CXCL13激活小膠質(zhì)細(xì)胞參與瑞芬太尼誘發(fā)疼痛過敏

張熙 王光杰 張娟 薛銳

1湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院麻醉科（湖北十堰 442000）；2湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（湖北十堰 442000）

阿片誘發(fā)的痛覺過敏（opioids?induced hyperal?gesia，OIH）是指輸注阿片類藥物引起的痛域降低。OIH不僅促進(jìn)痛覺感知，引起痛覺異常，甚至出現(xiàn)慢性疼痛癥狀［1］。阿片誘發(fā)痛覺過敏的發(fā)生速度與阿片類藥物特性密切相關(guān)，藥物作用時間越短，耐受發(fā)生越迅速，瑞芬太尼是一種超短效的μ?受體激動劑，因其起效迅速、作用時間短。因此瑞芬太尼較其他阿片類藥物發(fā)生痛覺過敏更快，而這種耐受和痛覺過敏又呈劑量依賴性［2］。但瑞芬太尼誘發(fā)的痛覺過敏機制仍不清楚，因此了解其具體發(fā)生機制仍是臨床鎮(zhèn)痛用藥關(guān)注的難題。趨化因子CXC配體13（CXCL13）屬于CXC趨化因子家族，已經(jīng)被證明在神經(jīng)損傷后產(chǎn)生的快速而持久的觸覺和熱感覺異常中，通過上調(diào)脊髓束中的炎癥因子產(chǎn)生表達(dá)［3］。CXCL13在神經(jīng)系統(tǒng)中存在表達(dá)，并通過激活神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞參與神經(jīng)病理性痛、炎性痛等慢性疼痛的形成與維持［4］。但CXCL13是否與瑞芬太尼誘發(fā)的痛覺過敏有關(guān)尚無定論，因此，本研究旨在觀察CXCL13在瑞芬太尼誘發(fā)的痛覺過敏中的表達(dá)情況，并進(jìn)一步探討其如何參與其痛覺過敏的過程。

1 材料與方法

1.1 動物分組及處理 選擇成年健康SD大鼠（SPF級）20只，體質(zhì)量200～250 g，雌雄不限，由湖北醫(yī)藥學(xué)院實驗動物中心提供。隨機分為4組，每組8只：切口痛組（C組），瑞芬太尼組（R組），NC?siRNA慢病毒組（NC組）和CXCL13?siRNA慢病毒組（CX組）。腹腔注射10%水合氯醛（350 mg/kg）麻醉后，參照Brenman法［5］建立疼痛模型。尾靜脈泵注I組：生理鹽水10 μg/（kg·min），持續(xù)1 h；R組：鹽酸瑞芬太尼注射液（宜昌仁福制藥公司）10 μg/（kg·min），持續(xù)1 h；NC組：鞘內(nèi)注射注射NC?siRNA慢病毒（上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司）10 μL（108TU/mL）30 min后，尾靜脈泵注瑞芬太尼10 μg/（kg·min），持續(xù)1 h；CX組：鞘內(nèi)注射CXCL13?siRNA慢病毒（上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司）10 μL（108TU/mL）30 min后，尾靜脈泵注瑞芬太尼10 μg/（kg·min），持續(xù)1 h。

1.2 機械痛閾檢測 分別于造模前1 h，術(shù)后2、6、12、24 h時采用von FreyTM動態(tài)足底觸覺測量儀（UGO公司，意大利）測定大鼠機械縮足閾值（MWT）。大鼠置于金屬籠（10 cm×10 cm×15 cm），適應(yīng)環(huán)境20 min，處于靜息狀態(tài)時，開始測定，von Frey絲由下向上垂直刺激右側(cè)足底中部皮膚，設(shè)定20 s內(nèi)刺激逐漸由0升高為50 g，當(dāng)出現(xiàn)快速縮足反應(yīng)時，刺激自動停止，記錄壓力值，共測3次，間隔5 min，取其平均值作為大鼠機械縮足閾值（MWT）。

