等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)在病原體檢測(cè)中的應(yīng)用

彭 志, 陳剛毅, 劉雪飛, 黃新河*

1.西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院, 成都 611756;2.中國科學(xué)院成都生物研究所, 成都 611041

由病原體引起的感染性疾病一直嚴(yán)重威脅著人體健康，其可分為傳染性和非傳染性。而抗生素是用于預(yù)防和治療細(xì)菌性傳染病的重要藥物，但抗生素的濫用導(dǎo)致具有多重耐藥性的菌株不斷產(chǎn)生，極大地增加了臨床治療的難度，也導(dǎo)致了嚴(yán)重的公共衛(wèi)生污染問題。與此同時(shí)，各種流感病毒的變異速度也不斷加快，使病毒性疾病的防控和治療面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。病原體檢測(cè)是傳染病防控的重要環(huán)節(jié)，然而，傳統(tǒng)的病原體檢測(cè)方法存在耗時(shí)長、對(duì)培養(yǎng)環(huán)境要求高、檢測(cè)的樣品量少、檢測(cè)價(jià)格高等弊端，難以滿足臨床需求。隨著分子生物學(xué)研究的發(fā)展和深入，快速、準(zhǔn)確、低成本、高通量、適用范圍廣的核酸檢測(cè)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于病原體檢測(cè)中。

脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)對(duì)于所有形式的生命都是至關(guān)重要的，同時(shí)核酸也是生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)診斷中的重要生物標(biāo)志物[1]。隨著核酸研究工作的不斷開展，核酸擴(kuò)增成為基礎(chǔ)研究、傳染病防控、臨床診斷等領(lǐng)域非常重要的工具。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)是目前使用最為廣泛的核酸擴(kuò)增技術(shù)[2]，但PCR有其固有的局限性，如擴(kuò)增過程需要升降溫度，對(duì)PCR儀的依賴性較強(qiáng)，同時(shí)對(duì)操作人員的專業(yè)技術(shù)要求較高等，從而使其耗時(shí)長、成本高，難以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

自20世紀(jì)90年代以來，產(chǎn)生了多種等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，其共同特點(diǎn)是可在固定的溫度條件下實(shí)現(xiàn)核酸的快速擴(kuò)增或檢測(cè)。由于反應(yīng)不依賴熱循環(huán)，檢測(cè)成本大幅降低，且可實(shí)現(xiàn)對(duì)食品、農(nóng)作物和病原體等現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，極大地提高了檢測(cè)效率。在現(xiàn)有的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)中，關(guān)于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的研究開展最多，其應(yīng)用也最為廣泛。其他較為常見的等溫?cái)U(kuò)增方法有依賴核酸序列擴(kuò)增、依賴解旋酶擴(kuò)增、重組酶聚合酶擴(kuò)增。本文綜述了上述等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的核酸擴(kuò)增原理、重要特性及其在病原體檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展，以期為此類技術(shù)的推廣和應(yīng)用提供參考。

1 等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)

得益于分子生物學(xué)和體外模擬核酸擴(kuò)增技術(shù)的快速發(fā)展，自20世紀(jì)90年代初以來，已開發(fā)了數(shù)十種采用各種放大機(jī)制的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)。其中，大多數(shù)技術(shù)對(duì)于核酸的檢測(cè)具有相當(dāng)高的靈敏度，且部分技術(shù)已經(jīng)取得了商業(yè)上的成功[3,4]。因而，在此綜述幾種研究較多、應(yīng)用較廣的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的原理、特性等，如依賴核酸序列擴(kuò)增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、依賴解旋酶擴(kuò)增(helicase-dependent amplification，HDA)、重組酶聚合酶擴(kuò)增(recombinase polymerase amplification，RPA)。

1.1 依賴核酸序列擴(kuò)增技術(shù)

依賴核酸序列擴(kuò)增技術(shù)是1991年由Compton[5]提出的用于擴(kuò)增單鏈RNA序列的技術(shù)。其過程依賴于3種酶：禽成髓細(xì)胞瘤病毒(avian myeloblastosis virus，AMV)反轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶H(RNase H)和T7 RNA聚合酶，以及2種特異性引物：引物1的3′端與目標(biāo)序列的3′端互補(bǔ)，5′端帶有可被T7 RNA聚合酶識(shí)別的啟動(dòng)子，而引物2來源于目標(biāo)序列的5′端。

