葡萄VviSEP2基因的克隆及表達(dá)分析

朱惠君，唐玉瑾，張勝平，張朝紅，李 琰

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué)a生命科學(xué)學(xué)院，b園藝學(xué)院，農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，陜西 楊凌712100；2 南京中山制藥有限公司，江蘇 南京210046)

葡萄(VitisviniferaL.)果實鮮美、香味濃郁、營養(yǎng)豐富。據(jù)國際葡萄與葡萄酒組織 (international organisation of vine and wine，OIV) 最新統(tǒng)計預(yù)測，全球葡萄種植面積在2015年上升至75 340 km2，中國鮮食葡萄產(chǎn)量已持續(xù)多年位居世界第一。無核葡萄是鮮食葡萄的主要類型，根據(jù)授粉結(jié)實特性差異可將無核葡萄分為單性結(jié)實、假單性結(jié)實(種子敗育型)和刺激性單性結(jié)實3類。單性結(jié)實品種的卵細(xì)胞不經(jīng)過受精作用或其他物質(zhì)刺激而直接發(fā)育形成果實，沒有種子形成，其無核性狀不能遺傳給下一代，因此在育種中難以利用[1]，而且品種很少，生產(chǎn)價值極低。刺激性單性結(jié)實本身為有核品種，常用激素處理產(chǎn)生無核，不同年份處理后無核率有差異，而且果品安全性受到消費者質(zhì)疑。假單性結(jié)實型無核葡萄可以正常進(jìn)行授粉受精，但受精胚珠在發(fā)育過程中敗育解體不能形成正常的種子，在果實成熟時殘留大小不同的種痕[2-3]。優(yōu)良的假單性結(jié)實型無核品種僅留下小而軟的種子痕跡，因此人們在食用時感覺不到種子的存在。假單性結(jié)實無核葡萄胚珠的敗育在不同時間、不同地點穩(wěn)定性較高，主要由假單性結(jié)實型無核葡萄的基因決定。近年來，葡萄無核基因研究引起許多科研工作者的重視，且已經(jīng)開展了大量研究工作[4-9]，但目前為止葡萄胚珠敗育過程中的分子機理依然未被徹底揭示。

MADS-box家族成員是廣泛存在于真菌、植物和動物中的一類轉(zhuǎn)錄因子。植物中MADS-box基因功能最早被鑒定出可調(diào)控花器官發(fā)育，但后來研究表明，MADS-box基因家族不同成員在植物生長發(fā)育的多種生命過程中發(fā)揮著非常重要的作用[10],例如果實形成[11]、離區(qū)發(fā)育[12]、分生組織決定[13]以及應(yīng)答外界脅迫[14]等。植物中MADS-box基因家族被劃分為類型Ⅰ和類型Ⅱ。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析可將類型Ⅰ中MADS-box基因分為Mα、Mβ、Mγ和Mδ型4類[15]。類型Ⅱ則包括動物和酵母中的MEF2-類基因和植物中的MIKC型基因[16]。

MIKC型基因包括MADS(M-)、intervening(I-)、keratin-like (K-)和 C-terminal (C-)結(jié)構(gòu)域[17-18]，而MIKC型MADS-box基因根據(jù)I結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)差異又可分為MIKCC和MIKC*2個亞類[19]。MIKCC類基因最早在金魚草和擬南芥中作為花器官特征決定基因被鑒定出來。按照它們在花器官發(fā)生過程中的功能可將其分為A、B、C、D和E 5類，這5類基因經(jīng)過不同組合可以特異地決定花萼片(A + E)、花瓣(A + B + E)、雄蕊(B + C + E)、心皮(C + E) 和胚珠(D + E)的發(fā)育。關(guān)于MADS-box基因參與胚珠和種子發(fā)育的研究有很多[20-28]，其中SEP基因影響胚珠發(fā)育的相關(guān)報道較多，而SEP基因是MIKCC亞類中E類成員之一。Favaro等[29]對SEP基因突變體的研究顯示，突變體后代部分胚珠會轉(zhuǎn)化為葉片狀和心皮狀結(jié)構(gòu)，說明SEP基因是正常胚珠發(fā)育所必需的。

