4-苯基丁酸對(duì)大鼠膿毒癥的保護(hù)作用

朱 娛，吳 躍，田昆侖，彭小勇，張 杰，劉良明，李 濤

膿毒癥是嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷、休克常見(jiàn)的并發(fā)癥，是創(chuàng)傷、燒傷患者死亡的重要原因之一[1-2]。據(jù)報(bào)道，全世界每天約有1 400人死于膿毒癥。在美國(guó)的統(tǒng)計(jì)分析中，膿毒癥每年有75萬(wàn)病例，其中約22萬(wàn)～25萬(wàn)人死亡，并呈逐年上升趨勢(shì)，是非心臟重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)患者的主要死亡原因[3-4]。因此對(duì)膿毒癥患者的治療顯得尤為迫切。盡管近年來(lái)采取了許多新的治療措施，但膿毒癥的發(fā)生率和病死率仍居高不下。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)是由某種原因?qū)е聝?nèi)質(zhì)網(wǎng)生理功能發(fā)生紊亂，是一種亞細(xì)胞器的病理過(guò)程，可促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的錯(cuò)誤折疊，從而有利于維持細(xì)胞的正常功能，但長(zhǎng)時(shí)間的ERS可引起細(xì)胞凋亡等細(xì)胞功能損傷。ERS參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，適度的ERS可以恢復(fù)心肌細(xì)胞鈣和蛋白質(zhì)合成穩(wěn)態(tài)，有利于肥大心肌的修復(fù)與代償；但持續(xù)而嚴(yán)重的ERS可觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)肥大心肌轉(zhuǎn)向衰竭[5]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-苯基丁酸(PBA)是美國(guó)FDA于1996年批準(zhǔn)上市的新藥，是一種相對(duì)分子質(zhì)量較低的脂肪酸，目前已用于臨床治療兒童尿素循環(huán)衰竭[6]、鐮刀狀紅細(xì)胞病和地中海貧血[7]。以往研究顯示，PBA在多種疾病中對(duì)器官功能有明顯的保護(hù)作用，包括帕金森病、糖尿病及高血壓等。Luo等[8]發(fā)現(xiàn)PBA 通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡起到抑制心臟缺血的損害作用。Mosbah等[9]發(fā)現(xiàn)PBA可通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡保護(hù)肝臟發(fā)生缺血再灌注損傷。但PBA是否對(duì)膿毒癥大鼠有治療作用，目前尚不清楚。為此，本實(shí)驗(yàn)采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)復(fù)制大鼠膿毒癥模型，觀察PBA對(duì)膿毒癥大鼠組織灌注、器官功能以及存活時(shí)間、存活率的影響，為膿毒癥的救治提供新的方向。

材料與方法

1 膿毒癥模型的建立

160只SD大鼠，雌雄不拘，體重220g左右，由陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。用盲腸結(jié)扎穿孔復(fù)制膿毒癥模型：常規(guī)腹部消毒，暴露盲腸，在其末端1/2處結(jié)扎，貫通穿刺結(jié)扎部位，讓糞便流入腹腔，常規(guī)縫合、飼養(yǎng)。CLP制作12h后插管監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈血壓(mean arterial blood pressure,MAP)，當(dāng)MAP下降30%或以上，認(rèn)為模型成功，本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ统晒β蕿?0%。股靜脈插管用于輸液，插管完成后穩(wěn)定10min。從插管中注入500U/kg的肝素鈉全身抗凝。假手術(shù)組大鼠除不結(jié)扎盲腸和穿孔外, 其余操作同膿毒癥模型組。

2 試劑

PBA購(gòu)自Sigma公司，貨號(hào)P21005，規(guī)格25g，分子量為164.2g/mol。稱取250mg PBA，溶于10mL雙蒸水中，母液濃度為25mg/mL，使用時(shí)用雙蒸水稀釋10倍，即2.5mg/mL，每100g大鼠給0.2mL。