其擴(kuò)增單鏈RNA中特定序列的過程可分為非循環(huán)階段和循環(huán)階段。在非循環(huán)階段，引物1與模板RNA中的目標(biāo)序列結(jié)合，在AMV反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，從引物1的3′端開始延伸，合成模板RNA的1個(gè)cDNA拷貝，從而形成RNA:DNA雜合體，再由RNase H消化RNA，余下的單鏈DNA與引物2結(jié)合，與啟動(dòng)子區(qū)域互補(bǔ)，形成雙鏈DNA。T7 RNA聚合酶通過識(shí)別啟動(dòng)子，將其轉(zhuǎn)錄為與初始RNA互補(bǔ)的目標(biāo)序列RNA(-)，每個(gè)初始RNA可產(chǎn)生100個(gè)拷貝，而新合成的RNA(-)又可作為循環(huán)階段的模板。在循環(huán)階段，引物2先與模板結(jié)合，并在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下延伸，從而形成RNA:DNA雜合體，再由RNase H消化RNA。而引物1與余下的單鏈DNA結(jié)合，反轉(zhuǎn)錄合成帶有啟動(dòng)子的雙鏈DNA，然后在T7 RNA聚合酶的作用下，又轉(zhuǎn)錄為RNA(-)。

上述步驟不斷循環(huán)最終獲得大量的與初始RNA互補(bǔ)的目標(biāo)序列RNA(-)。在41℃條件下，NASBA技術(shù)在1.5～2 h內(nèi)可實(shí)現(xiàn)109倍的擴(kuò)增，擴(kuò)增效率與逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-PCR，RT-PCR)相當(dāng)。由于單鏈RNA易產(chǎn)生二級(jí)結(jié)構(gòu)，因此，擴(kuò)增復(fù)雜的RNA需要先于65℃孵育消除二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而更利于擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行。此外，由于RNA易降解，所以整個(gè)擴(kuò)增和檢測(cè)反應(yīng)都需要嚴(yán)格控制反應(yīng)條件以防止RNA降解。NASBA也可用于DNA的擴(kuò)增，最常用的方式是在擴(kuò)增前將DNA加熱變性，再依照同樣的原理和步驟進(jìn)行反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物仍是RNA[6]。

1.2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)于2000年首次被Notomi等[7]提出，受到了世界衛(wèi)生組織、各國學(xué)者和相關(guān)政府部門的高度關(guān)注。之后，關(guān)于LAMP技術(shù)的研究陸續(xù)開展。該方法利用4條引物[外引物F3和B3、正向內(nèi)引物(forward inner primer，F(xiàn)IP)和反向內(nèi)引物(backward inner primer，BIP)]來識(shí)別待擴(kuò)增的DNA序列兩端的6個(gè)特異性結(jié)合位點(diǎn)(引物與模板鏈之間的序列關(guān)系如圖1A,彩圖見圖版二)，以實(shí)現(xiàn)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)。LAMP反應(yīng)依賴于具有鏈置換活性的DNA聚合酶來進(jìn)行延伸，包括2個(gè)階段：起始結(jié)構(gòu)產(chǎn)生階段(第一階段)和循環(huán)擴(kuò)增階段(第二階段)。

在第一階段(如圖1B)中，F(xiàn)IP與模板結(jié)合延伸產(chǎn)生的單鏈DNA被通過外引物F3延伸產(chǎn)生的單鏈DNA置換出來，隨后，此單鏈DNA充當(dāng)2個(gè)引物(BIP和B3)的模板，配對(duì)延伸形成啞鈴狀的DNA結(jié)構(gòu)。第二階段(如圖1C)中，內(nèi)引物識(shí)別結(jié)合啞鈴狀DNA的loop區(qū)域，循環(huán)擴(kuò)增過程由2對(duì)內(nèi)引物交替啟動(dòng)，使得靶序列以指數(shù)倍增長，可在1 h內(nèi)積累109個(gè)拷貝。

