酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定中封閉液的作用與選擇

張繼忠

摘 要 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化和抗原或抗體的酶標(biāo)記。測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）需先與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)，結(jié)合在固相載體表面（包被）。由于抗原或抗體包被時(shí)的濃度較低，故還需用大量不相關(guān)的蛋白充填固相載體表面空隙（封閉），使之避免在ELISA其后步驟中吸附干擾物質(zhì)而影響測(cè)定。本文概要介紹ELISA中各種常用封閉液的作用與選擇。

關(guān)鍵詞 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 封閉液 包被物

中圖分類(lèi)號(hào)：R446.61 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2018）11-0064-03

Role of blocking solution in enzyme-linked immunosorbent assay and its selection

ZHANG Jizhong*

（Biopharmaceutical Department， Shanghai Pharmaceutical School， Shanghai 200135， China）

ABSTRACT Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） is based on the immobilization of antigen or antibody and the enzymatic labeling of antigen or antibody. At the time of determination， the specimen to be examined （antibody or antigen therein） needs to first react with the antigen or antibody on the surface of the solid support and then bind to the surface of the solid support （coating）. Due to the low concentrations of the coated antigen or antibody， a large amount of irrelevant proteins are also needed to fill the spacing on the solid support surface （closed）， thus to avoid adsorption of interfering substances that may affect the determination in the subsequent steps of the ELISA. The role and selection of various commonly used blocking solutions in ELISA are outlined in this article.

KEy WORDS enzyme-linked immunosorbent assay； blocking solution； coating substance

自1971年Engvall和Perlmann發(fā)表了應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）法定量測(cè)定免疫球蛋白G的論文后，1966年開(kāi)始用于抗原定位的酶標(biāo)抗體技術(shù)逐漸發(fā)展成為測(cè)定液體標(biāo)本中微量物質(zhì)的常用方法。

ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化和酶標(biāo)記。結(jié)合于固相載體表面的抗原或抗體仍保留了其免疫學(xué)活性，而酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留了抗原或抗體的免疫學(xué)活性，又保留了酶的活性。測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本與固相載體表面的抗原或抗體發(fā)生反應(yīng)，隨后加入的酶標(biāo)記的抗原或抗體也會(huì)通過(guò)反應(yīng)結(jié)合于固相載體上。此時(shí)固相載體上的酶量與標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)的量呈一定的比例關(guān)系。再加入酶反應(yīng)底物，底物被酶催化形成有色產(chǎn)物，因該產(chǎn)物的量與待測(cè)物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)其呈色深淺用于定性或定量分析。ELISA的敏感度很高，重復(fù)性亦好。

1 ELISA中的封閉及常用封閉液

抗原或抗體包被時(shí)的濃度較低，固相載體吸附后其表面尚有未被抗原或抗體占據(jù)的空隙。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白充填這些空隙，從而使之避免在ELISA其后步驟中吸附干擾物質(zhì)、影響測(cè)定。換言之，封閉是固相載體繼被抗原或抗體包被后再為高濃度的無(wú)關(guān)蛋白溶液（被稱(chēng)為“封閉液”）包被的過(guò)程。

理想的封閉液應(yīng)滿足以下條件：①抑制待測(cè)物質(zhì)與固相載體表面的非特異性結(jié)合；②抑制非特異性蛋白-蛋白相互作用；③不與其后加入的試劑（抗體、蛋白A等）發(fā)生交叉反應(yīng)；④能減少待測(cè)物質(zhì)因相轉(zhuǎn)變而發(fā)生的蛋白變性或幫助其復(fù)性；⑤與酶及可影響測(cè)定結(jié)果的其他物質(zhì)的反應(yīng)性低；⑥不會(huì)引起特異性蛋白或活性分子與固相載體表面的脫結(jié)合；⑦與固相載體表面的結(jié)合牢固，批間重復(fù)性好。

