IL-28B rs12979860位點(diǎn)基因型檢測在指導(dǎo)丙肝治療中的應(yīng)用價值

瞿 新

湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院 十堰市人民醫(yī)院檢驗科，湖北 十堰 442000

丙型病毒性肝炎(hepatitis C virus, HCV)是慢性肝炎的重要類型，是目前全世界流行最為廣泛的傳染病之一，其引發(fā)的慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C, CHC)發(fā)病隱匿，易被患者忽視，是導(dǎo)致肝硬化、肝癌及肝功能衰竭的主要原因之一[1-2]。國際上治療CHC的標(biāo)準(zhǔn)方案為聚乙二醇干擾素α(Peg-IFNα)聯(lián)合利巴韋林(RBV)，近年來有研究[3]證明，CHC抗病毒治療的臨床療效除了受病毒載量、年齡、種族、肝臟形態(tài)因素影響外，還與位于人體染色體19的編碼干擾素λ3的白細(xì)胞介素-28B(IL-28B)單核苷酸多態(tài)性高度相關(guān)，但多數(shù)報道多集中于IL-28B rs8099917位點(diǎn)，且IL-28B對丙肝治療療效及預(yù)后的預(yù)測價值尚處于初步研究階段。鑒于此，本文就十堰市人民醫(yī)院2014年4月至2017年4月接受標(biāo)準(zhǔn)抗病毒治療的85例CHC患者受體IL-28B rs12979860位點(diǎn)基因多態(tài)性檢測進(jìn)行分析，旨在進(jìn)一步證實其對CHC治療療效及預(yù)后的預(yù)測價值。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2014年4月至2017年4月十堰市人民醫(yī)院收治的85例CHC患者為研究對象，男53例，女32例，年齡(59.31±4.08)歲(21～68歲)，肝功能Child-Pugh分級為B級46例，C級39例；肥胖者15例(17.65%)，有職業(yè)性危害因素接觸(包括苯、汽柴油、甲醛、氨基甲酸酯類、重金屬、染發(fā)劑、殺蟲劑、除草劑、化肥等)者28例(32.94%)，有病毒性肝炎史者16例(18.82%)，有家族肝炎史者12例(14.12%)。

1.2納入及排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥18歲；影像學(xué)、生物化學(xué)或血液學(xué)、組織學(xué)檢查結(jié)果及臨床表現(xiàn)均符合中華醫(yī)學(xué)會推薦的《病毒性肝炎防治方案》[4]中CHC診斷標(biāo)準(zhǔn)；對本研究目的和意義知情同意，并自愿參與。排除標(biāo)準(zhǔn)：預(yù)估生存時間<6個月；其他肝炎病毒及人類免疫缺陷病毒感染(如自身免疫性肝病、脂肪性肝病嗜肝病毒感染)；藥物性或酒精性等因素所致肝功能異常、肝硬化；合并腦肺心腎等重要臟器功能障礙、其他嚴(yán)重系統(tǒng)疾病、血液和惡性腫瘤疾病；伴發(fā)食管胃底靜脈曲張破裂出血、腹水及肝性腦病等嚴(yán)重并發(fā)癥；對Peg-IFNα及RBV過敏或有使用禁忌證；妊娠或哺乳期婦女；臨床病歷及隨訪資料不全。

1.3治療方法所有患者均根據(jù)《病毒性肝炎防治方案》[4]治療標(biāo)準(zhǔn)實施標(biāo)準(zhǔn)化治療方案，即Peg-IFNα聯(lián)合RBV治療。給予Peg-IFNα(美國先靈葆雅公司)180 μg腹部皮下注射，每周1次；按體質(zhì)量給予RBV(浙江誠意藥業(yè)有限公司)800～1 200 mg/d口服，治療療程為48周。

1.4療效評估治療結(jié)束時病毒學(xué)應(yīng)答(ETVR):在治療結(jié)束時，HCV RNA為陰性；持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(SVR)：治療結(jié)束且停藥24周隨訪時，HCV RNA為陰性；復(fù)發(fā)：治療結(jié)束時HCV RNA<15 IU/ml，但停藥后HCV RNA≥15 IU/ml(陽性)。