2002年，Nagamine等[9]提出通過加入loop引物的方法來加速整個(gè)擴(kuò)增過程，使擴(kuò)增時(shí)間縮短了一半。2003年，Mori等[10]發(fā)現(xiàn)LAMP擴(kuò)增反應(yīng)中產(chǎn)生的焦磷酸與溶液中的鎂離子結(jié)合產(chǎn)生的沉淀可使整個(gè)體系變得渾濁，從而提出了通過檢測(cè)濁度變化對(duì)反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。但通過濁度監(jiān)測(cè)擴(kuò)增過程并不具有特異性，即如果擴(kuò)增的是非目標(biāo)序列也能產(chǎn)生沉淀。2011年，Kubota等[11]設(shè)計(jì)了一種包含熒光標(biāo)記(fluorescence label)和淬滅基團(tuán)(quencher)的同化吸收探針(assimilating probe)來實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增過程。因探針只能和目標(biāo)序列特異結(jié)合，從而解決了檢測(cè)信號(hào)的特異性問題。最近，Qin等[12]將免疫磁珠分離技術(shù)與LAMP相結(jié)合，從而快速、特異地檢測(cè)出碎牛肉中的大腸桿菌。由于LAMP具有在擴(kuò)增核酸靈敏度上的優(yōu)越性能，使其能夠捕獲和檢測(cè)到肉樣品中濃度低至3×101CFU/mL的細(xì)菌。因而，適合作為基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室和實(shí)地檢測(cè)中的篩選實(shí)驗(yàn)。然而，由于LAMP技術(shù)中所使用的4種引物要與6個(gè)目標(biāo)區(qū)域覆蓋，使得LAMP的引物設(shè)計(jì)非常復(fù)雜，這也是該擴(kuò)增方法在實(shí)際應(yīng)用中的難點(diǎn)。此外，啞鈴狀的DNA結(jié)構(gòu)一旦產(chǎn)生，其后的循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)便不需要外引物也能非常靈敏、高效的進(jìn)行，但若在同一個(gè)環(huán)境對(duì)同一段目標(biāo)序列進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，則極易造成陰性對(duì)照組的污染[13]。故市面上利用LAMP技術(shù)的商業(yè)病原體檢測(cè)試劑盒多為一次性使用產(chǎn)品。

1.3 依賴解旋酶擴(kuò)增技術(shù)

依賴解旋酶擴(kuò)增是一種通過模擬體內(nèi)DNA復(fù)制來進(jìn)行擴(kuò)增的方法[14]。與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)不同的是，該方法能等溫?cái)U(kuò)增更長的DNA序列，而這正是目前醫(yī)學(xué)臨床診斷和生物學(xué)基礎(chǔ)研究所迫切需要的。在HDA中，DNA解旋酶(helicase)被用來解開初始目標(biāo)序列，隨后，引物再與產(chǎn)生的DNA單鏈結(jié)合，在DNA聚合酶(polymerase)的作用下形成新的目標(biāo)DNA序列。與PCR類似，HDA反應(yīng)也分為3步：模板分離、引物結(jié)合與引物延伸，只是雙鏈DNA是通過解旋酶打開的，而不是PCR中利用溫度升高而實(shí)現(xiàn)的DNA變性解旋。最初的HDA反應(yīng)中，由于大腸桿菌UvrD解旋酶的熱穩(wěn)定性很弱，反應(yīng)溫度固定為37℃[15]。后來，Motré等[16]發(fā)現(xiàn)一種熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)酶，該酶實(shí)質(zhì)上是Tte-UvrD和Bst DNA聚合酶通過卷曲螺旋域連接在一起的復(fù)合體，使得該反應(yīng)能在較高的溫度(60～65℃)下高效率地進(jìn)行，提高了對(duì)病原體和單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)位點(diǎn)檢測(cè)的特異性和靈敏度。PCR的添加劑(如二甲基亞砜、甜菜堿、山梨糖醇等)可減少DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生，并有利于引物退火，同樣也可在HDA擴(kuò)增中有效地提高目標(biāo)序列的產(chǎn)量和特異性[17]。但是，這些添加劑也會(huì)極大地降低聚合酶的活性。因此，測(cè)試不同濃度以找出每個(gè)擴(kuò)增系統(tǒng)的最佳條件非常重要。HDA還可與納米技術(shù)結(jié)合，2017年，Sedighi等[18]開發(fā)了一種納米顆粒輔助的新型HDA,稱為nanoHDA。該方法利用對(duì)單鏈DNA(single-stranded DNA, ssDNA)具有優(yōu)先親和力的金納米顆粒(Au nanoparticles，AuNPs)來提高解旋酶的變性效率。同時(shí)，納米顆粒的相同親和性還可以抑制引物二聚體的形成，從而提高特異性。目前，Sedighi等[18]已經(jīng)實(shí)現(xiàn)用nanoHDA對(duì)來自結(jié)直腸癌患者的基因組DNA樣品中的KRAS基因進(jìn)行基因分型。

