RP-HPLC測(cè)定參附強(qiáng)心顆粒中鹽酸多巴胺的含量*

張 翅 吳建國(guó) 徐慧燕 唐 莉 朱雅寧 潘德林△

[1.華潤(rùn)三九（雅安）藥業(yè)有限公司，四川 雅安 625000；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137]

參附強(qiáng)心顆粒是以古代經(jīng)典名方 “參附湯”為依據(jù)，在中藥大品種參附注射液基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)的創(chuàng)新型中藥新藥，主要由紅參、附片兩味藥材和相應(yīng)的輔料組成[1]，治療領(lǐng)域是慢性心力衰竭（CHF）。 CHF 是各種心血管疾病發(fā)展的終末階段[2]，病情復(fù)雜，預(yù)后不良，成為世界范圍重要健康問(wèn)題[3]。心力衰竭患者的臨床表現(xiàn)越典型，經(jīng)常伴隨心力衰竭的許多合并癥也越明顯，如高血壓、房顫、糖尿病、貧血和腎臟受損等，一般病程較長(zhǎng)，需要長(zhǎng)期服藥[4]?，F(xiàn)代藥理研究表明，鹽酸多巴胺為附子的水溶性強(qiáng)心成分，能夠加強(qiáng)心肌收縮力以及加快心肌的收縮速度[5]，靜脈注射 40 μg/kg 可使大鼠血壓升高50%，3 μg/mL則可使豚鼠的右心房和頻率分別增加250%和120%[6-7]。鹽酸多巴胺在臨床上治療頑固性心力衰竭，其臨床效果顯著[8-9]，可提高患者的心排血量，降低患者左心室充盈壓，改善患者的臨床癥狀，促進(jìn)患者的治療和恢復(fù)，且并未出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)[10]。本實(shí)驗(yàn)旨在建立能夠測(cè)定參附強(qiáng)心顆?；钚猿煞种畸}酸多巴胺的高效液相法，以便為更好的控制參附強(qiáng)心顆粒質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 材 料

1.1 儀器 AE-240電子天平（METTLER）；Agilent1 100高效液相色譜儀；AS20500超聲儀（SCIENCE）；pH計(jì)（SARTORIUS pH-10）；KQ-500 型超聲儀（40 KHz，500W）；XP26百萬(wàn)分之一電子分析天平（METTLER TOLEDO）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

JADE-PAK ODS-AQ-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相：0.1%磷酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫，0～15 min，100%～97%A。流速 0.6 mL/min，柱溫 35 ℃，進(jìn)樣量 10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng) 280 nm[11-13]。 理論塔板數(shù)按鹽酸多巴胺計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密量取鹽酸多巴胺對(duì)照品5.35 mg，置50 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，得到質(zhì)量濃度為107.000 μg/mL的溶液，再精密量取1 mL置10 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，即得到質(zhì)量濃度為10.700 μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取參附強(qiáng)心顆粒4.1634 g，加pH等于1的鹽酸水100 mL超聲溶解，得到質(zhì)量濃度為41.634 mg/mL供試品溶液。取適量供試品溶液用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，按照“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行檢測(cè)。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備

取除附片藥材外的其余藥材按處方比例和工藝條件制成缺附片陰性樣品，再按“2.3”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.5 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

采用紫外分光光度計(jì)對(duì)鹽酸多巴胺對(duì)照品溶液在波長(zhǎng)210～400 nm[6]的范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果表明鹽酸多巴胺對(duì)照品溶液在波長(zhǎng)280 nm處有最大吸收，與文獻(xiàn)一致。故選擇波長(zhǎng)280 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 線性范圍考察 見(jiàn)表1，圖1。精密吸取對(duì)照品1、2、4、8、12、16、20 μL，進(jìn)樣，按照“2.1“項(xiàng)下方法進(jìn)行檢測(cè)。以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品鹽酸多巴胺進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程Y=1099.3X+0.4694（r=1），說(shuō)明鹽酸多巴胺在0.0107～0.2138 μg范圍內(nèi)與范圍內(nèi)峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.6.2 精密度試驗(yàn) 見(jiàn)表2。精密吸取鹽酸多巴胺對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，按照“2.1”項(xiàng)下相應(yīng)色譜條件檢測(cè)，記錄峰面積，結(jié)果鹽酸多巴胺的峰面積RSD為0.257%，表明儀器精密度良好。