本研究以本課題組構(gòu)建的‘無核白’葡萄胚敗育過程中的胚珠全長cDNA(complementary DNA)文庫為材料，克隆得到VviSEP2基因，同時采用半定量RT-PCR和實時熒光定量PCR技術(shù)，分別對VviSEP2基因在葡萄各組織器官及無核葡萄品種‘無核白’和有核葡萄品種‘黑比諾’胚珠發(fā)育不同時期的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，以此來探究VviSEP2基因與葡萄胚敗育之間的關(guān)系，為無核葡萄胚珠敗育研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用‘無核白’葡萄胚敗育過程中的胚珠全長cDNA文庫庫液,保存于農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室;假單性結(jié)實型無核葡萄品種‘無核白’(Vitisviniferacv.Thompson Seedless)和有核品種‘黑比諾’(Vitisviniferacv.Pinot Noir),均來自于西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院種質(zhì)資源圃。于‘無核白’和‘黑比諾’葡萄初花期時，將花穗穗尖及已經(jīng)盛開的花蕾除去，隨后用紙袋將整個花穗套袋，3 d后解開紙袋并將未盛開的花蕾除去，以達(dá)到使整個花穗花期基本保持一致的目的。自花后10 d開始，每隔5 d分別采集‘無核白’和‘黑比諾’葡萄的果穗，直至花后45 d結(jié)束。將采集到的果穗置于冰上剝離出胚珠后裝入2 mL離心管內(nèi)，隨后立即液氮冷凍并保存于-80 ℃冰箱中備用，同時采用同樣的方法采集保存‘黑比諾’和‘無核白’的葉片、花蕾、花、胚珠、莖、根等組織器官。

1.2 VviSEP2基因的克隆

使用擬南芥MADS-box基因搜索葡萄基因組數(shù)據(jù)庫12x.2(https://urgi.versailles.inra.fr/Species/Vitis/Data-Sequences/Genome-sequences)，將所有E值<0.01的序列在NCBI公共數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，獲得NCBI中對上述序列的預(yù)測基因序列，并根據(jù)sNCGGa (international super-nomenclature committee for grape gene annotation)所制定的葡萄基因命名系統(tǒng)對葡萄SEP亞家族基因進(jìn)行命名。挑選VviSEP2的預(yù)測序列(XM_002263003.3)為參考，在ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)中找出預(yù)測序列的最大開放閱讀框ORF(open reading frame)，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，VviSEP2-F：5′- AACCTTAGATACCCACCAC-3′；VviSEP2-R：5′- CAATTCAAACAGTCTCATGC-3′。以‘無核白’葡萄胚敗育過程中的胚珠全長cDNA文庫為模板進(jìn)行PCR擴增，并使用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果，膠回收正確片段后連接pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，在LB (Luria-Bertani) 培養(yǎng)基上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選單克隆進(jìn)行菌液PCR檢測，檢測正確后測序。將測序得到的序列與預(yù)測序列進(jìn)行比對，相似性大于99%則認(rèn)為克隆得到該基因。PCR反應(yīng)體系：模板(50 ng/μL)1 μL，正向和反向引物(10 μmol/L)各1 μL，10×LA PCR Buffer (Mg2+plus)2.5 μL，dNTP Mixture 2.5 μL，LA Taq (5 U/μL) 0.3 μL，加ddH2O補齊至25 μL。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min，12 ℃保存。

1.3 VviSEP2基因的序列分析

將克隆得到的VviSEP2基因cDNA序列在ORF Finder中找出最大ORF，利用NCBI的BLASTP對ORF預(yù)測蛋白序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測；利用Expasy的ProtParam預(yù)測蛋白的基本性質(zhì)；在GenBank中收集擬南芥和葡萄MIKC亞類基因編碼的蛋白序列，并利用DNAMAN和MEGA6.0軟件分別進(jìn)行多序列比對分析和進(jìn)化分析。

1.4 VviSEP2基因的表達(dá)分析

按照購買的OMEGA植物RNA小量提取試劑盒(R6827-02，Plant RNA Kit)說明書中的步驟，分別從‘黑比諾’和‘無核白’葡萄各時期胚珠，‘黑比諾’與‘無核白’的葉片、花蕾、花、胚珠、莖、根等組織器官中提取葡萄總RNA，并用DNase進(jìn)行純化，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA品質(zhì)后選取高品質(zhì)的RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。將得到的cDNA稀釋到100 ng/μL后作為半定量分析的模板，以Actin基因為內(nèi)參，引物Actin-F：5′-CTCTATATGCCAGTGGGCGTAC-3′，Actin-R：5′-CTGAGGAGCTGCTCTTTGCAG-3′。根據(jù)VviSEP2測序得到的序列為模板設(shè)計特異引物，RT-VviSEP2-F：5′-AACCTTAGATACCCACCACCCA-3′，RT-VviSEP2-R：5′-CACTCTTCCTCTCCCCATTCTC-3′。半定量分析的反應(yīng)體系為：‘黑比諾’和‘無核白’葡萄葉片、花蕾、花、胚珠、莖、根的cDNA及其8個時期胚珠cDNA的等量混合液1 μL，上游引物0.8 μL，下游引物0.8 μL，9.8 μL 2×Taq Mastermix，ddH2O補齊至20 μL。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，57～60 ℃(根據(jù)引物不同而不同)30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；最后72 ℃ 10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果。

