OPG和RANKL在XACB/LV?bFGF/MSCs移植修復(fù)兔股骨頭缺損壞死模型中的表達(dá)

趙胤 彭吾訓(xùn) 張健 董文濤 吳建華 張飛 張槐 王健波 葉川李青 鄧進(jìn)

1貴州醫(yī)科大學(xué)（貴陽(yáng) 550000）；2貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院（貴陽(yáng) 550000）

股骨頭缺血性壞死（avascular necrosis of femo?ral head，ANFH）多見(jiàn)于20～50歲的中青年患者，是由于不同病因破壞了股骨頭的血液供應(yīng)所造成的最終結(jié)果。目前公認(rèn)的致病因素有13種［1］，這些致病因素破壞股骨頭的血液供應(yīng)，最終導(dǎo)致股骨頭骨與軟骨細(xì)胞的壞死及關(guān)節(jié)面的坍塌，是臨床常見(jiàn)的疾病之一。目前針對(duì)股骨頭缺血性壞死有髓芯減壓術(shù)［2］、帶血管蒂游離腓骨移植［3］、人工髖關(guān)節(jié)置換等治療措施，但卻存在治愈率低、供骨區(qū)并發(fā)癥、人工關(guān)節(jié)使用壽命有限等缺點(diǎn)［4］。近年來(lái)，運(yùn)用骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）移植修復(fù)股骨頭缺血性壞死成為研究熱點(diǎn)，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞是多能干細(xì)胞，具有分化為成骨細(xì)胞的潛力［5］，而在誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞定向分化為成骨細(xì)胞的過(guò)程中，常用的細(xì)胞因子為堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）［6］。而骨保護(hù)素和核因子?κB受體活化因子配體作為破骨細(xì)胞分化和調(diào)節(jié)骨吸收的關(guān)鍵因子［7］，可直接影響破骨細(xì)胞功效，是骨質(zhì)吸收的共同通路。本文就通過(guò)觀察移植了慢病毒轉(zhuǎn)染bFGF的MSCs復(fù)合培養(yǎng)的異種脫抗原松質(zhì)骨（XACB/LV?bFGF/MSCs）治療兔股骨頭壞死模型中骨保護(hù)素和核因子-κB受體活化因子配體的表達(dá)變化情況，探討組織工程骨對(duì)股骨頭缺損壞死的治療效果，為將來(lái)骨組織工程的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～7月齡純種雄性新西蘭大白兔60只，由貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 兔抗bFGF多克隆抗體，兔抗OPG多克隆抗體，兔抗RANKL多克隆抗體（北京博奧森生物科技有限公司）；FGF?2基因過(guò)表達(dá)慢病毒和慢病毒陰性對(duì)照（上海吉?jiǎng)P基因有限公司）。

1.3 兔BMSCs分離培養(yǎng)及鑒定 以3%戊巴比妥鈉靜脈麻醉后，在兔股骨遠(yuǎn)端及脛骨近端穿刺，以預(yù)存肝素的注射器抽取骨髓液1～2 mL，采用密度梯度離心法分離細(xì)胞，完全培養(yǎng)基重懸，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及貼壁情況，當(dāng)細(xì)胞接近80%～90%融合時(shí)，加入胰酶按1∶3的比例消化傳代。細(xì)胞傳至第3代時(shí)，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)MSCs細(xì)胞表面標(biāo)記物（CD44）的表達(dá)；采用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)MSCs成骨分化，于誘導(dǎo)培養(yǎng)第14天，應(yīng)用ALP染色和茜素紅染色鑒定其成骨分化潛能。

1.4 組織工程骨的制備 用豬椎骨制成異種脫抗原松質(zhì)骨（XACB）。分離培養(yǎng)兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）并傳代培養(yǎng)，將兔bFGF基因通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染至骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。將含兔bFGF基因的MSCs與XACB復(fù)合培養(yǎng)，制成組織工程骨XACB/LV?bFGF/MSCs。