常用的封閉劑有牛血清白蛋白（bovine serum albumin， BSA）、脫脂奶粉、明膠、全血清和乳化劑等[1]。

1.1 BSA

BSA的常用濃度為1% ～ 3%。BSA的售價(jià)較便宜，且可在4 ℃下以固體形態(tài)干燥保存或用滅菌水配成溶液保存。BSA用作封閉劑已獲普遍認(rèn)可，其可很好地與中、高吸附強(qiáng)度的固相載體表面結(jié)合，且與蛋白A相容。

BSA封閉液的缺點(diǎn)是：①存在批間差異性，主要由所含脂肪酸引起，故BSA用作封閉劑時(shí)應(yīng)盡可能地降低其中的脂肪酸含量；②含有磷酸酪氨酸，會(huì)與抗磷酸酪氨酸抗體發(fā)生交叉反應(yīng)；③會(huì)發(fā)生抗體與BSA-半抗原（小分子半抗原，單獨(dú)不會(huì)引起免疫反應(yīng)，但BSA與之結(jié)合后則可引起免疫反應(yīng)）結(jié)合物的交叉反應(yīng)；④不能封閉離子型、共價(jià)型和具疏水性的固相載體表面。

1.2 脫脂奶粉和酪蛋白

脫脂奶粉的常用濃度為0.1% ～ 5%，其售價(jià)相對(duì)便宜，但批間質(zhì)量差異較大。有研究顯示，在候選的幾種脫脂奶粉中只有一種有可接受的批間一致性和穩(wěn)定性[2]。此外，無(wú)論是國(guó)產(chǎn)、還是進(jìn)口的脫脂奶粉，如保存不當(dāng)，都會(huì)很快變質(zhì)。酪蛋白是脫脂奶粉的組分之一，其能用作一種穩(wěn)定的封閉劑。

脫脂奶粉在緩沖溶液中較純酪蛋白更易分散。鑒于這個(gè)特點(diǎn)，脫脂奶粉對(duì)一些硬塑料制固相載體表面的封閉效果較純酪蛋白好。但脫脂奶粉封閉液也存在著一些與反應(yīng)性相關(guān)的缺點(diǎn)：①含有磷酸酪蛋白，會(huì)與抗磷酸酪蛋白抗體發(fā)生交叉反應(yīng)；②有些脫脂奶粉含有組蛋白，會(huì)干擾抗DNA抗體的測(cè)定；③有些脫脂奶粉含有可抑制堿性磷酸酶活性的成分；④會(huì)與親合素發(fā)生交叉反應(yīng)。

1.3 明膠

明膠用作封閉劑也較普遍，但其有一些較大的缺點(diǎn)：①單用明膠封閉液的封閉效果較差；②明膠主要通過(guò)蛋白-蛋白相互作用產(chǎn)生封閉作用，但其有時(shí)亦會(huì)遮蔽特異性的固相載體表面結(jié)合蛋白，從而影響免疫反應(yīng)性；③明膠較差的封閉效果和蛋白遮蔽性質(zhì)還會(huì)導(dǎo)致測(cè)定時(shí)的系統(tǒng)本底偏高和敏感性降低；④明膠同樣存在批間質(zhì)量差異問(wèn)題。

明膠封閉液的最大特點(diǎn)是不會(huì)與哺乳動(dòng)物抗體和蛋白A發(fā)生交叉反應(yīng)。

1.4 全血清

對(duì)于非常困難的固相載體表面封閉，一般推薦選用10%全血清。后者由于所含分子的多樣性，能有效封閉固相載體表面的非特異性位點(diǎn)。

用作封閉劑的全血清應(yīng)盡量不選用兔或鼠來(lái)源的，因這兩種來(lái)源的全血清在親緣關(guān)系上與人類(lèi)的非常接近，故與人抗體發(fā)生交叉反應(yīng)的幾率較大，會(huì)導(dǎo)致測(cè)定時(shí)的系統(tǒng)本底偏高[3]。應(yīng)選用來(lái)源于小牛、山羊等的全血清。

1.5 非蛋白物質(zhì)

甲醛可與聚偏氟乙烯制固相載體表面的微結(jié)構(gòu)反應(yīng)或結(jié)合，使之失去與蛋白結(jié)合的疏水力或空間結(jié)構(gòu)域。