1.3 免疫熒光雙標(biāo)檢測 痛閾測定結(jié)束后，麻醉下取L4～6脊髓組織常規(guī)固定，30%蔗糖脫水至沉底，冰凍連續(xù)切片（厚15 μm），加入封閉液，室溫孵育30 min，PBS漂洗后，同時加入CXCL13抗體（1∶500，beyotime公司，美國）和抗大鼠NeuN抗體（1∶1 000，Millipore公司，美國），孵育，洗滌，加熒光標(biāo)記二抗，室溫孵育，洗滌，用50%甘油封片。激光共聚焦熒光顯微鏡（Zeiss，德國）觀察CXCL13在神經(jīng)元上的表達(dá)和小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況。

1.4 Western blot檢測 CXCL13和 Iba?1蛋白表達(dá) 取L4～6脊髓，加組織裂解液，經(jīng)冰浴勻漿后抽提總蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白濃度定量，取上樣蛋白 50 μg（20 μL），經(jīng) 10%SDS?PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉，加入β?actin（1∶3 000，Chemicon公司，美國）、CXCL13抗體（1∶1 000，beyotime公司，美國）和 Iba?1抗體（1∶1 000，beyotime公司，美國），過夜，TBST洗膜，加二抗（1：5 000，北京中杉金橋公司），室溫孵育，洗膜，曝光。分光密度比值反映CXCL13和Iba?1的蛋白表達(dá)。

1.5 RT?PCR法檢測CXCL13和Iba?1的mRNA表達(dá) 從組織樣本提取總mRNA。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，遵循PCR引物設(shè)計原則，以GAPDH作為內(nèi)參，引物由上海生物工程公司合成，序列見表1。擴增條件：94℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，54 ℃30 s，72 ℃ 20 s，共45個循環(huán)，72℃延伸10 min。計算CXCL13和Iba?1與內(nèi)參照GAPDH的比值作為目的基因的相對表達(dá)量。

表1 CXCL13、Iba?1和GAPDH引物序列Tab.1 Sequences of CXCL13、Iba?1 and GAPDH primers

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MWT比較 四組大鼠術(shù)前1 h MWT值比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；與I組比較，R組、NC組和CX組術(shù)后2 h MWT值隨時間增加顯著下降（P＜0.05），至術(shù)后24 h時降至最低；與R組、NC組比較，CX組術(shù)后6 h MWT值顯著升高（P＜0.05），并持續(xù)至術(shù)后24 h；R組與NC組MWT值在各對應(yīng)時間點差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠術(shù)后不同時點MWT的比較Tab.2 The comparison of MWT value in various groups of rats（n=5） x ± s，g

2.2 免疫熒光雙標(biāo)表達(dá)情況 免疫熒光顯示：疼痛發(fā)生時CXCL13在神經(jīng)元中出現(xiàn)表達(dá)，瑞芬誘發(fā)痛覺過敏模型大鼠（R組）脊髓中CXCL13表達(dá)升高；CXCL13?siRNA慢病毒脊髓注射后（CX組）CX?CL13的表達(dá)明顯減少；R組脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞明顯活化，CX組其活化則明顯減少。見圖1。

圖1 CXCL13在各組大鼠脊髓中的表達(dá)分布Fig.1 The expression distribution of CXCL13 in the spinal cord of various groups of rats

2.3 CXCL13和Iba?1蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)情況 與I組比較，R組、NC組的CXCL13和Iba?1蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)（P＜0.05）；與R組、NC組比較，CX組的CXCL13和Iba?1蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.05）。見圖2、表3。

圖2 各組大鼠脊髓CXCL13、Iba?1蛋白表達(dá)的比較Fig.2 The comparison of expression of CXCL13 and Iba?1 protein in the spinal cord of various groups of rats（n=5，x ± s）

表3 各組大鼠脊髓CXCL13、Iba?1的mRNA表達(dá)的比較Tab.3 Comparison of mRNA expression of CXCL13 and iba?1 in the spinal cord of various groups of rats（n=5） ± s

表3 各組大鼠脊髓CXCL13、Iba?1的mRNA表達(dá)的比較Tab.3 Comparison of mRNA expression of CXCL13 and iba?1 in the spinal cord of various groups of rats（n=5） ± s

注：與I組比較，aP ＜0.05；與R組、NC組比較，bP＜0.05

組別I組R組NC組CX組F值P值CXCL13 1.20±0.20 1.70±0.16a 1.72±0.22a 0.36±0.11 64.955 0.000 Iba?1 1.54±0.11 2.54±0.18 2.58±0.26 2.00±0.16 35.300 0.000