1.5受體IL-28B基因多態(tài)性測定采用雙色熒光TaqMan分型技術(shù)檢測IL-28B rs12979860位點(diǎn)基因型。主要試劑及儀器包括uctiSENS?easyMAG?system核酸自動提取儀、石蠟包埋組織基因組提取試劑盒(法國梅里埃公司)，PT-200 PCR儀(BIO-RAD)，DYY-8C電泳儀(北京六一儀器廠)。參照Genbank中SNP rs12979860基因序列，采用Vector NTI 11.0軟件設(shè)計引物。針對基因型位點(diǎn)設(shè)計2對等位基因雙色熒光PCR體系，構(gòu)建特異性引物用于直接鑒別rs12979860基因型，上游引物(P1)序列為：5′-ATCTCTGGACGTGGATGGGTAC-3′；下游引物(P2)序列為：5′-AGCGCGGAGTGCAATCTA-3′。擴(kuò)增程序為95 ℃ 5 min預(yù)變性，然后93 ℃ 10 s、61 ℃ 30 s重復(fù)40個循環(huán)，61 ℃時采集熒光。參照說明書提取基因組DNA，按10 μl模板+40 μl反應(yīng)液構(gòu)成PCR反應(yīng)體系，實時熒光定量PCR儀上機(jī)檢測。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料用例數(shù)/%表示，CHC患者治療效果及預(yù)后分析進(jìn)行χ2檢驗；Logistic回歸統(tǒng)計分析模型分析IL-28B rs12979860位點(diǎn)基因多態(tài)性分布與治療效果及預(yù)后的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1IL-28Brs12979860位點(diǎn)基因型檢測結(jié)果85例CHC患者中，CC型68例(80.00%)，CT型16例(18.82%)，TT型1例(1.18%)，CC型檢出率顯著高于非CC型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=61.20，P<0.05)。

2.2IL-28Brs12979860位點(diǎn)基因型與治療效果的關(guān)系CC型患者ETVR率為76.47%、SVR率為82.35%，均明顯高于非CC型的41.18%、52.94%；復(fù)發(fā)率為10.29%，明顯低于非CC型的35.29%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.98、6.54、6.56，P<0.05)(見表1)。

表1 IL-28B rs12979860位點(diǎn)基因型與治療療效的關(guān)系Tab 1 Relationship between IL-28B rs12979860 genotype and therapeutic efficacy 比例/%

2.3IL-28Brs12979860位點(diǎn)基因型與預(yù)后的關(guān)系所有患者均進(jìn)行隨訪，截至2017年9月30日，隨訪時間(16.60±7.15)個月，以出現(xiàn)肝硬化、肝癌等為預(yù)后不良。CC型、非CC型患者預(yù)后不良者分別為4例(5.88%)、4例(23.53%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。單因素分析顯示，預(yù)后不良者中，年齡>59歲、有職業(yè)性危害因素接觸、肥胖、病毒性肝炎史及非CC型的患者占比顯著高于預(yù)后良好者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見表2)。為排除混雜因素的干擾，以預(yù)后為因變量(0=預(yù)后良好，1=預(yù)后不良)，以相關(guān)因素為自變量，并賦值，進(jìn)行多因素非條件Logistic回歸分析。賦值如下：年齡<39歲=0，39～59歲=1，>59歲=2；性別男=0，女=1；有職業(yè)性危害因素接觸=0，無=1；肥胖=0，否=1；有病毒性肝炎史=0，無=1；有家族肝炎史=0，無=1；IL-28B rs12979860位點(diǎn)基因型CC型=0，非CC型=1。多因素非條件Logistic回歸分析顯示，年齡、職業(yè)性危害因素接觸、肥胖、病毒性肝炎史及IL-28B rs12979860位點(diǎn)基因型是影響患者預(yù)后的危險因素(P<0.05)(見表3)。

表2 影響CHC患者預(yù)后的單因素分析Tab 2 Single factor analysis on the prognosis of CHC patients 比例/%

表3 影響CHC患者預(yù)后的多因素非條件Logistic回歸分析Tab 3 Non-conditional Logistic regression analysis with multiple factors on the prognosis of CHC patients

