液相色譜法測定醬油中的玉米赤霉烯酮含量

□ 烏吉木 高 祥 內(nèi)蒙古巴彥淖爾市食品藥品檢驗所

玉米赤霉烯酮又稱ZEA毒素、F-2毒素，主要會污染谷物及谷物制品。ZEA酮具有雌激素作用，其主要作用于生殖系統(tǒng)，能夠讓動物產(chǎn)生雌性激素亢進(jìn)癥。妊娠期的動物（包括人）食用含ZEA的食物可引起流產(chǎn)、死胎和畸胎。食用含ZEA麥面粉制作的食物可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的中毒癥狀，如惡心、發(fā)冷、頭痛等。

我國規(guī)定谷物及其制品中的ZEA GB2761-2017 限量指標(biāo)為≤ 60μg/kg，一般采用高效液相色譜法、熒光光度法、液相色譜-質(zhì)譜法和試劑盒等方法檢測。

本文通過對國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.209-2016第一法進(jìn)行優(yōu)化，分別對方法檢出限濃度、定量限濃度、檢出限和定量限中間點濃度等進(jìn)行加標(biāo)實驗，結(jié)果表明，用HPLC法進(jìn)行玉米赤霉烯酮質(zhì)量濃度的測定，回收率和精密度均滿足GB/T 27404-2008的要求。

1 試劑和材料

超純水、乙腈（Honeywell色譜級）、甲醇（Honeywell色譜級）、ZEA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（TMstandard）、提取液（甲醇（科密歐）∶水:=80∶20，v/v）、ZEA免疫親和柱（Romer和中檢維康）。

2 儀器

安捷倫高效液相色譜儀1260、氮吹儀、熒光檢測器。

3 標(biāo)準(zhǔn)溶液

玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（TMstandard批號0331707編號17924-92-4）50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，4 ℃以下避光保存。將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用流動相稀釋，配制成系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

4 實驗方法

4.1 提取

本次實驗采用市售醬油，準(zhǔn)確稱取 25 g（0.001 g） 放 于 150 mL比 色管中，加入提取液定容至100 mL，倒入250 mL具塞三角瓶中，震搖60 min。過濾，準(zhǔn)確吸取10 mL濾紙過濾于50 mL比色管中，用水定容到50 mL，混勻。

4.2 凈化

將免疫親和柱放置至室溫后與固相萃取裝置連接，加入樣品與水混合液10 mL，使混合液緩慢通過小柱，棄去流出液。待混合液完全流出小柱時，先向上樣器中加入10 mL水進(jìn)行淋洗2遍，棄去全部流出液。最后將小柱下方連接5 mL收集管，用0.5 mL甲醇洗脫3次，收集洗脫液。

4.3 濃縮

將收集到的1.5 mL左右的洗脫液于低于55 ℃氮氣吹干，再用流動相定容至1 mL，過0.45 μm有機(jī)濾膜，待上機(jī)。

圖1 玉米赤霉烯酮出峰色譜圖

4.4 空白試驗

不稱取樣品，按4.1～4.3的步驟做空白試驗。

4.5 色譜條件

色譜柱：安捷倫C18色譜柱，4.6 mm×150 mm，5 μm。 流 動 相：乙腈、水、甲醇的體積比為30∶40∶30。流速：1 mL/min。檢測波長：激發(fā)波長274 nm，發(fā)射波長440 nm。進(jìn)樣量：20μL。柱溫：35℃。

5 結(jié)果與結(jié)論

5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)性

按上述色譜條件下對標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行測定，得到玉米赤霉烯酮出峰色譜圖，如圖1所示。

將標(biāo)準(zhǔn)系列溶液按前色譜條件下進(jìn)行分析，將濃度作為橫坐標(biāo)（x），將其相應(yīng)的峰面積作為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，得到線性回歸方程為y=0.01460x+0.00000；線性范圍0、10、50、100、200、500 μg/L 內(nèi)相關(guān)系數(shù)R2為0.999833。在本實驗色譜條件下目標(biāo)化合物圖1保留時間穩(wěn)定，重現(xiàn)性良好。

5.2 測定醬油中玉米赤霉烯酮加標(biāo)

表1 加標(biāo)回收試驗結(jié)果

表2 醬油加標(biāo)135μg/kg結(jié)果

圖2 醬油中玉米赤霉烯酮加標(biāo)出峰色譜圖

本次實驗中，樣品中未檢出玉米赤霉烯酮。樣品經(jīng)凈化后試劑對實驗無明顯干擾，見加標(biāo)樣品色譜圖，如圖2所示。

濃度分別為215、500μg/kg倆個水平的加標(biāo)回收實驗，每個水平平行測定8次，計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）結(jié)果見表1。

5.3 檢出限的測定

以儀器的S/N=3計算，測得該方法玉米赤霉烯酮的最低檢出限。用外延法計算該實驗室本檢驗方法檢出限。醬油加標(biāo)135μg/kg，實際測得平均值為131.98μg/kg、回收率是86.0%～105.1%、RSD值為4.9%，測得檢出限51μg/kg。結(jié)果見表2。

本次實驗中，空白試驗與樣品中均未檢出玉米赤霉烯酮。樣品經(jīng)凈化后試劑對實驗無明顯干擾，通過5.2和5.3可以看出，本實驗方法準(zhǔn)確度、回收率，符合國標(biāo)GB/T 27404-2008的要求，可以滿足實際檢測需求。

5.4 樣品提取方法分析

用GB 5009.209-2016方法中醬油的提取方法為乙腈萃取，經(jīng)實驗證明醬油和乙腈有明顯的分層現(xiàn)象，乙腈的提取回收率分別為44.02%、40.44%、41.50%、43.03%。與5.2和5.3中80%甲醇水提取的回收率相比較，乙腈不適合提取醬油中的玉米赤霉烯酮。本實驗使用80%的甲醇水進(jìn)行提取，回收率明顯高于乙腈方法提取，故采用80%甲醇水提取較好。

6 結(jié)論

本次實驗較之國家標(biāo)準(zhǔn)方法，使用了80%甲醇水溶液并減少了上機(jī)檢測的進(jìn)樣量，通過濃縮重新溶解等方式使得上機(jī)檢測濃度得到保證，這樣得到優(yōu)化的提取方法，大大提高了檢測效率。加標(biāo)試驗結(jié)果可達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.209-2016第一法的檢出限，并符合GB/T 27404-2008對方法確認(rèn)的要求。這說明本方法在進(jìn)行玉米赤霉烯酮在醬油中的含量檢測時，分析方法簡便、前處理簡單、分析結(jié)果可靠，可廣泛用于實驗室檢測與企業(yè)的質(zhì)量檢測、質(zhì)量控制。