1.4 重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)

重組酶聚合酶擴(kuò)增是利用重組酶解開雙鏈模板的一種等溫?cái)U(kuò)增方法，其無需預(yù)處理DNA樣品即可實(shí)現(xiàn)核酸的指數(shù)擴(kuò)增。Piepenburg等[19]證明了該技術(shù)能檢測(cè)少于10個(gè)拷貝的基因組DNA，反應(yīng)敏感、特異且快速。在重組酶聚合酶擴(kuò)增中，通過重組酶-引物復(fù)合體識(shí)別雙鏈模板同源區(qū)域來啟動(dòng)整個(gè)過程。一旦復(fù)合物找到特定的結(jié)合位點(diǎn)，重組酶即可解開雙鏈，允許引物和靶序列的雜交。這個(gè)過程由單鏈DNA結(jié)合蛋白(single-stranded DNA-binding protein，SSB)輔助，將其結(jié)合到被打開的DNA單鏈上，從而使整個(gè)過程得以延續(xù)。然后引物延伸合成新的DNA單鏈，取代舊鏈。新合成的雙鏈又可作為下一個(gè)周期的模板，從而實(shí)現(xiàn)指數(shù)放大。RPA可在低溫(37～42℃)條件下于40 min內(nèi)積累數(shù)百萬的目標(biāo)DNA拷貝[19]。近幾年，研究人員發(fā)現(xiàn)在RPA中加入反轉(zhuǎn)錄重組聚合酶(reverse-transcription recombinase polymerase)，能實(shí)現(xiàn)RNA的擴(kuò)增，進(jìn)而為RNA病原體的檢測(cè)開辟新的道路[20]。最近，Garrido-Maestu等[21]對(duì)RPA進(jìn)行了開發(fā)及廣泛的評(píng)估。在純細(xì)菌DNA的評(píng)估中，RPA比qPCR的靈敏度高10～100倍，并且針對(duì)真實(shí)食物樣品測(cè)試時(shí)，顯示了高度的一致性。此外，該方法的檢測(cè)限極低(低于10 CFU/25 g)。因此，證明了RPA的優(yōu)秀性能及其在食品工業(yè)中實(shí)施的充分性。

圖1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法的原理[8]Fig.1 Principle of loop-mediated isothermal amplification method[8].注：A：LAMP反應(yīng)的引物設(shè)計(jì)。為了便于解釋，在目標(biāo)DNA上標(biāo)出了6個(gè)不同的區(qū)域，從5′端標(biāo)記為F3、F2、F1、B1c、B2c和B3。由于c代表互補(bǔ)序列，F(xiàn)1c序列與F1序列互補(bǔ)。在LAMP方法中使用2個(gè)內(nèi)部引物(FIP和BIP)和外部引物(F3和B3)。FIP(BIP)是由F1c(B1c)序列和F2(B2)序列組成的雜交引物；B：起始結(jié)構(gòu)產(chǎn)生階段。從FIP開始的DNA合成如下：F2區(qū)與目標(biāo)DNA上的F2c區(qū)結(jié)合并啟動(dòng)延伸，以類似的方式用BIP進(jìn)行DNA擴(kuò)增。F3引物與目標(biāo)DNA上的F3c區(qū)域結(jié)合，并發(fā)生鏈置換DNA合成。從FIP延長的DNA鏈被替換并釋放，釋放的單鏈在其3′端形成環(huán)結(jié)構(gòu)(結(jié)構(gòu)3)。DNA合成以單鏈DNA為模板進(jìn)行，BIP和B3引物按照上述的相同方式產(chǎn)生結(jié)構(gòu)5，結(jié)構(gòu)5兩端具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)(整體呈啞鈴狀結(jié)構(gòu))；C：循環(huán)擴(kuò)增階段。使用自身結(jié)構(gòu)作為模板，從3′端F1區(qū)開始自引發(fā)的DNA合成，并且延伸從FIP與環(huán)結(jié)構(gòu)中F2c區(qū)的單鏈結(jié)合開始。經(jīng)過上述步驟，產(chǎn)生與結(jié)構(gòu)5互補(bǔ)的結(jié)構(gòu)7，并且結(jié)構(gòu)5由類似于從結(jié)構(gòu)5～7引出的反應(yīng)的結(jié)構(gòu)8產(chǎn)生。結(jié)構(gòu)9和10分別由結(jié)構(gòu)6和8制成，并且還制造更多的細(xì)長結(jié)構(gòu)[8]。(彩圖見圖版二)