1.5 建立兔股骨頭壞死模型 雄性新西蘭大白兔60只進(jìn)行隨機(jī)分組，分為5組，每組12只，運(yùn)用MATSUI等［8］的地塞米松聯(lián)合馬血清注射的方法進(jìn)行造模。

1.6 實(shí)驗(yàn)分組與組織工程骨的植入 造模結(jié)束后行MRI檢查，確認(rèn)造模成功后均右側(cè)手術(shù)。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為5組。A組為空白對(duì)照組，B組植入XACB，C組植入XACB+MSCs，D組植入XACB+MSCs+空病毒，E組植入XACB+LV?bFGF+MSCs。每組12只。A組復(fù)溫后立即逐層關(guān)閉切口，B、C、D、E、組復(fù)溫后沿向鉆孔內(nèi)分別植入面積3 mm×3 mm×3 mm大小的XACB、XACB+MSCs、XACB+MSCs+ 空病毒、XACB+bFGF+MSCs，醫(yī)用凝膠海綿封閉創(chuàng)面，逐層關(guān)閉切口。術(shù)后各組動(dòng)物臀大肌注射青霉素鈉（40萬(wàn)U/d，連續(xù)3 d）預(yù)防感染。

1.7 Western blot法檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染的骨髓基制干細(xì)胞中bFGF蛋白表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染之前將細(xì)胞分為3組，分別為實(shí)驗(yàn)組（MSCs+LV?bFGF），空病毒組（MSCs+空病毒），空白組（單純MSCs）。轉(zhuǎn)染后將3組MSCs消化后提取蛋白，運(yùn)用BCA法測(cè)定蛋白濃度，調(diào)節(jié)蛋白濃度一致后100℃煮沸10 min使蛋白變性。按照WB的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作，得出的圖像運(yùn)用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析圖像。

1.8 Western blot法檢測(cè)骨組織中OPG和RANKL蛋白表達(dá)水平 術(shù)后3、6、12周各組分別處死四只兔子，加入蛋白裂解液（按每100 mg骨組織加入200 μL裂解液）在冰上裂解骨組織，12 000 r/min，4℃離心15 min，取上清即為含有總蛋白的提取液。運(yùn)用BCA法測(cè)定蛋白濃度，調(diào)節(jié)蛋白濃度一致后100℃煮沸10 min使蛋白變性。按照WB的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作，得出的圖像運(yùn)用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析圖像。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析處理，采用均值比較和單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MSCs的培養(yǎng)與鑒定 采用密度梯度離心法聯(lián)合貼壁培養(yǎng)法，獲得大量形態(tài)均一的MSCs，細(xì)胞呈旋渦狀生長(zhǎng)，形狀呈長(zhǎng)梭形、多角形。細(xì)胞表面抗原CD44檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性率達(dá)99%以上；成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)第14天，茜素紅、ALP染色均呈陽(yáng)性。見(jiàn)圖1。

圖1 MSCs的培養(yǎng)與鑒定Fig.1 Culture and authentication of MSCs

2.2 LV?bFGF/MSCs中bFGF蛋白表達(dá)情況 各組bFGF蛋白表達(dá)結(jié)果見(jiàn)表1、圖2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組與空病毒組和空白組之間兩兩比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），空病毒組與空白組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 LV?bFGF/BMSCs中bFGF蛋白表達(dá)情況Tab.1 Expression of bFGF protein in LV?bFGF/BMSCs ±s

表1 LV?bFGF/BMSCs中bFGF蛋白表達(dá)情況Tab.1 Expression of bFGF protein in LV?bFGF/BMSCs ±s

注：與實(shí)驗(yàn)組比較，*P＜0.05；與空病毒組比，#P＞0.05

組別實(shí)驗(yàn)組空病毒組空白組bFGF 0.580 2±0.002 2 0.224 7±0.008 2*0.212 8±0.017 5*#

圖2 LV?bFGF/BMSCs中bFGF蛋白表達(dá)情況Fig.2 Expression of bFGF protein in lv?bfgf/BMSCs

2.3 骨組織中OPG蛋白表達(dá)情況 各組OPG蛋白表達(dá)結(jié)果見(jiàn)表2、圖3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：A、B、C、D組與E組之間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），C組與D組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 骨組織中OPG蛋白表達(dá)情況Tab.2 Expression of OPG protein in bone tissue ±s

