地黃活性成分梓醇在大鼠體內(nèi)的代謝變化研究*

陳少云 周 靜 李 敏 范紅晶 張宇燕

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053）

地黃為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosa Libosch.的塊根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品。鮮地黃具有清熱生津、涼血、止血的功效，生地黃具有清熱涼血、養(yǎng)陰生津的功效，其炮制品稱為熟地黃，具有補(bǔ)血滋明、益精填髓的功效[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)及臨床研究表明，地黃具有較好的增強(qiáng)免疫功能、止血、抗腫瘤、抗衰老、保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、降血糖、保護(hù)胃簽黏膜、降血脂、保肝等作用[2-10]。

地黃主要含有環(huán)烯醚萜苷類等物質(zhì)，其中含量最高的環(huán)烯醚萜苷是梓醇[11]。而目前對(duì)地黃物質(zhì)基礎(chǔ)的研究也比較集中的是環(huán)烯醚萜類成分，主要以梓醇比較突出[12-13]。大量研究表明，梓醇在心腦血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、降血糖、調(diào)血脂、抗腫瘤、抗輻射、抗骨質(zhì)疏松、抗炎、提高免疫等均有較強(qiáng)的藥理活性[14-18]。梓醇的提取工藝研究也使其具備了大量生產(chǎn)的可能性[19-20]，同時(shí)也開展了梓醇在大鼠體內(nèi)的相關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)研究[21-22]，但關(guān)于梓醇的體內(nèi)代謝途徑和代謝產(chǎn)物尚不清楚，其發(fā)揮藥效功能的作用機(jī)制也有待進(jìn)一步深入。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)大鼠口服地黃水提液后體內(nèi)梓醇的代謝變化，初步探討梓醇在體內(nèi)的可能代謝途徑和變化規(guī)律，可為地黃及含有梓醇的藥物的體內(nèi)外代謝分析和進(jìn)一步的藥效結(jié)合研究提供參考。

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF清潔級(jí)SD雄性大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供），動(dòng)物實(shí)驗(yàn)條件許可證：SCXK（浙）2013-0184。

1.2 試藥與儀器 地黃采購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)名中醫(yī)館，經(jīng)鑒定為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosa Libosch.的塊根，批號(hào)：20170307；其余試劑和藥品均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。Agilent GC6890（安捷倫科技）；質(zhì)譜Qtrap 4500 （AB SCIEX）；HWS26電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器）；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 （常州國(guó)華電器）；DHG-9030A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 （上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備）；3-18K高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma-Aldrich）。

2 方法與結(jié)果

2.1 地黃水提液的制備 稱取地黃50 g，充分粉碎，用10倍體積蒸餾水于45℃恒溫水浴中浸提8 h后過濾，濾液濃縮至1 g/mL，作為地黃水提液。

2.2 血漿樣品的制備 取8只SD大鼠，其中空白對(duì)照組2只，其余為實(shí)驗(yàn)組。禁食，自由飲水，12 h后對(duì)實(shí)驗(yàn)組的大鼠分別灌胃地黃水提液（15 mL/kg），于給藥后 5、15、30、45、60、90、120、240、360、480 min 眼 眶取血0.3 mL，置于離心管中，在8000 r/min條件下離心10 min，取上層血漿置于離心管中，-20℃冷藏備用。1 h內(nèi)各取樣點(diǎn)尾靜脈注射0.3 mL生理鹽水，1 h后各取血點(diǎn)腹腔注射0.3 mL生理鹽水以補(bǔ)充血容量。

2.3 HPLC-MS分析血漿中梓醇及潛在代謝物 取血漿0.2 mL加入20% 三氯乙酸水溶液20 μL沉淀蛋白，渦旋2 min，在 12000 r/min條件下離心 10 min，取上清液，0.45 μm水系微孔濾膜過濾，HPLC-MS進(jìn)樣分析。HPLC條件：色譜柱Zorbax C18柱，梯度洗脫，流動(dòng)相A：水（含2 mmol/L乙酸銨和0.05%甲酸），流動(dòng)相B：乙腈（含 0.05%甲酸），柱溫 40℃，流速 0.7 mL/min。MS 條件：負(fù)離子模式，CUR 25，IS 5500，TEM 575，GS1 60，GS2 60，CAD Medium。對(duì)質(zhì)譜圖進(jìn)行分析，并根據(jù)梓醇及代謝可能途徑的碎片離子分析判斷梓醇及潛在代謝物，結(jié)果見表1、圖1、圖2，結(jié)果表明，梓醇進(jìn)入大鼠體內(nèi)后，除其本身分子以外，發(fā)現(xiàn)了6個(gè)轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物，分別是：異構(gòu)體（Isomer）、甲基化物（M1， Methylation）、羥基化物（M2，Hydrogenation）、糖基化物（M3，Glucose）、 脫氧羥基化物 （M4，Hydrogenation+Loss of O）、脫氧羥基化甲基化物 （M5，Methylation+Hydrogenation+Loss of 2O），并推斷其可能的結(jié)構(gòu)。測(cè)定各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的梓醇及潛在代謝物的濃度觀察在大鼠體內(nèi)的代謝變化過程，見圖3，結(jié)果顯示，梓醇及其多個(gè)代謝物在大鼠血液中的濃度均在灌胃后45 min達(dá)到最高，隨后呈下降趨勢(shì)，在240 h時(shí)基本代謝完成。

表1 梓醇潛在代謝物列表

圖1 梓醇及其代謝物的質(zhì)譜圖

圖2 梓醇及其可能代謝途徑

圖3 梓醇及其代謝物的代謝變化曲線

3 分析與討論

梓醇是地黃的主要活性成分，具有較強(qiáng)的藥理活性，也是地黃物質(zhì)基礎(chǔ)研究的重點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)，根據(jù)梓醇的結(jié)構(gòu)及碎片離子規(guī)律，分析鑒定出地黃水提液進(jìn)入大鼠體內(nèi)后，大鼠血漿中除了梓醇分子以外，還有1個(gè)異構(gòu)體和5個(gè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物：異構(gòu)體、甲基化物、羥基化物、糖基化物、脫氧羥基化物和脫氧羥基化甲基化物，并推斷其可能的結(jié)構(gòu)，分析梓醇體內(nèi)代謝途徑。

從動(dòng)態(tài)代謝過程曲線顯示，梓醇及其代謝物在大鼠血液中的濃度均在灌胃后45 min達(dá)到最高，隨后呈下降趨勢(shì)，240 h后濃度降至最低。梓醇與其代謝物可同時(shí)存在于大鼠體內(nèi)，協(xié)同發(fā)揮較強(qiáng)的藥理活性，本研究可以為地黃及含有梓醇的藥物的體內(nèi)外代謝分析、與藥效結(jié)合的藥動(dòng)學(xué)-藥效學(xué)（PK-PD）研究及對(duì)深入梓醇的作用機(jī)理研究提供參考。