表1對(duì)上述核酸擴(kuò)增技術(shù)的參數(shù)及性能進(jìn)行了概括，并分析比較了各自的優(yōu)缺點(diǎn)。

表1 核酸擴(kuò)增技術(shù)概括比較Table 1 Comparison of nucleic acid amplification techniques.

2 等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)在病原體檢測(cè)中的應(yīng)用

核酸序列的檢測(cè)在現(xiàn)代生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中是至關(guān)重要的，自20世紀(jì)90年代以來，這一領(lǐng)域開展的研究和成果呈指數(shù)級(jí)增長，并且在未來的幾十年可能會(huì)持續(xù)增加[22]。病人樣本中病原細(xì)菌、病毒和癌癥基因的檢測(cè)對(duì)于影響病人恢復(fù)起著至關(guān)重要的作用。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是使用最為廣泛的DNA擴(kuò)增的方法，用于檢測(cè)和鑒定傳染病、遺傳病及其他方面的研究。由于PCR循環(huán)期間需要通過加熱以解鏈雙鏈，因此，PCR不適合用于檢測(cè)活細(xì)胞中的核酸序列。等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，特別是可在細(xì)胞適宜溫度(30～37℃)下工作的技術(shù)可以用于旨在了解活細(xì)胞中基因時(shí)序表達(dá)模式的相關(guān)研究。對(duì)于體外檢測(cè)，有時(shí)有限的資源配置無法滿足進(jìn)行PCR測(cè)定的需求。由于上述PCR所具有的DNA/RNA檢測(cè)分析中的局限性，促進(jìn)了各種等溫檢測(cè)技術(shù)與平臺(tái)的開發(fā)。在實(shí)際的病原體檢測(cè)中，已有許多研究報(bào)道將等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)應(yīng)用其中[22]。

2.1 以DNA為遺傳物質(zhì)的病原體檢測(cè)

大多數(shù)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)能以極高的靈敏度擴(kuò)增和檢測(cè)DNA。在這些方法中，由于LAMP、HDA和RPA在序列擴(kuò)增中的出色表現(xiàn)而被更為廣泛的用于病原體基因組DNA的檢測(cè)中。

結(jié)核病是一種乙類傳染病，病死率約為12.5%。傳統(tǒng)的臨床檢測(cè)方法需要涂布培養(yǎng)細(xì)菌，時(shí)間較長，而Motré等[23]利用HDA快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)，通過逐步優(yōu)化引物和酶的用量，使得擴(kuò)增2個(gè)拷貝的MTB基因組DNA的放大時(shí)間從60 min減少到30 min以內(nèi)。該反應(yīng)在65℃的恒定溫度下進(jìn)行，且不需要將模板進(jìn)行熱變性，使其成為真正的等溫。同時(shí)，該方法使用無需儀器的自攜式一次性紙盒即可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，從而將交叉污染的可能性降至最低。因此，整個(gè)檢測(cè)程序只需要一個(gè)便宜的加熱塊，適用于資源有限的地區(qū)。