表2 骨組織中OPG蛋白表達(dá)情況Tab.2 Expression of OPG protein in bone tissue ±s

注：與E組比較，*P＜0.05；與D組比，#P＞0.05

組別A組（空白組）B組（XACB）C組（XACB+MSCs）D組（XACB+MSCs+LV）E組（XACB+LV?bFGF+MSCs）3周0.517 0±0.020 8*0.102 3±0.015 3*0.157 0±0.050 0*#0.160 7±0.055 1*0.182 7±0.047 3 6周0.057 1±0.001 4*0.106 3±0.005 8*0.160 3±0.005 0*#0.166 3±0.005 1*#0.200 7±0.006 0 12周0.069 0±0.001 0*0.113 3±0.002 3*0.163 7±0.003 2*#0.169 7±0.009 6*0.222 3±0.006 6

圖3 骨組織中OPG蛋白表達(dá)情況Fig.3 Expression of OPG protein in bone tissue

2.4 骨組織中RANKL蛋白表達(dá)情況 各組RANKL蛋白表達(dá)結(jié)果見(jiàn)表3、圖4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：A、B、C、D組與E組之間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。C組與D組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5 骨組織中bFGF蛋白表達(dá)情況 各組bFGF蛋白表達(dá)結(jié)果見(jiàn)表4、圖5。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：A、B、C、D組與E組之間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。C組與D組之間比較差異不具有顯著性（P＞0.05）。

表3 骨組織中RANKL蛋白表達(dá)情況Tab.3 Expression of RANKL protein in bone tissue ±s

表3 骨組織中RANKL蛋白表達(dá)情況Tab.3 Expression of RANKL protein in bone tissue ±s

注：與E組比較，*P＜0.05；與D組比，#P＞0.05

組別A組（空白組）B組（XACB）C組（XACB+MSCs）D組（XACB+MSCs+LV）E組（XACB+LV?bFGF+MSCs）L3周0.041 8±0.002 7*0.048 9±0.001 4*0.057 4±0.002 9*#0.056 8±0.005 5*0.076 2±0.004 1 L6周0.045 0±0.004 2*0.054 3±0.005 1*0.070 9±0.003 7*#0.075 0±0.001 9*0.093 5±0.004 4 L12周0.056 5±0.002 5*0.065 7±0.005 0*0.078 9±0.004 8*#0.078 8±0.005 0*0.107 0±0.005 2

圖4 骨組織中RANKL蛋白表達(dá)情況Fig.4 Expression of RANKL protein in bone tissue

3 討論

3.1 OPG/RANK/RANKL系統(tǒng) 骨頭生長(zhǎng)、發(fā)育是一個(gè)高度依賴機(jī)體調(diào)節(jié)的過(guò)程。在細(xì)胞水平上依賴于促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)的成骨細(xì)胞和促進(jìn)骨吸收的破骨細(xì)胞之間的相互作用［9］。而 OPG、RANK、RANKL在此過(guò)程中發(fā)揮重要作用。OPG、RANK、RANKL系統(tǒng)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)骨代謝的重要通路，目前已作為主要的標(biāo)志物廣泛用于骨代謝的研究［10］。OPG是一種生長(zhǎng)因子受體，屬于腫瘤壞死因子受體家族。OPG是RANKL的誘導(dǎo)受體，通過(guò)與RANKL的結(jié)合減少破骨細(xì)胞的產(chǎn)生。RANKL在成骨細(xì)胞中表達(dá)，激活破骨細(xì)胞。RANKL過(guò)表達(dá)，可導(dǎo)致一系列骨疾病，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病性關(guān)節(jié)炎等。本實(shí)驗(yàn)中，筆者通過(guò)對(duì)術(shù)后3、6、12周各時(shí)間點(diǎn)各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨組織中OPG及RANKL的蛋白表達(dá)變化情況來(lái)評(píng)價(jià)股骨頭壞死的修復(fù)效果。本實(shí)驗(yàn)采用WB技術(shù)檢測(cè)術(shù)后3、6、12周各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)XACB/LV?bFGF/MSCs在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)使OPG表達(dá)上調(diào)（A、B、C、D組與E組之間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0.05，C組與D組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＞0.05），術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)RANKL蛋白的表達(dá)增高（A、B、C、D組與E組之間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0.05，C組與D組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＞0.05），且OPG蛋白表達(dá)量高于RANKL蛋白表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明XACB/LV?bFGF/MSCs能夠有效促進(jìn)股骨頭壞死的修復(fù)。