吐溫-20是一種非離子型去污劑，有使抗原復(fù)性的作用，可為固相載體表面疏水性吸附，具有很強(qiáng)的非特異性吸附洗脫作用，同時(shí)可降低蛋白間的疏水性相互作用，提高特異性抗體識(shí)別能力。不過(guò)，吐溫-20封閉液的封閉效果不穩(wěn)定，易被水或緩沖液洗脫。因此，在吐溫-20單獨(dú)用作一種封閉劑時(shí)，后續(xù)操作中的稀釋液和緩沖液里均應(yīng)有一定量的吐溫-20成分。吐溫-20與蛋白類(lèi)封閉劑聯(lián)用可洗脫其他已非特異性結(jié)合至固相載體表面的雜蛋白，此在ELISA中非常有用。但在脂多糖的測(cè)定中不能使用吐溫-20封閉液，因兩者間會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)。

2 固相載體與封閉液的匹配

固相載體在ELISA中用作吸附劑和容器，不參與各種反應(yīng)?？捎米鱁LISA中固相載體的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。后者具有較強(qiáng)的蛋白吸附能力，抗體或蛋白類(lèi)抗原被其吸附后仍保留原有的免疫學(xué)活性，加之價(jià)廉，在ELISA中得到廣泛應(yīng)用。

2.1 不活潑的固相載體

1）疏水性固相載體 疏水性固相載體的吸附能力在不活潑固相載體中居中等，其表面可被吐溫-20或蛋白類(lèi)封閉液很好地封閉。研究表明，聯(lián)用0.02%吐溫-20和1% BSA的封閉效果更好，可用作大多數(shù)疏水性固相載體表面的理想封閉液[4]。

2）兼有疏水型和離子型結(jié)合位點(diǎn)的固相載體 這是一類(lèi)具有高吸附能力的固相載體，與免疫球蛋白G的結(jié)合能力很強(qiáng)，但對(duì)其表面的封閉較疏水性固相載體困難，聯(lián)用0.02%吐溫-20和一種蛋白類(lèi)封閉液（1% BSA、0.2%脫脂奶粉或10%全血清等）可有效減少抗體的非特異性結(jié)合。

3）高電荷非疏水性固相載體 這類(lèi)固相載體只適用于小分子離子型物質(zhì)的包被，因此其表面封閉也應(yīng)選用相對(duì)分子量較小的封閉劑，以免遮蔽包被物，同時(shí)選用的封閉劑還需有一定的離子特性，以利于與帶電荷的固相載體表面發(fā)生相互作用。對(duì)高電荷非疏水性固相載體表面的封閉，一般可選用1% ～ 3%的BSA和0.2% ～ 2%的脫脂奶粉作為封閉液，但當(dāng)包被的活性分子為小分子物質(zhì)時(shí)，則須選用10%氨基乙醇等作為封閉液。

2.2 共價(jià)型固相載體

1）胺類(lèi)固相載體 對(duì)這類(lèi)固相載體表面的封閉，應(yīng)選用與惰性疏水性、離子型和共價(jià)型結(jié)合位點(diǎn)均可發(fā)生相互作用的蛋白類(lèi)封閉液。如無(wú)特殊要求，一般選用0.2% ～ 2%的脫脂奶粉為封閉液。吐溫-20不能用于封閉胺類(lèi)固相載體表面，但在洗液中加入吐溫-20可增強(qiáng)對(duì)固相載體表面吸附的非結(jié)合性活性分子的洗脫能力。

2）預(yù)激活共價(jià)型固相載體 這類(lèi)固相載體含有疏水性和共價(jià)型結(jié)合位點(diǎn)，兼性蛋白是其表面封閉的最好選擇。

3 ELISA中封閉液的選用

3.1 與固相載體的關(guān)聯(lián)

固相載體是ELISA中的重要組成部分，其分為不活潑的和共價(jià)型兩大類(lèi)，由于與測(cè)定相關(guān)的所有反應(yīng)均發(fā)生于固相載體表面，所以固相載體對(duì)封閉液的選用有較大的影響。