沙門氏菌是一種主要的食源性病原體，在環(huán)境中普遍存在，并可導(dǎo)致嚴(yán)重的人畜疾病，傳統(tǒng)的沙門氏菌檢測(cè)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力。依賴嗜熱解螺旋酶擴(kuò)增(thermophilic helicase-dependent amplification，tHDA)是一種較新的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)利用解旋酶在恒定溫度下解鏈雙鏈DNA，實(shí)現(xiàn)等溫核酸擴(kuò)增。Du等[24]將該技術(shù)與側(cè)向流動(dòng)測(cè)定相結(jié)合，開發(fā)了一種快速、簡(jiǎn)單和便攜的沙門氏菌檢測(cè)方法，可以在90 min內(nèi)提供可視化的檢測(cè)結(jié)果，適用于設(shè)備有限的地區(qū)。

快速、靈敏地檢測(cè)大量樣品中的低量病原體對(duì)于患者的早期診斷和治療十分關(guān)鍵。Dao等[25]將RPA和微流體平臺(tái)結(jié)合，開發(fā)了一種新型病原體富集平臺(tái)。利用新平臺(tái)檢測(cè)10 mL含沙門氏菌尿液和含布魯氏菌尿液的靈敏度分別比無富集過程的實(shí)時(shí)PCR高20倍和10倍。該技術(shù)通過提高對(duì)大樣本中病原體的捕獲效率來更好地診斷病原體，提高了對(duì)于致病DNA的檢測(cè)極限，具有良好的應(yīng)用前景。

早期診斷對(duì)于依賴種子傳播的真菌病原體是十分重要的，從而可以避免病原體的繁殖，減少經(jīng)濟(jì)損失和不必要的殺菌劑的使用。傳統(tǒng)的檢測(cè)種子真菌的技術(shù)是基于孵化和成長，該方法雖然簡(jiǎn)單但是耗時(shí)，需要真菌學(xué)實(shí)驗(yàn)相關(guān)操作技能。最近，基于DNA分析的新鑒定技術(shù)已被應(yīng)用，且由于其具有的高靈敏度和特異性，使其在應(yīng)用中非常高效、實(shí)用。如LAMP已被廣泛用于相關(guān)檢測(cè)中。蔓枯病菌是一種引起葫蘆科作物果皮枯萎的致病真菌，Yao等[26]開發(fā)了一種快速、直觀和靈敏的LAMP分析方法，用于檢測(cè)葫蘆科作物中的真菌病原體。而黑穗病是一種在甘蔗種植區(qū)廣泛流行的真菌病，Su等[27]利用LAMP開發(fā)的黑穗病真菌病原體檢測(cè)方法的靈敏度比常規(guī)PCR檢測(cè)方法高100倍。由于等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)具有諸多優(yōu)點(diǎn)，其在未來也可延伸用于種子中真菌病原體的檢測(cè)。

HDA可以將復(fù)雜生物基質(zhì)的目標(biāo)序列(如粗細(xì)菌裂解液或血液)擴(kuò)增106倍[14]，也可以用于檢測(cè)多種目標(biāo)序列，如基于大腸桿菌UvrD的HDA系統(tǒng)可以擴(kuò)增來自幽門螺桿菌、大腸桿菌、淋病奈瑟菌、齒密螺旋體、馬來絲蟲和人細(xì)胞的各種基因組DNA的靶序列[14]。最近，Andresen等[28]在芯片上實(shí)現(xiàn)了用HDA來進(jìn)行DNA擴(kuò)增，為該技術(shù)應(yīng)用于臨床快速檢測(cè)提供了實(shí)際依據(jù)，同時(shí)也展現(xiàn)了HAD所具有的巨大潛力。

2.2 以RNA為遺傳物質(zhì)的病原體檢測(cè)