表4 骨組織中bFGF蛋白表達(dá)情況Tab.4 Expression of bFGF protein in bone tissue ±s

表4 骨組織中bFGF蛋白表達(dá)情況Tab.4 Expression of bFGF protein in bone tissue ±s

注：與E組比較，*P＜0.05；與D組比，#P＞0.05

組別A組（空白組）B組（XACB）C組（XACB+MSCs）D組（XACB+MSCs+LV）E組（XACB+LV?bFGF+MSCs）3周0.047 8±0.002 0*0.066 1±0.001 8*0.091 1±0.002 5*#0.095 0±0.003 7*0.121 3±0.005 5 6周0.129 3±0.011 1*0.143 7±0.007 3*0.164 3±0.003 5*#0.170 0±0.007 9*0.226 3±0.006 6 12周0.152 7±0.008 0*0.186 7±0.003 0*0.257 3±0.010 7*#0.259 0±0.015 1*0.318 3±0.014 1

圖5 骨組織中bFGF蛋白表達(dá)情況Fig.5 Expression of bFGF protein in bone tissue

3.2 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF） 即FGF?2，是一種促細(xì)胞分裂的肝素結(jié)合蛋白，可誘導(dǎo)多種細(xì)胞的增殖與分化，被認(rèn)為是體內(nèi)最為有效的促血管生成因子之一［11-12］。另外，bFGF還有促進(jìn)毛細(xì)血管生長(zhǎng)，促進(jìn)新骨形成和替代的作用［13-14］。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用WB技術(shù)檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染后的骨髓基制干細(xì)胞中bFGF的表達(dá)情況，以此來(lái)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染后的MSCs中bFGF的表達(dá)量是否增高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果示實(shí)驗(yàn)組、空病毒組和空白組均有bFGF蛋白表達(dá)，且為實(shí)驗(yàn)組＞空病毒組＞空白組，實(shí)驗(yàn)組與空病毒組和空白組之間兩兩比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），空病毒組與空白組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明成功通過(guò)慢病毒將bFGF轉(zhuǎn)染至MSCs中。以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：本實(shí)驗(yàn)成功地通過(guò)慢病毒將bFGF轉(zhuǎn)染至MSCs中，并且XACB/LV?bFGF/MSCs組對(duì)兔股骨頭缺損壞死模型的修復(fù)效果較其他組更優(yōu)，有望作為一種有效的組織工程材料運(yùn)用于股骨頭壞死修復(fù)中。

3.3 本實(shí)驗(yàn)的局限性和不足之處 本實(shí)驗(yàn)僅就慢病毒轉(zhuǎn)染bFGF的MSCs復(fù)合培養(yǎng)XACB對(duì)兔股骨頭壞死的修復(fù)效果進(jìn)行了探索研究，并沒(méi)有進(jìn)行相關(guān)的抑制實(shí)驗(yàn)，同時(shí)本實(shí)驗(yàn)僅針對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行了研究，沒(méi)有對(duì)其在人體內(nèi)的使用效果及作用機(jī)制進(jìn)行研究，因此，下一步筆者還將進(jìn)行相關(guān)的抑制實(shí)驗(yàn)以及對(duì)XACB/LV?bFGF/MSCs在人體內(nèi)的使用效果及作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的探索研究。