增加而顯著降低。被孢霉屬可生產(chǎn)多不飽和脂肪酸，是被認(rèn)為最有前途的工業(yè)生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的微生物，而且被孢霉屬有的菌種可以兼性寄生于線蟲卵囊、卵和雌蟲，殺死線蟲[34-35]。木霉屬和鐮刀菌的相對(duì)豐度只在重金屬污染嚴(yán)重的土壤樣品中顯著降低，可能原因是這兩種真菌具有一定的重金屬抗性，但是當(dāng)重金屬濃度過高時(shí)，其生長(zhǎng)受到顯著抑制，相對(duì)豐度顯著降低。木霉屬的某些菌種如綠色木霉菌對(duì)重金屬污染有一定的耐受能力，能耐受Pb2+濃度為2 000 mg/L[36]，已有研究也發(fā)現(xiàn)了一種耐受重金屬的非致病內(nèi)生尖孢鐮刀菌可以促進(jìn)超積累植物提取和積累重金屬的功能[37]，而從鉛鋅尾礦廢棄地分離出耐重金屬Cd的尖孢鐮刀菌的耐Cd濃度是15 mmol/L[38]。

這些研究均表明，長(zhǎng)期重金屬污染脅迫會(huì)改變真菌群落結(jié)構(gòu)組成，使某些在沒有污染脅迫的土壤中不占優(yōu)勢(shì)，但具有某些特殊功能而在重金屬污染環(huán)境中正常生活的微生物成為優(yōu)勢(shì)種群。造成這種現(xiàn)象的可能原因是，重金屬污染脅迫改變?cè)械娜郝浣Y(jié)構(gòu)內(nèi)部種群競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，導(dǎo)致原來(lái)的優(yōu)勢(shì)種群失去優(yōu)勢(shì)地位，耐性菌群快速生長(zhǎng)，成為重金屬污染環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)種群[39]；或者是一部分微生物在長(zhǎng)期重金屬污染環(huán)境中產(chǎn)生的重金屬抗性，保護(hù)了其他種群的微生物，從而使重金屬污染土壤的優(yōu)勢(shì)種群發(fā)生了明顯改變[40]。

4 結(jié)論

綜上所述，重金屬污染會(huì)顯著改變土壤真菌的豐度和群落結(jié)構(gòu)，其中重金屬Pb和Cu對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)的影響最大，且隨著污染程度增加，真菌群落結(jié)構(gòu)組成發(fā)生了顯著變化，抗逆真菌相對(duì)數(shù)量和種類顯著增加，敏感真菌的相對(duì)數(shù)量急劇減少，如對(duì)重金屬較敏感的被孢霉屬等的相對(duì)豐度顯著降低，而耐性菌如類球囊霉屬的相對(duì)豐度顯著增加，敏感菌降低，耐性菌增加，且隨著污染程度的增加，微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)一步分化，這使得微生物群落對(duì)環(huán)境脅迫的適應(yīng)能力進(jìn)一步增強(qiáng)。

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Effects of Different Gradients of Heavy Metal Contamination on Soil Fungi Community Structure in Paddy Soils

YAN Hua, OUYANG Ming, ZHANG Xuhui*, YING Duo, ZHAO Xijun, ZHANG Yujiao, ZHENG Jufeng, LIU Xiaoyu, BIAN Rongjun, LI Lianqing, PAN Genxing

(Institute of Resource, Ecosystem and Environment of Agriculture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Fungi community structure in paddy soils in south Jiangsu under different gradients of heavy metal pollution was analyzed in order to study the impact of heavy metal pollution on the microbial variability. The results showed that heavy metal pollution has significant impact on fungi number and community structure in paddy soil. Principal coordinate analysis (PCoA) revealed that the first and second components accounted for 35.96% and 21.48% of contribution rates, respectively. The results of redundancy analysis (RDA) showed that Pb and Cu greatly influenced fungi community structure. Relative abundance analysis of fungi at genus taxonomic level showed that heavy metal pollution significantly reduced the population of sensitive fungi but increased the population of patience fungi. Sensitive fungi genus included Mortierella, Trichoderma, Apodus and Hypholoma, wheras patience fungi genus included Paraglomus, Tetracladium and Rhizophydium. In conclusion, heavy metal-contamination can significantly influences soil fungi community structure in paddy soils, increasing heavy metal concentration can increase the population and diversity of heavy metal tolerant fungi and decrease sensitive fungi, which furtherly increases the differentiation of the structure of fungi community.

Heavy metal pollution; Paddy soil; Fungi community structure; Illumina HiSeq sequencing

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41471193)和江蘇高校品牌專業(yè)建設(shè)工程項(xiàng)目(PPZY2015A061)資助。

(xuhuizhang@njau.edu.cn)

閆華(1990—)，女，山東棗莊人，碩士研究生，主要研究方向?yàn)橥寥拉h(huán)境學(xué)。E-mail: 2014103102@njau.edu.cn

10.13758/j.cnki.tr.2018.03.011

X53；S154

A