目前，艾滋病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，對(duì)人類健康、經(jīng)濟(jì)發(fā)展和社會(huì)穩(wěn)定都產(chǎn)生了嚴(yán)重的威脅。而快速、可靠地檢測(cè)艾滋病毒感染有助于促進(jìn)早期治療，可顯著提高治療效果。重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)技術(shù)，可以在不需要復(fù)雜設(shè)備的情況下，在20 min內(nèi)快速擴(kuò)增來自多種HIV-1亞型的原病毒DNA。同時(shí)，等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)也適用于以RNA為遺傳物質(zhì)的病原體檢測(cè)。Lillis等[29]將逆轉(zhuǎn)錄酶和RPA相結(jié)合(RT-RPA)，用于檢測(cè)HIV-1病毒RNA及其前病毒的DNA，這種RT-RPA HIV-1檢測(cè)方法的檢測(cè)限為10～30個(gè)確切序列匹配的DNA或RNA拷貝，是一種新型的、可以快速、準(zhǔn)確診斷HIV的高度敏感的工具，同時(shí)也適用于診斷嬰兒HIV。

嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥(SARS)呈現(xiàn)出死亡率高、蔓延速度快的特點(diǎn)，且其臨床表現(xiàn)不明確，沒有已知的治療或預(yù)防方法，這些因素強(qiáng)調(diào)了對(duì)其進(jìn)行早期診斷的必要性。Keightley等[30]進(jìn)行了SARS-CoV的實(shí)時(shí)依賴核酸序列擴(kuò)增(NASBA)的測(cè)試，設(shè)計(jì)了許多引物/信標(biāo)組以針對(duì)SARS-CoV基因組的不同區(qū)域，并進(jìn)行了敏感性和特異性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)N目標(biāo)序列始終比Pol目標(biāo)序列更為敏感。目前，多靶實(shí)時(shí)NASBA檢測(cè)已被成功開發(fā)，并用于SARS-CoV的敏感檢測(cè)。

為了快速檢測(cè)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syn-drome virus，HP-PRRSV)2型，Yang等[31]開發(fā)了一種基于熒光探針的實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴(kuò)增(real-time RT-RPA)的測(cè)定方法，通過在反應(yīng)體系中加入熒光探針使結(jié)果可視化。實(shí)時(shí)RT-RPA可高特異性地?cái)U(kuò)增HP-PRRSV，與經(jīng)典PRRSV、經(jīng)典豬瘟病毒、偽狂犬病病毒和口蹄疫病毒無交叉反應(yīng)。

2.3 其他類型的病原體檢測(cè)

阿米巴病被列為世界上10種最常見的寄生蟲病之一。傳統(tǒng)的顯微鏡檢查法、培養(yǎng)法操作時(shí)間長、技術(shù)要求高，且檢出率低，而抗原檢測(cè)法雖然更為準(zhǔn)確，但有些情況下還是會(huì)發(fā)生檢測(cè)遺漏[32]。Nair等[33]開發(fā)了一種利用重組酶聚合酶擴(kuò)增特異性檢測(cè)溶組織內(nèi)阿米巴的方法，由于其成本低、靈敏度高、適用于現(xiàn)場(chǎng)診斷，使其具有更高的可用性，有助于在流行地區(qū)快速診斷和治療阿米巴病。

Doseeva等[34]闡述了用于檢測(cè)沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis，CT)和淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhea，NG)的4重tHDA測(cè)定的發(fā)展和優(yōu)化。該測(cè)定方法顯示出較高的CT/NG同時(shí)檢測(cè)分析的靈敏度和特異性，且與各種樣品類型、培養(yǎng)基兼容，同時(shí)，測(cè)定中使用的等溫反應(yīng)條件和均相終點(diǎn)檢測(cè)非常適用于實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化、高通量篩選應(yīng)用以及即時(shí)測(cè)試(point-of-care testing)。

立克次體病是一類威脅人類健康的人獸共患病，其病原體均可通過媒介昆蟲與動(dòng)物宿主之間進(jìn)行傳播，導(dǎo)致流感樣癥狀。診斷感染立克次體的標(biāo)準(zhǔn)是間接免疫熒光試驗(yàn)，但這是一種血清學(xué)方法，不適用于疾病急性期的病原鑒定。針對(duì)這一問題，Kissenk?tter等[35]開發(fā)了一種快速、無限制的方法來檢測(cè)所有感染立克次體的物種。以23S和16S rRNA基因作為RPA的擴(kuò)增序列，10個(gè)以內(nèi)的目標(biāo)序列拷貝可以在7～10 min內(nèi)檢測(cè)出來。這種RPA分析方法可在移動(dòng)手提箱實(shí)驗(yàn)室中實(shí)施，以方便偏遠(yuǎn)農(nóng)村地區(qū)使用，也為家庭自助式疾病檢測(cè)提供了可行的方法。

表2分析比較了不同等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)應(yīng)用于病原體檢測(cè)的優(yōu)缺點(diǎn)。

表2 不同等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)應(yīng)用于病原體檢測(cè)比較Table 2 Comparison of isothermal amplification techniques detecting pathogen.

