潰結(jié)寧膏穴位敷貼對實驗性潰瘍性結(jié)腸炎大鼠IL-6/JAK2/STAT3信號通路的影響*

毛 婧朱 瑩 周 瑾陳 凱陳 程

（1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙410005）

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種發(fā)生在直腸和結(jié)腸的發(fā)病機制尚不明確的慢性非特異性炎癥性疾病。目前關(guān)于細胞信號通路介導和調(diào)節(jié)UC腸道免疫應(yīng)答已被廣泛研究，白細胞介素-6（IL-6）/信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）信號通路在其中起著重要調(diào)控作用[1-3]，而該信號通路激活所引發(fā)的輔助性T淋巴細胞17/調(diào)節(jié)性T淋巴細胞Treg（Th17/Treg）失衡是介導腸道免疫功能紊亂的核心環(huán)節(jié)[4]?，F(xiàn)代醫(yī)學治療UC以柳氮磺胺吡啶等藥物為主，副作用大，容易復發(fā)。本文通信作者朱瑩教授運用自制潰結(jié)寧膏穴位敷貼治療本病，在患者依從性好，操作簡單的優(yōu)勢下，臨床療效肯定。本實驗基于前期實驗基礎(chǔ)，觀察潰結(jié)寧膏對脾腎陽虛型UC大鼠模型的療效，檢測結(jié)腸 IL-6、gp130、JAK2、STAT3蛋白表達，進而探討潰結(jié)寧膏治療UC的機制。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠52只，體質(zhì)量180～200 g，購自湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心，合格證號：43006700010784。

1.2 藥物與試劑 噁唑酮，5 g/瓶，美國Sigma。腺嘌呤，1 g/瓶，美國Sigma。10%水合氯醛，上海展云有限公司。 多聚甲醛溶液，Biosharp。 一抗（IL-6、gp130、JAK2、STAT3），Bioss。二抗（山羊抗兔鼠通用），Biosswamp。柳氮磺吡啶（SASP），0.25 g/片，上海三維制藥公司，研細過篩后配成混懸液。番瀉葉，購自湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院門診藥房，經(jīng)中藥房煎煮后濃縮為0.87 g/mL藥液，保存于4℃冰箱。潰結(jié)寧膏，藥物組成：炮附子、細辛、延胡索、赤芍、丁香、白芥子、生姜；無藥物的巴布劑基質(zhì)，藥物組成：聚丙烯酸鈉、明膠、高嶺土、甘羥鋁、蓖麻油、甘油、聚乙烯醇，均由湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院藥劑科制成直徑0.4 cm，厚0.25 cm藥餅。

1.3 實驗儀器 電泳儀，BIO-RAD （mini protean 3 cell）。酶標儀，芬蘭雷勃（MK3）。全自動化學發(fā)光分析儀，上海天能（Tanon-5200）。UPT優(yōu)普特實驗室超純水器，法國MilliPORE（ULUPURE優(yōu)普）。冰箱，中國Haier（BCD-196TMZL）。 離心機，德國 Eppendorf（Centrifuge 5424 R）。

1.4 分組與造模 將大鼠隨機分為空白組、模型組、敷貼組、SASP組。參考文獻[5-6]，空白組予生理鹽水灌胃（10 mL/kg）、灌腸（0.45 mL）。 模型組、敷貼組、SASP組第 1、2周每日予腺嘌呤灌胃（10 mL/kg）；第 3、4周每日予冰番瀉葉藥汁灌胃（10 mL/kg），配合冰水濕潤皮毛、電風扇吹干處置；第29日大鼠背部用剃毛器脫毛2 cm×2 cm裸露皮膚，并予5%噁唑酮（無水乙醇配）0.3 mL皮膚致敏；第33、35日腹腔麻醉后行灌腸，灌腸溶液予5%噁唑酮（50%乙醇配）0.45 mL。造模結(jié)束4 d后抽取2只大鼠行結(jié)腸病理學檢查，結(jié)果示所抽取2只大鼠結(jié)腸黏膜有潰瘍，潰瘍深至肌層，伴炎癥反應(yīng)，提示UC造模理想。參考文獻[7]擬定脾腎陽虛UC模型大鼠宏觀診斷標準：1）便溏，黏液膿血便；2）畏寒喜暖，蜷縮聚堆；3）食欲不振，毛發(fā)枯槁或脫落；4）口唇或爪尾紫暗；5）精神萎靡，倦怠，弓背；6）嗜睡，乏力，活動減少。具備前3項即可認為符合標準。將不符合標準的5只大鼠予以排除。