qRT-PCR使用iQ5 Real-Time PCR儀器(Bio-Rad，美國)，每個PCR反應(yīng)進(jìn)行3個技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)體系為：‘黑比諾’和‘無核白’葡萄各時期胚珠cDNA模板1 μL，上下游引物各0.8 μL，2×SYBR?PremixExTaqTMⅡ 10 μL，ddH2O 7.4 μL。qRT-PCR反應(yīng)程序為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，58～60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。以Actin基因為內(nèi)參，不同樣品間的相對表達(dá)量用2-ΔΔCt方法進(jìn)行計算。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel制圖，‘黑比諾’和‘無核白’VviSEP2基因在花后胚珠發(fā)育過程中的定量表達(dá)差異通過t-test分析，以P<0.05表示具有差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 VviSEP2基因的克隆與序列分析

用VviSEP2-F和VviSEP2-R在‘無核白’葡萄胚敗育過程中的胚珠全長cDNA文庫中擴增出長約1 000 bp的目的片段，與預(yù)期大小相符。測序獲得序列長度為1 132 bp的cDNA序列，通過ORF Finder 找到一個長741 bp的最大開放閱讀框，編碼246個氨基酸，預(yù)測的蛋白分子質(zhì)量為28.03 ku，等電點(PI)為8.220。將所得序列與參考序列ORF 進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)兩者核酸同源性為99.73%，確認(rèn)克隆得到VviSEP2基因。將克隆基因推測的蛋白質(zhì)序列與葡萄其他MIKCC亞類基因編碼的蛋白序列進(jìn)行比對，結(jié)果(圖1)發(fā)現(xiàn)，VviSEP2具有MADS和keratin-like(K)保守結(jié)構(gòu)域。同時,對從GenBank中收集的擬南芥和葡萄MIKC亞類基因編碼的蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，根據(jù)sNCGGa所制定的葡萄基因命名系統(tǒng)，將該基因命名為VviSEP2(圖2)。

Vvi.葡萄；Vvi后其他字符代表MIKCC基因各成員名稱；圖2同。黑色方框表示保守結(jié)構(gòu)域；背景色表示相似的氨基酸序列Vvi.Vitis vinifera;Other characters after Vvi are names of MIKCC family members;The same for Fig.2.The black boxes indicate the conservative domains, and background colors indicate similar amino acid sequences.圖1 VviSEP2與葡萄其他MIKCC基因編碼氨基酸序列的比對分析Fig.1 Amino acid sequence alignment of MIKCC genes of Vitis vinifera

At.擬南芥；分支上的數(shù)字表示100次重復(fù)抽樣中符合聚類的百分?jǐn)?shù)，枝長與實際進(jìn)化距離不成比例At.Arabidopsis thaliana;The numbers on the branches represent the percentages of 100 replicates that the species are grouped together in the bootstrap analysis,and the branches are not drawn in proportion to their lengths圖2 葡萄及擬南芥中MIKCC基因的進(jìn)化樹分析Fig.2 Phylogenetic tree of MIKCC genes of Arabidopsis thaliana and Vitis vinifera

2.2 VviSEP2基因的組織特異性表達(dá)

由圖3可知，VviSEP2基因只在‘無核白’與‘黑比諾’葡萄的生殖器官(花蕾、花和胚珠)中有表達(dá)，具有組織特異性表達(dá)特征。VviSEP2基因在‘黑比諾’葡萄各生殖器官中的表達(dá)水平基本一致，而在‘無核白’葡萄胚珠中的表達(dá)水平明顯高于花蕾和花中。同時還發(fā)現(xiàn)VviSEP2基因在‘黑比諾’葡萄花蕾和花中的表達(dá)水平高于其在‘無核白’葡萄花蕾和花中的表達(dá)水平。

2.3 VviSEP2基因在葡萄種子發(fā)育過程中的表達(dá)

通過實時熒光定量PCR 技術(shù)，對葡萄SEP2基因在‘黑比諾’和‘無核白’葡萄胚珠發(fā)育過程中的相對表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果(圖4)顯示,該基因在‘黑比諾’葡萄胚珠發(fā)育過程中的相對表達(dá)水平在花后10～45 d呈現(xiàn)遞減趨勢，而在‘無核白’葡萄中則基本不變。同時，VviSEP2在‘黑比諾’中的相對表達(dá)水平在整個胚珠發(fā)育過程中均顯著高于‘無核白’，是‘無核白’相對表達(dá)水平的3～5倍。