疏水性和高電荷非疏水性固相載體均對(duì)封閉液有所要求，其中高電荷非疏水性固相載體因只適用于小分子離子型物質(zhì)的包被，故其封閉液也應(yīng)選用相對(duì)分子量較小的物質(zhì)如氨基乙醇等來(lái)制備（常用濃度為10%）。不過(guò)，對(duì)同時(shí)含有疏水型和離子型結(jié)合位點(diǎn)的固相載體，封閉液的選用主要取決于待測(cè)活性分子的種類(lèi)而非固相載體本身。

3.2 與包被物的關(guān)聯(lián)

目前常用的封閉液如牛血清白蛋白、脫脂奶粉、明膠、小牛血清等溶液均對(duì)包被物沒(méi)有影響，但在制備酶聯(lián)板的過(guò)程中需對(duì)板進(jìn)行徹底的沖洗，以洗脫未包被在板上的封閉液內(nèi)蛋白和包被物，提高測(cè)定時(shí)的特異性和降低系統(tǒng)本底。

3.3 與待測(cè)活性分子的關(guān)聯(lián)

聯(lián)用0.02%吐溫-20和一種蛋白類(lèi)封閉液（1% BSA、0.2%脫脂奶粉或10%全血清等）能有效減少固相載體表面與抗體或抗原的非特異性結(jié)合，其中蛋白類(lèi)封閉液的選用取決于待測(cè)活性分子的種類(lèi)。

3.4 封閉劑本身的特點(diǎn)

常用的封閉劑有BSA、脫脂奶粉、明膠、全血清、吐溫-20等?？偟膩?lái)說(shuō)，脫脂奶粉是一種非常出色的封閉劑。由于具有分子多樣性和兼性的特點(diǎn)，對(duì)許多共價(jià)型固相載體表面來(lái)說(shuō)，脫脂奶粉是首選的封閉劑。

全血清（小牛血清、山羊血清）為血清類(lèi)封閉劑，但其封閉液的制備較其他封閉液復(fù)雜，主要體現(xiàn)在滅菌方面，傳統(tǒng)的氣壓式蒸汽滅菌或滅活均會(huì)降低其封閉效果，所以一般采用0.22 μm膜過(guò)濾滅菌，在滅菌量過(guò)小時(shí)有操作不便的弊端。

BSA、明膠、吐溫-20一般不單獨(dú)用作封閉劑，它們基本上多是與其他類(lèi)封閉劑以適當(dāng)比例混合后聯(lián)用的，其中聯(lián)用0.02%吐溫-20和1% BSA可用作大多數(shù)具有中等吸附能力的固相載體表面的理想封閉液。

4 結(jié)語(yǔ)

使用封閉液的目的在于提高ELISA的準(zhǔn)確性，而選用封閉液則需考慮多種因素，包括固相載體的類(lèi)型、待測(cè)活性分子的種類(lèi)和封閉液自身的特點(diǎn)等。適宜的封閉液應(yīng)能抑制各種非特異性結(jié)合，且不會(huì)與待測(cè)物質(zhì)和檢測(cè)試劑發(fā)生相互作用。

參考文獻(xiàn)

[1] 焦奎， 張書(shū)圣. 酶聯(lián)免疫分析技術(shù)及應(yīng)用[M]. 北京： 化學(xué)工業(yè)出版社， 2004： 96-107.

[2] Gibbs J. Effective blocking procedures. ELISA technical bulletin No. 3 [EB/OL]. [2018-01-17]. http：//www.doc88. com/p-7864239831977.html.

[3] 李秀玲， 倪道明. 人抗動(dòng)物抗體對(duì)免疫學(xué)測(cè)定的干擾作用[J]. 國(guó)外醫(yī)學(xué)：預(yù)防、診斷、治療用生物制品分冊(cè)， 2001， 24（6）： 266-270.

[4] 劉蘇燕， 董邦全， 周雪慧， 等. 吐溫20、BSA和8種血清在ELISA中抑制作用的比較[J]. 天津醫(yī)藥， 1991， 19（6）： 373-374.