1.5 干預方法 造模成功后1周開始給藥干預，空白組、模型組每日以生理鹽水灌胃（10 mL/kg）、無藥物的巴布劑基質(zhì)穴位敷貼；敷貼組以生理鹽水灌胃（10 mL/kg）、潰結(jié)寧膏穴位敷貼。SASP組以SASP（50 mg/kg）灌胃、無藥物的巴布劑基質(zhì)穴位敷貼。以上各組穴位選氣海、中脘、天樞、足三里，每次1.5 h，足三里、天樞每次貼一側(cè)，左右交替[8]。連續(xù)給藥28 d后予10%水合氯醛（0.2 mL/100 g）麻醉大鼠取材。

1.6 標本采集與檢測 1）一般臨床觀察。實驗期間每天觀察大鼠體質(zhì)量、飲食飲水、大便次數(shù)、性質(zhì)、有無血便及精神、活動、拱背、懶動、毛發(fā)光澤度等一般狀況。2）疾病活動指數(shù)（DAI）評分。實驗期間監(jiān)測大鼠體質(zhì)量、大便性狀、血便情況[9]。 3）病理形態(tài)學觀察。 組織病理制片：取一塊病變結(jié)腸組織約1 cm，10%甲醛溶液固定，組織脫水，常規(guī)石蠟包埋，切片（4 mm），HE染色，中性樹脂膠封片，顯微鏡下觀察組織學變化。4）Western blot檢測大鼠結(jié)腸黏膜中 IL-6、gp130、JAK2、STAT3蛋白表達。將結(jié)腸組織剪碎，按每20 mg組織加入150～250 μL裂解液的比例加入裂解液，勻漿器勻漿直至完全裂解。裂解后的樣品4℃12000×g離心15 min，取上清，用BCA蛋白濃度檢測法進行蛋白質(zhì)定量。每孔上樣量為10 μg蛋白，加入上樣緩沖液后沸水浴10 min使蛋白變性后離心取上清上樣，將配制好的聚丙烯酰胺凝膠放入電泳槽中，電泳完畢后，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，將膜置于Blocking Buffer封閉液中封閉2 h。 然后加入一抗 （IL-6、gp130、JAK2、STAT3）4 ℃過夜，Phosphate Buffer Saline（PBS）洗滌 3次，每次5 min，再加入二抗4℃孵育過夜，PBS洗滌3次，每次5min。將膜放置在暗室中，根據(jù)用量取Electro-Chemi-Luminescence（ECL）發(fā)光液 A和 B等量混勻，加在膜的正面與之充分接觸，然后將膜置于全自動化學發(fā)光分析儀中檢測。

1.7 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，檢驗各組數(shù)據(jù)正態(tài)性及方差齊性，多組間比較用單因素方差分析，方差齊性時用LSD法，方差不齊時用Tamhane′s法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 給藥前除空白組外其余3組相繼出現(xiàn)嗜睡懶動、毛發(fā)稀疏、爪甲暗紫、體質(zhì)量下降、大便變稀、肛周污穢。給藥后3組癥狀有不同程度改善，以敷貼組和SASP組明顯：大鼠精神狀態(tài)轉(zhuǎn)佳，大便轉(zhuǎn)成形，肛周變清潔，毛發(fā)轉(zhuǎn)光澤，聚堆拱背減少，飲食飲水增加，體質(zhì)量增長；模型組體質(zhì)量無明顯增長，仍嗜睡、懶動、毛發(fā)無光澤。

2.2 各組治療前后DAI評分比較 見表1。與模型組相比，敷貼組、SASP組治療后DAI評分顯著降低（P＜0.01）。

表1 各組治療前后DAI評分比較（分，±s）

表1 各組治療前后DAI評分比較（分，±s）

與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01。 下同

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2.3 各組病理形態(tài)學觀察比較 見圖1?？瞻捉M：大鼠結(jié)腸黏膜、黏膜下層、肌層均未見異常，腺體結(jié)構(gòu)清晰，無炎性細胞浸潤。模型組：結(jié)腸黏膜缺損，潰瘍破壞黏膜層、黏膜下層，甚至肌層，腺體紊亂，伴大量中性粒細胞、淋巴細胞浸潤。敷貼組：病變明顯減輕，潰瘍變淺變小，腺體排列尚規(guī)則，肉芽組織增生，伴少量炎性細胞浸潤。SASP組：黏膜上皮基本完整，潰瘍面愈合，腺體增生，肉芽組織增生，炎性細胞浸潤減少。