圖1 對(duì)照品鹽酸多巴胺液相圖

表1 對(duì)照品線性關(guān)系

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 見(jiàn)表3。精密量取常溫放置同一供試品溶液，分別于 0、1、2、4、8、24 h 進(jìn)樣，按照“2.1”項(xiàng)下相應(yīng)色譜條件檢測(cè)，記錄峰面積，結(jié)果樣品中鹽酸多巴胺的平均質(zhì)量濃度為4.92 μg/mL，RSD為0.99%，表明該供試品溶液在室溫24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.6.4 重復(fù)性試驗(yàn) 見(jiàn)表4。精密稱量供試品，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，各6份，按照2.1項(xiàng)下相應(yīng)色譜條件檢測(cè)，記錄峰面積，結(jié)果樣品中鹽酸多巴胺的平均含量為0.1194 mg/g，RSD 1.51%，表明該方法重復(fù)性良好。

研發(fā)投入強(qiáng)度(RD)：創(chuàng)新與制造業(yè)結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)，本文使用研發(fā)投入占GDP的比重衡量創(chuàng)新程度，記為RD。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.6.5 加樣回收試驗(yàn) 見(jiàn)表5。精密吸取已知鹽酸多巴胺含有量的供試品溶液（4.98 μg/mL）10 mL，平行 6份，置25 mL容量瓶中，分別加入對(duì)照品溶液5 mL，用蒸餾水定容至25 mL，搖勻，濾過(guò)，取適量續(xù)濾液按照“2.1”項(xiàng)下相應(yīng)色譜條件檢測(cè)，記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率。

表5 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.6.6 陰性干擾試驗(yàn) 見(jiàn)圖2。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定缺附片陰性對(duì)照樣品，結(jié)果陰性對(duì)照樣品在鹽酸多巴胺對(duì)照品相同保留位置上未見(jiàn)有相同保留時(shí)間的吸收峰，說(shuō)明參附強(qiáng)心顆粒中其他組分對(duì)測(cè)定鹽酸多巴胺含量無(wú)干擾。

圖2 陰性樣品液相圖

2.7 樣品含量測(cè)定

見(jiàn)表6。取3批樣品，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下相應(yīng)色譜條件測(cè)定，采用外標(biāo)法，對(duì)3批參附強(qiáng)心顆粒樣品進(jìn)行測(cè)定，有效成分鹽酸多巴胺的含量測(cè)定結(jié)果分別為 117.9、116.8 、119.2 μg/g。

表6 樣品含量測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果

圖3 對(duì)照品液相圖

3 討 論

3.1 慢性心衰是一種嚴(yán)重的進(jìn)行性疾病，患者的心臟泵血功能會(huì)逐漸衰退，具有發(fā)病率高，死亡率高等特點(diǎn)，是當(dāng)今最重要的心血管疾病之一[14-16]。參附強(qiáng)心顆粒是本公司以古代經(jīng)典名方“參附湯”為依據(jù)，在參附注射液基礎(chǔ)上，開(kāi)發(fā)的新型口服藥物。為保證其臨床療效，制定穩(wěn)定可控的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)非常必要。

3.2 采用本法測(cè)定參附強(qiáng)心顆?；钚猿煞种畸}酸多巴胺，在一定范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回收率高，精密度高，無(wú)陰性干擾。

3.3 本試驗(yàn)考察了酸水和純水兩種溶劑，結(jié)果酸水溶劑測(cè)得鹽酸多巴胺含量為117.9 μg/g，純水溶劑測(cè)得鹽酸多巴胺的含量為37.7 μg/g，酸水溶劑較純水溶劑效果好（見(jiàn)圖4，圖5），這可能和鹽酸多巴胺的結(jié)構(gòu)有關(guān)：在酸性條件下呈分子狀態(tài)，易于溶出（見(jiàn)圖6）。

圖4 酸水溶解樣品液相圖

圖5 純水溶解樣品液相圖

圖6 鹽酸多巴胺結(jié)構(gòu)圖

3.4 本實(shí)驗(yàn)考察了多種色譜系統(tǒng)，如：甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液等，分離效果均不理想，采用乙腈-0.1%磷酸水溶液系統(tǒng)，分離效果較佳。

3.5 本實(shí)驗(yàn)建立的質(zhì)量控制方法對(duì)于參附強(qiáng)心顆粒活性成分指標(biāo)的控制提供了有益參考，為今后該產(chǎn)品研發(fā)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供了依據(jù)。