3 PBA對(duì)膿毒癥大鼠的保護(hù)作用

實(shí)驗(yàn)分為假手術(shù)組、膿毒癥組、常規(guī)治療組、PBA早期治療組(Ear-PBA組)和PBA晚期治療組(Lat-PBA組)。常規(guī)治療組：根據(jù)膿毒癥救治指南，在CLP 12h后靜脈給予乳酸林格氏液(LR)、抗生素頭孢呋辛鈉(100mg/kg)和血管活性藥物多巴胺，輸液速度為10μg/(kg·min)，輸注6h，使MAP>70mmHg；Ear-PBA組：在CLP手術(shù)完成后立即尾靜脈給予PBA(5mg/kg)，在CLP 12h后常規(guī)治療6h；Lat-PBA組：在CLP 12h后給予常規(guī)治療的同時(shí)給予PBA(5mg/kg)股靜脈輸注6h；膿毒癥組：在CLP 12h后直接觀察相關(guān)指標(biāo)；假手術(shù)組除了不結(jié)扎盲腸和穿孔以外，其他操作與膿毒癥模型組一致。實(shí)驗(yàn)分為三批，第一批用于觀察存活時(shí)間、存活率，每組16只，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，結(jié)扎血管，縫合皮膚，肌注抗生素頭孢呋辛鈉；用苦味酸在動(dòng)物的耳朵進(jìn)行標(biāo)記，然后將實(shí)驗(yàn)大鼠放回籠中，給予飼料和水，每30min觀察1次，詳細(xì)記錄動(dòng)物的狀態(tài)和死亡時(shí)間。第二批(每組8只)用于觀察組織灌注，剪開(kāi)大鼠腹直線，暴露所測(cè)器官，用激光多普勒(PF5001)探針垂直插入0.5cm，待曲線穩(wěn)定后記錄并測(cè)定。第三批(每組8只)用于測(cè)定器官功能，抽取2mL動(dòng)脈血用生化分析儀(BXC800，Beckman，美國(guó))檢測(cè)腎臟功能，包括血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、β2-微球蛋白(β2-MG)和視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)以及用ELISA試劑盒檢測(cè)腸道功能，包括D-乳酸(D-lactate)和內(nèi)毒素(endotoxin)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

1 PBA對(duì)膿毒癥大鼠存活時(shí)間及存活率的影響

CLP 12h超過(guò)一半的動(dòng)物在6h內(nèi)死亡，無(wú)動(dòng)物存活時(shí)間超過(guò)72h，其平均存活時(shí)間約6.21h；常規(guī)治療后，動(dòng)物的存活無(wú)顯著變化，其平均存活時(shí)間為7.44h，無(wú)動(dòng)物存活時(shí)間超過(guò)72h；給予PBA后，動(dòng)物存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)，其中PBA早期治療組的存活時(shí)間為16.32h，72h存活率25%；PBA晚期治療組存活時(shí)間為13.11h，72h存活率為31%。見(jiàn)圖1。

圖1 PBA對(duì)膿毒癥大鼠存活時(shí)間及存活率的影響。與常規(guī)治療組比較：@P<0.05，@@P<0.01；sepsis：膿毒癥組；CT：常規(guī)治療組；Ear-PBA：PBA早期治療組；Lat-PBA：PBA晚期治療組

2 PBA對(duì)膿毒癥大鼠腎臟血流量和腸道血流量的影響

與假手術(shù)組比較，膿毒癥大鼠的腸道和腎臟血流量均顯著降低，常規(guī)治療后腸道和腎臟血流量有部分升高，約為112U/min和190U/min；PBA早期和晚期治療組器官血流量均顯著增加，其中PBA早期治療組的腸道和腎臟血流量分別為143U/min和274U/min；PBA晚期治療組腸道和腎臟血流量分別為147U/min和243U/min，與常規(guī)治療組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 PBA對(duì)膿毒癥大鼠腸道和腎臟血流量的影響。與假手術(shù)組比較：**P<0.01；與膿毒癥組比較：#P<0.05；與常規(guī)治療組比較：@P<0.05，@@P<0.01；CT：常規(guī)治療組；Ear-PBA：PBA早期治療組；Lat-PBA：PBA晚期治療組

3 PBA對(duì)膿毒癥大鼠腎臟功能的影響

膿毒癥后大鼠腎臟功能明顯受損，反映腎臟功能的指標(biāo)包括BUN、Scr、β2-MG和RBP在膿毒癥后均顯著高于基礎(chǔ)值(P<0.01)；常規(guī)治療可部分降低膿毒癥大鼠血漿中的BUN、Scr、β2-MG和RBP的水平；PBA治療后，大鼠腎臟功能明顯改善，血漿中的Scr、β2-MG和RBP明顯降低，與常規(guī)治療組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其中PBA早期治療效果優(yōu)于PBA晚期治療(表1)。