3 展望

在過去的二三十年里，多種在等溫條件下即可實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增的核酸檢測(cè)技術(shù)取得了長足發(fā)展[36]。其中多種方法已被證實(shí)可用于擴(kuò)增模板量極少的序列，并在臨床檢測(cè)中展現(xiàn)出巨大的潛力。

隨著生物、化學(xué)、納米材料等研究的不斷深入，等溫檢測(cè)也從中獲益，檢測(cè)目標(biāo)已經(jīng)從DNA/RNA擴(kuò)大到細(xì)胞、蛋白質(zhì)、小分子甚至離子。此外，研究人員充分證明了這些方法也可應(yīng)用于測(cè)序、原位標(biāo)記和細(xì)胞內(nèi)生物成像等領(lǐng)域，更有研究表明使用等溫?cái)U(kuò)增方法產(chǎn)生的擴(kuò)增子可用于構(gòu)建通用的核酸納米材料[37]，這顯示出其在生物醫(yī)學(xué)生物成像和生物傳感等方面也具有廣闊的應(yīng)用前景[38～42]。最近，研究人員發(fā)現(xiàn)，加入生長增殖由DNA分析物觸發(fā)的微生物，可降低可視化的核酸診斷試劑的成本[43]，這為等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)廣泛應(yīng)用于病原體檢測(cè)提供了有利條件。此外，將等溫?cái)U(kuò)增集成到微系統(tǒng)或便攜式設(shè)備中，促進(jìn)了基于核酸的POC診斷技術(shù)的發(fā)展，大量研究表明，現(xiàn)有的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)可表現(xiàn)出與基于PCR的分析相媲美、甚至更好的性能[44]。隨著溶液系統(tǒng)復(fù)雜度的降低，相關(guān)診斷設(shè)備和試劑盒已逐漸走向市場(chǎng)，并已開發(fā)出多種商業(yè)化產(chǎn)品。

不僅限于上文所涉及到的幾種等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，其他技術(shù)在病原體檢測(cè)中也有重要的應(yīng)用。到目前為止，已將滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(rolling circle amplification，RCA)整合到芯片中。Reiss等[45]在流通系統(tǒng)中進(jìn)行RCA，可以在熒光顯微鏡下觀察擴(kuò)增產(chǎn)物。此外，美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆的Alere公司發(fā)布了一種基于粘連和延伸擴(kuò)增反應(yīng)(nicking and extension amplification reaction，NEAR)的檢測(cè)試劑盒，可在15 min內(nèi)檢測(cè)到A型和B型流感病毒，總成本約為40美元。

然而，現(xiàn)有的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)用于病原體檢測(cè)中，仍存在以下問題：①核酸指數(shù)擴(kuò)增的過程中存在放大偏差和非特異性擴(kuò)增，這對(duì)模板基因組的有效濃度提出了更高的要求；②盡管便攜式POC診斷設(shè)備的商業(yè)產(chǎn)品已經(jīng)面世，但其集成技術(shù)仍存在較大的進(jìn)步空間(如基于試紙或微流控芯片的檢測(cè)平臺(tái)需要控制無溶劑的反應(yīng)環(huán)境，尚無法實(shí)現(xiàn))，其改進(jìn)依賴于工程、物理和生物科學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展。

總而言之，等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)的良好性能有助于其與前一代非等溫的核酸擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，并可廣泛應(yīng)用于樣品檢測(cè)。這些方法的簡(jiǎn)便性、恒溫性以及對(duì)小型化與自動(dòng)化的高度適應(yīng)性，在開發(fā)可用于臨床或現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的手持式DNA診斷設(shè)備中展現(xiàn)出巨大潛力。