3 討論

圍術(shù)期使用阿片藥物可以加重術(shù)后痛覺過敏，約有20%的患者術(shù)后劇痛難以控制，導(dǎo)致術(shù)后并發(fā)癥和死亡率的增加，部分患者將發(fā)展為術(shù)后慢性病理性疼痛，從而嚴(yán)重影響患者日后的生存質(zhì)量［6］。

本實驗中注射瑞芬太尼后出現(xiàn)疼痛靈敏性增高，持續(xù)泵注瑞芬太尼后2 h出現(xiàn)疼痛閾值降低，于24 h達(dá)到高峰，這與臨床上瑞芬太尼誘發(fā)痛覺過敏始于麻醉蘇醒后2 h，并于24～48 h達(dá)到高峰的研究基本一致［7］。

神經(jīng)炎癥反應(yīng)的主要機制是炎癥介質(zhì)，包括促炎細(xì)胞因子和趨化因子，增強了外周神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同區(qū)域的痛覺信號［8］。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)脊髓趨化因子在神經(jīng)損傷后慢性疼痛進(jìn)展中的作用［9-10］。CXCL13在裸鼠脊髓神經(jīng)損傷后表達(dá)增高［11］；并且CXCL13已經(jīng)被證實涉及骨癌痛以及嗎啡的鎮(zhèn)痛耐受機制［12］。本研究發(fā)現(xiàn)切口痛組大鼠脊髓中CXCL13產(chǎn)生表達(dá)，并在瑞芬太尼誘導(dǎo)疼痛過敏組的表達(dá)被上調(diào)；BAGAEVA等［13］的研究也表明，CXCL13在健康的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中無表達(dá)，但在病理條件下的腦和脊髓中表達(dá)升高。在鞘內(nèi)注射CXCL13?siRNA慢病毒后大鼠的機械痛域值顯著增高，大鼠對疼痛耐受程度增強。這些結(jié)果表明CXCL13可能參與了瑞芬太尼誘導(dǎo)痛覺過敏。

阿片類藥物嗎啡引起的鎮(zhèn)痛耐受和痛覺過敏中也發(fā)現(xiàn)了脊髓膠質(zhì)細(xì)胞的激活［14］。本研究在瑞芬太尼誘導(dǎo)疼痛過敏模型中CXCL13在脊髓膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)較切口痛模型組增多，而在CXCL13?siRNA組表達(dá)減少。這提示CXCL13可能通過激活脊髓膠質(zhì)細(xì)胞參與瑞芬太尼誘導(dǎo)的痛覺過敏。

為了進(jìn)一步證實脊髓膠質(zhì)細(xì)胞的激活是否參與了瑞芬太尼誘導(dǎo)的痛覺過敏，本研究檢測了小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記物Iba?1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在瑞芬太尼誘導(dǎo)的痛覺過敏大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記物Iba?1表達(dá)較切口痛模型組增高，但在鞘內(nèi)注射CXCL13?siRNA慢病毒后Iba?1表達(dá)顯著降低，表明CXCLl3的表達(dá)和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化具有同步性，這證實了CXCL13對小膠質(zhì)細(xì)胞的活化是調(diào)節(jié)瑞芬太尼誘導(dǎo)痛覺過敏的重要環(huán)節(jié)。其作用機制可能是瑞芬太尼誘發(fā)疼痛過敏過程中神經(jīng)元通過免疫反應(yīng)調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的活性，小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的趨化因子又進(jìn)一步激活小膠質(zhì)細(xì)胞，使突觸后脊髓背角痛覺傳遞神經(jīng)元的敏感性和反應(yīng)性增強，引起中樞敏化，導(dǎo)致慢性疼痛。

綜上所述，CXCL13可能通過小膠質(zhì)細(xì)胞的激活參與了瑞芬太尼誘發(fā)痛覺過敏，抑制CXCL13能夠有效抑制瑞芬太尼誘導(dǎo)痛覺過敏的發(fā)生。因此，CXCL13可能成為治療瑞芬太尼誘導(dǎo)痛覺過敏的有效靶點。