1～6分別表示根、莖、葉、花蕾、花和胚珠1-6 represent root,stem,leaf,flower bud,flower and ovule圖3 VviSEP2基因在‘無核白’和‘黑比諾’不同組織中表達(dá)的半定量分析Fig.3 Tissue specific analysis of VviSEP2 gene in ‘Thompson Seedless’ and ‘Pinot Noir’

圖4 VviSEP2基因在花后胚珠發(fā)育過程中的定量表達(dá)情況Fig.4 Expression of VviSEP2 gene during the ovule development after bloom

3 討論與結(jié)論

本研究運用PCR技術(shù)克隆獲得一個‘無核白’胚珠敗育相關(guān)基因，經(jīng)過序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因具有MADS-box家族M和K保守結(jié)構(gòu)域；對擬南芥與葡萄中MADS-box家族成員進(jìn)化樹的分析表明，該基因是MADS-box中SEP亞家族成員之一；根據(jù)sNCGGa所制定的葡萄基因命名系統(tǒng)，將該基因命名為VviSEP2；組織特異性表達(dá)分析結(jié)果顯示，該基因僅在葡萄的生殖器官(花蕾、花和胚珠)中特異表達(dá)，這與Reinheimer等[24]發(fā)現(xiàn)的SEP類似基因在多個禾本科植物中的表達(dá)模式相似，說明SEP基因在植物中的表達(dá)模式較為保守，同時也表明VviSEP2與葡萄生殖器官發(fā)育相關(guān)。

目前為止，對于SEP亞家族基因的研究多與花器官相關(guān)，而與種子發(fā)育關(guān)系的研究卻鮮有報道。2003年，F(xiàn)avaro等[29]發(fā)現(xiàn),將SEP基因突變后，擬南芥中胚珠的發(fā)育會受到影響，且突變體的表型與stk/shp1/shp2三突植株的表型有相似之處，且胚珠發(fā)育相關(guān)的AG蛋白必須在SEP存在的情況下才能與STK、SHP1和SHP2互相作用，AG蛋白可能與SEP以及STK、SHP1和SHP2中的一個形成轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體促進(jìn)胚珠發(fā)育，說明這些胚珠發(fā)育相關(guān)基因功能的發(fā)揮離不開SEP亞家族基因的協(xié)助，SEP基因與胚珠發(fā)育相關(guān)。2007年，Brambilla等[30]在胚珠原基中發(fā)現(xiàn)一個與胚珠敗育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子BEL1，且BEL1的突變會加強stk/shp1/shp2三突植株的突變表型，但BEL1與胚珠發(fā)育相關(guān)的MADS-box蛋白復(fù)合體必須通過SEP轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)后才能互作，再次說明SEP亞家族基因參與植物胚珠的發(fā)育過程。Matias-Hernandez等[22]在2010年發(fā)現(xiàn)，VDD轉(zhuǎn)錄因子在種子發(fā)育早期發(fā)揮重要作用，而SEP3和STK可以形成胚珠發(fā)育相關(guān)的蛋白復(fù)合體并直接作用于靶基因VDD的啟動子區(qū)域，SEP3與種子的發(fā)育相關(guān)。本研究對VviSEP2在有核葡萄‘黑比諾’和無核葡萄‘無核白’胚珠發(fā)育過程中的表達(dá)模式進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該基因在‘黑比諾’中的相對表達(dá)水平在整個胚珠發(fā)育過程中都顯著高于‘無核白’，是‘無核白’相對表達(dá)水平的3～5倍，這表明VviSEP2基因與胚珠敗育型無核葡萄胚珠的敗育有一定關(guān)系。Mellway等[31]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子VviSEP2可以與VviAG3存在相互作用，而VviAG3是擬南芥中胚珠發(fā)育相關(guān)基因STK在葡萄中的直系同源基因。胚珠發(fā)育相關(guān)基因VviSEP2在‘無核白’胚珠中的低水平表達(dá)，可能會影響到葡萄胚珠發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的形成，從而導(dǎo)致胚珠敗育，當(dāng)然此假設(shè)還有待于進(jìn)一步研究證明。

本研究在‘無核白’葡萄中克隆得到一個無核白胚珠敗育相關(guān)基因VviSEP2，經(jīng)過序列分析發(fā)現(xiàn)該基因cDNA序列長度為1 132 bp，ORF為741 bp，編碼246個氨基酸。氨基酸多序列比對和進(jìn)化樹分析確認(rèn)該基因是E類MADS-box基因家族成員，具有MADS-box家族M和K保守結(jié)構(gòu)域。表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)該基因只在葡萄生殖器官表達(dá)，且在‘無核白’和‘黑比諾’胚珠發(fā)育過程中呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式，表明葡萄VviSEP2基因與無核葡萄胚敗育相關(guān)。