表1 PBA對(duì)膿毒癥大鼠腎臟功能的影響

與膿毒癥組比較：#P<0.05，##P<0.01；與常規(guī)治療組比較：@@P<0.01；BUN：尿素氮；Scr：血肌酐；β2-MG：β2-微球蛋白；RBP：視黃醇結(jié)合蛋白

4 PBA對(duì)膿毒癥大鼠腸道功能的影響

與假手術(shù)組相比，膿毒癥后腸道功能明顯受損，反映在D乳酸和內(nèi)毒素顯著升高(P<0.01)；常規(guī)治療可降低膿毒癥大鼠血漿中D-乳酸和內(nèi)毒素的水平，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；不管是PBA早期治療或是晚期治療，大鼠血漿中的D-乳酸和內(nèi)毒素含量均明顯下降，與常規(guī)治療組相比，PBA早期治療下降幅度分別為37%和20%；PBA晚期治療下降幅度分別43%和42%(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 PBA對(duì)膿毒癥大鼠腸道功能的影響

與膿毒癥組比較：#P<0.05，##P<0.01；與常規(guī)治療組比較：@@P<0.01

討 論

膿毒癥是全身炎癥反應(yīng)綜合征，是嚴(yán)重創(chuàng)傷和休克最易出現(xiàn)的并發(fā)癥之一，是創(chuàng)傷和休克主要的死亡原因[2]，也是ICU死亡率最高的疾病之一[10]。盡管近年來(lái)對(duì)膿毒癥的研究不斷深入，但其死亡率始終居高不下[11]。盡管采取了相應(yīng)的治療措施，但臨床效果不明顯，因此尋找有效的治療藥物對(duì)膿毒癥具有重要的意義。PBA作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的抑制劑，近年來(lái)在缺血缺氧和缺血再灌注損傷中有廣泛的研究，但PBA對(duì)膿毒癥大鼠是否有保護(hù)作用，目前尚不清楚。本研究通過(guò)CLP模型復(fù)制膿毒癥來(lái)觀察PBA對(duì)膿毒癥大鼠的保護(hù)和治療作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：膿毒癥后大鼠的器官功能嚴(yán)重受損、組織血流量顯著降低、動(dòng)物的存活時(shí)間縮短和存活率降低；常規(guī)治療(包括液體復(fù)蘇、抗感染以及使用血管活性藥物)可適當(dāng)延長(zhǎng)動(dòng)物的存活時(shí)間和存活率；PBA早期和晚期治療可顯著改善器官功能，增加組織血流量，提高動(dòng)物的存活時(shí)間和存活率。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)PBA對(duì)膿毒癥有一定的保護(hù)和治療作用，為膿毒癥的救治帶來(lái)新的方向。

PBA是一種口服的芳香脂肪酸，因?yàn)榫哂泄庾V的藥理性質(zhì)，已被用于治療多種疾病，如尿酸代謝紊亂、β-地中海貧血、二型糖尿病和家族性高膽固醇血癥。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)PBA具有抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特性，可降低肺動(dòng)脈高壓[12]。目前研究顯示PBA可抑制細(xì)胞凋亡，減輕器官損傷，其主要機(jī)制與抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)，抑制caspase3和caspase9的表達(dá)[13]；PBA還可減輕炎癥反應(yīng)，主要是通過(guò)抑制氧化應(yīng)激，減少炎癥轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的表達(dá)[14-15]；此外PBA作為一種分子伴侶，具有穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的作用[7]。

綜上所述，PBA能夠通過(guò)增加腎臟、腸道血流量，改善器官功能從而增加膿毒癥大鼠的存活率，延長(zhǎng)存活時(shí)間，對(duì)膿毒癥大鼠有明顯的保護(hù)作用。但PBA是如何發(fā)揮對(duì)膿毒癥大鼠的保護(hù)作用，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

盡管筆者發(fā)現(xiàn)PBA可保護(hù)膿毒癥大鼠的器官功能，但是否對(duì)膿毒癥患者也有保護(hù)作用，需進(jìn)一步確定；本實(shí)驗(yàn)只研究了PBA對(duì)膿毒癥大鼠的保護(hù)作用，其機(jī)制如何，還需進(jìn)一步研究。