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織形態(tài)學（HE染色，100倍）

2.4 各組大鼠結(jié)腸組織 IL-6、gp130、JAK2、STAT3蛋白表達比較 見表2、圖2。與空白組相比，模型組、敷貼組及 SASP組大鼠結(jié)腸組織 IL-6、gp130、JAK2、STAT3表達顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組相比，敷貼組與 SASP組 IL-6、gp130、JAK2、STAT3表達水平均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。敷貼組與SASP組比較，其大鼠結(jié)腸組織IL-6、gp130、JAK2、STAT3表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠結(jié)腸組織IL-6、gp130、JAK2、STAT3蛋白表達比較（±s）

表2 各組大鼠結(jié)腸組織IL-6、gp130、JAK2、STAT3蛋白表達比較（±s）

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圖2 大鼠結(jié)腸黏膜IL-6、gp130、JAK2、STAT3蛋白條帶

3 討 論

結(jié)合臨床表現(xiàn)，UC屬于中醫(yī)之 “腸癖”“泄瀉”，據(jù)統(tǒng)計，UC中醫(yī)證候類型以脾腎陽虛、濕熱、肝郁脾虛最為常見[10]，導師朱瑩教授認為，本病以慢性持續(xù)發(fā)作為特點，患者多可表現(xiàn)為脾腎陽虛為本，瘀血積滯為標的虛實夾雜證型。朱瑩教授結(jié)合多年經(jīng)驗，應(yīng)用潰結(jié)寧膏治療UC，膏中炮附子、細辛、丁香溫脾腎而散寒凝，延胡索、赤芍散瘀止痛，白芥子、生姜增強藥物透皮性。多藥配伍，共奏溫腎暖脾、活血化瘀之功效。

研究發(fā)現(xiàn)，UC患者血清中IL-6含量明顯增高，并與病變嚴重程度、病變范圍及炎癥等級呈正相關(guān)[11]。IL-6是一種多效性細胞因子，與靶細胞上特異性受體結(jié)合從而發(fā)揮多種生物學效應(yīng)。研究表明，早期免疫反應(yīng)時激活經(jīng)典的IL-6信號轉(zhuǎn)導通路：IL-6首先與靶細胞膜上IL-6R，該復合物與gp130相關(guān)聯(lián)后，促使其二聚化并啟動胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導[12-13]。其中活化Janus激酶（JAK2），從而激活下游效應(yīng)分子信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3），STAT3經(jīng)磷酸活化后入核，調(diào)控下游靶基因轉(zhuǎn)錄，參與炎癥調(diào)節(jié)[14]。在DSS大鼠UC模型中，IL-6和STAT3表達增高，其表達隨病變程度的增高而增高[15]。課題組前期研究脾腎陽虛型UC大鼠模型[16]，發(fā)現(xiàn)潰結(jié)寧膏穴位敷貼能夠上調(diào)抗炎因子IL-4、IL-10并下調(diào)促炎因子干擾素-γ[17]，提示潰結(jié)寧膏治療UC可能與調(diào)節(jié)輔助性T細胞1/輔助性T細胞2平衡相關(guān)。而IL-6/STAT3信號通路激活所引發(fā)的輔助性T淋巴細胞失衡是介導腸道免疫功能紊亂的核心環(huán)節(jié)。為揭示IL-6下游級聯(lián)反應(yīng)，本實驗觀察大鼠結(jié)腸組織 IL-6、gp130、JAK2、STAT3 蛋白的表達。

本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠一般狀態(tài)、疾病活動指數(shù)評分、病理學形態(tài)好轉(zhuǎn)不明顯，結(jié)腸組織IL-6、gp130、JAK2、STAT3蛋白表達明顯增高，提示模型組大鼠結(jié)腸組織炎癥失調(diào)，IL-6/JAK2/STAT3信號通路高表達。敷貼組及SASP組大鼠一般表現(xiàn)、病理學形態(tài)較模型組好轉(zhuǎn)，IL-6、gp130、JAK2、STAT3 蛋白水平降低，表明潰結(jié)寧膏穴位敷貼對UC的治療可能通過抑制或阻斷IL-6/JAK2/STAT3信號通路發(fā)揮作用。