3 討論

IL-28B即宿主19號染色體負(fù)責(zé)編碼IL-28B，是2003年國際人類基因組組織新發(fā)現(xiàn)的IFN家族的一員[5]，隨后2009年GE等[6]在《Nature》上發(fā)表了第1篇HCV感染相關(guān)的全基因組關(guān)聯(lián)分析研究，進(jìn)一步闡述了IFN-λ3型干擾素基因，認(rèn)為該基因上游rs12979860位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性與CHC治療的應(yīng)答緊密相關(guān)。國內(nèi)的研究表明，HCV干擾素治療SVR率為60%～90%，如劉佳等[7]的報道發(fā)現(xiàn)，CC型、CT型和TT型患者獲得 SVR率分別為71.31%、48.57%、0，有顯著性差異，認(rèn)為CC型與SVR關(guān)系密切。目前已經(jīng)明確IL-28B在人體內(nèi)、外均具有免疫調(diào)節(jié)與抗病毒效能，并可促進(jìn)IFN-α的產(chǎn)生，在感染HCV患者的肝臟活組織樣本中能發(fā)現(xiàn)IL-28B mRNAs的存在[8]。周雙男等[9]的分析認(rèn)為，IL-28B的基因多態(tài)性與抗HCV療效及病情進(jìn)展有一定相關(guān)性，一般將不同的IL-28B相關(guān)的基因型稱為保護(hù)性和非保護(hù)性基因型，對于rs12979860位點(diǎn)而言，CC型為保護(hù)性基因型，CT型或TT型(非CC型)為非保護(hù)性基因型，CC型(保護(hù)性基因型)患者可獲得較好的干擾素抗病毒應(yīng)答率。

本研究85例CHC患者中，CC型占80.00%，CT型占18.82%，TT型占1.18%，CC型檢出率顯著高于非CC型，與臨床多數(shù)報道[10-11]的CC型、非CC型頻率分布一致。同時，CC型患者ETVR率、SVR率均明顯高于非CC型，復(fù)發(fā)率明顯低于非CC型，CC型、非CC型患者預(yù)后不良者分別占5.88%、23.53%，差異顯著。提示IL-28B rs12979860位點(diǎn)基因型與CHC標(biāo)準(zhǔn)方案治療療效及預(yù)后密切相關(guān)，與劉立明等[11]的報道相符。多因素非條件Logistic回歸分析進(jìn)一步證實，除了年齡、職業(yè)性危害因素接觸、肥胖、病毒性肝炎史外，IL-28B rs12979860位點(diǎn)基因型是影響患者預(yù)后的危險因素。因此，我們認(rèn)為，可根據(jù)IL-28B rs12979860位點(diǎn)基因型檢測結(jié)果指導(dǎo)CHC的個體化治療。目前，基于患者HCV RNA或IL-28B多態(tài)性個體化治療逐漸成為CHC新的治療方向。且目前臨床已有初步研究，如郭鳳霞等[13]認(rèn)為，通過檢測CHC IL-28B基因型和HCV基因型以指導(dǎo)臨床抗病毒治療，可達(dá)到對標(biāo)準(zhǔn)方案治療療效的預(yù)測。王黎鋒等[14]的臨床研究根據(jù)IL-28B rs12979860位點(diǎn)將患者分為優(yōu)勢組和非優(yōu)勢組，非優(yōu)勢型組中，應(yīng)用普通IFN和Peg-IFNα治療后RVR率分別為16.00%和41.40%，SVR率分別為28.00%和55.17%，差異顯著，由此認(rèn)為檢測宿主IL-28B基因優(yōu)勢型患者初始治療可選擇普通IFN，而非優(yōu)勢型患者初始治療建議選擇Peg-IFNα。陳新月等[15]的研究通過在治療前檢測IL-28B基因型并進(jìn)行治療療程和劑量的調(diào)整，絕大部分(91.0%)患者可獲得EVR，而通過EVR分組對患者進(jìn)行個體化治療的療效較為理想。因此，我們建議在IL-28B rs12979860位點(diǎn)基因型指導(dǎo)下實施個體化治療方案，如可對標(biāo)準(zhǔn)方案中兩種藥物的劑量、治療時間等進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。在實際臨床中，有少數(shù)患者因多種原因不能完成標(biāo)準(zhǔn)治療方案的標(biāo)準(zhǔn)劑量和療程治療，影響總體抗病毒療效及預(yù)后，可能對本研究結(jié)果產(chǎn)生一定影響，因此，本研究相關(guān)結(jié)論仍需后期擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步論證。